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B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究

2020-12-10阅读(515)

B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究

论文摘要

禽偏肺病毒（Avian Metapneumovrus,aMPV）的自然宿主是火鸡,其次是鸡。aMPV感染火鸡导致火鸡鼻气管炎（Turkey rhinotracheitis,TRT）,引起火鸡严重的呼吸道疾病。aMPV感染鸡导致鸡的肿头综合症（Swollen head syndrome,SHS）,单一感染时死亡率较低（5%10%）,但引起产蛋量下降（10%30%）,其更大的危害在于aMPV感染后,常继发其它细菌感染,引起严重的呼吸道症状,死亡率高达25%。目前,除大洋洲以外的世界各地均有该病的报道。我国首次在1999年分离到aMPV,随后流行病学调查表明,我国部分养殖场aMPV的感染率相当高,该病对我国养禽业的危害日益加重。由于aMPV分离非常困难,所以国内关于aMPV的分子生物学特征及致病性鲜有研究,不利于该病的有效防控。本研究将疑似肿头综合症的鸡的鼻甲骨和肺脏研磨后分别种于Vero细胞,盲传5代,观察到有一份接种鼻甲骨样品的Vero细胞变圆、聚堆形成合胞体,具有aMPV典型的细胞病变（CPE）特征,将其命名为LN16。电镜观察负染的LN16分离株的病毒粒子呈现多形性,直径约为50-200 nm,偶见直径为500 nm的病毒粒子,具有典型的副黏病毒的形态特征;亚型特异性的RTPCR检测结果显示,LN16分离株仅扩增出了B亚型特异性条带;进一步扩增和测定了LN16分离株的G基因序列,分析表明其G基因与B亚型aMPV的同源性均高于93.8%,而与A、C和D亚型aMPV的同源性都低于63.7%;进一步利用B亚型aMPV特异性的阳性血清进行间接免疫荧光实验,结果显示感染LN16的Vero细胞有特异性的绿色荧光信号。综合以上结果,表明LN16分离株为B亚型aMPV。为了解LN16分离株的分子特征,设计合成了7对引物测定其全基因组序列。测序结果显示,LN16分离株基因组全长为13,513 bp,编码9个蛋白。将其全基因组序列提交至GenBank（登陆号:MH745147）,该序列是第一个鸡源的B亚型aMPV的全基因组序列。与火鸡源B亚型aMPV分离株序列比较发现,LN16分离株的全基因组序列与火鸡源的同源性为97.6%,8个编码基因的同源性为95.1%-98.4%,相对保守,但基因间隔区出现碱基的插入和删除,存在明显差异。为了进一步评价LN16分离株对鸡的致病性,将LN16分别感染3、6、9和15周龄的SPF鸡。观察发现,感染后3-6 d的SPF鸡均出现流鼻涕、甩头、流眼泪及精神萎靡等临床症状,各组的发病率均在70%及以上;感染后2-5 d的SPF鸡出现排毒,第4 d排毒率最高,达到83.6%;感染后的2-5 d,在鼻甲骨、气管、喉头等上呼吸道组织中检测到病毒,偶尔也在免疫器官胸腺中检测到病毒;感染组SPF鸡的胸腺出血,鼻甲骨和肺脏出现炎症等病理变化。这些结果表明,LN16分离株对SPF鸡有明显的致病性。本研究成功地从发病鸡群中分离到一株B亚型aMPV,扩增获得首个鸡源B亚型aMPV的全基因组序列,该分离株对不同日龄的SPF鸡有明显的致病性,这些研究结果丰富了aMPV的流行病学资料,同时也为疫苗等防控产品的研制奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 禽偏肺病毒的病原学
  •     1.1.1 aMPV的分类
  •     1.1.2 aMPV的基因组成
  •     1.1.3 aMPV的理化特性
  •   1.2 禽偏肺病毒的流行病学
  •     1.2.1 aMPV的自然宿主及易感动物
  •     1.2.2 aMPV的传播途径及地理分布
  •     1.2.3 国内aMPV的流行情况
  •   1.3 禽偏肺病毒的分离培养
  •     1.3.1 样品的采集
  •     1.3.2 病毒的分离方法
  •   1.4 禽偏肺病毒的鉴定
  •     1.4.1 电子显微镜观察病毒粒子形态
  •     1.4.2 免疫荧光实验
  •     1.4.3 病毒中和实验
  •     1.4.4 ELISA检测
  •     1.4.5 RT-PCR
  •     1.4.6 套式RT-PCR
  •     1.4.7 荧光定量RT-PCR
  •   1.5 禽偏肺病毒的致病性
  •     1.5.1 aMPV的临床症状
  •     1.5.2 aMPV的病理变化
  •     1.5.3 排毒情况
  •     1.5.4 抗体水平检测
  •   1.6 禽偏肺病毒的防治
  •     1.6.1 aMPV的生物安全防治疗
  •     1.6.2 aMPV的疫苗保护
  •     1.6.3 aMPV的治疗
  •   1.7 本研究的目的及意义
  • 第二章 B亚型禽偏肺病毒的分离及鉴定
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 病料
  •     2.1.2 细胞、质粒及引物
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 主要实验仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 病料处理
  •     2.2.2 aMPV的分离
  •     2.2.3 RNA的提取
  •     2.2.4 RT-PCR
  •     2.2.5 aMPV分离株的电镜观察
  •     2.2.6 aMPV分离株的间接免疫荧光检测
  •     2.2.7 aMPV分离株的G基因的测序
  •     2.2.8 aMPV分离株的外源病毒检测
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 细胞病变
  •     2.3.2 LN16分离株的电镜观察
  •     2.3.3 LN16分离株亚型特异性RT-PCR鉴定
  •     2.3.4 LN16分离株G基因序列分析
  •     2.3.5 LN16分离株的间接免疫荧光鉴定
  •     2.3.6 其他外源病毒的检测
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 LN16分离株全基因组序列测定与分析
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 病毒
  •     3.1.2 主要实验试剂
  •     3.1.3 主要实验仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 LN16的全基因组测序
  •     3.2.2 LN16序列分析
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 LN16分离株全基因组测序
  •     3.3.2 LN16分离株全基因组序列分析
  •     3.3.3 LN16分离株与VCO3/60616序列比较
  •     3.3.4 关键位点比较分析
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 LN16分离株致病性研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 病毒及SPF鸡
  •     4.1.2 引物及探针
  •     4.1.3 主要实验试剂
  •     4.1.4 主要实验仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 实验计划
  •     4.2.2 排毒检测
  •     4.2.3 组织分布检测和病理损伤
  •     4.2.4 血清抗体ELISA检测
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 临床症状
  •     4.3.2 排毒情况
  •     4.3.3 抗体水平情况
  •     4.3.4 组织分布情况
  •     4.3.5 病理变化情况
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 于蒙蒙

    导师: 高玉龙

    关键词: 亚型禽偏肺病毒,肿头综合症,分离鉴定,致病性

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    基金: 十三五国家重点研发计划项目(2016YFE0203200),国家肉鸡产业技术体系(CARS-41-G15)

    分类号: S852.65

    总页数: 63

    文件大小: 2782K

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