王淳, 陈誉华[1]2003年在《大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白yijP的表达纯化和功能分析》文中指出在新生儿细菌性脑膜炎的病因中,大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是主要致病菌之一。E.coli经血行播散到脑,并穿过血脑屏障致病。但E.coli如何穿过血脑屏障其机理尚不清楚。迄今已克隆鉴定了一些大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因,如ompA,ibeA,ibeB和yijP等,但这些基因编码蛋白的功能仍不清楚。
王淳, 方文刚, 陈誉华[2]2005年在《大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白-yijP的表达纯化》文中研究说明目的:研究大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物在大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞中的作用,以期阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制。方法:应用PCR方法获取yijP基因C末端 1. 04kb片断(编码333个氨基酸),将其克隆到PQE载体并转化到受体菌M15,以构建出表达N 末端带有 6个组氨酸的yijP融合蛋白的工程菌。通过Ni NTAAgarose亲和层析法提纯yijP融合蛋白,初步分析该蛋白对人脑微血管内皮细胞 (HB -MEC)生长的影响。结果:成功获得了分子量为 41kd的yijP融合蛋白,并发现yijP蛋白对HBMEC有较强的细胞毒作用。结论:大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物 yijP蛋白可能是一种细胞毒因子。
王淳[3]2003年在《大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白yijP的表达纯化和功能分析》文中进行了进一步梳理研究背景目的 在新生儿细菌性脑膜炎的病因中，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是主要致病菌之一。E.coli经血行播散到脑，并穿过血脑屏障(BBB)致病。但大肠杆菌如何穿过BBB其机理尚不清楚。迄今已克隆鉴定了一些E.coli脑微血管内皮细胞(BMEC)侵袭基因，如ompA，ibeA，ibeB和yijP基因等，但这些基因编码蛋白的功能仍不清楚。 yijp基因，也称为f577或IBE23基因，其ORF为1734bp，推断的编码产物的分子量为66.6KD，该蛋白参与大肠杆菌侵袭BMEC的机制不清。本研究旨在表达和纯化yijP蛋白，并观察其对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)某些生物学特性的影响，以期为阐明E.coli穿过BBB的机制积累新资料。 研究方法 1．yijP融合蛋白的表达和提纯： ①应用受体菌M15(pREP4、pQE-yijP)表达氨基末端带有6个His·tag的yijP融合蛋白； ②通过亲和层析(Ni-NTA agarose)方法分离纯化yijP融合蛋白； ③透析法进行yijP融合蛋白的再折迭。 2．yijP蛋白质的功能分析： ①MTT实验检测yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)增殖的抑制作用； ②细胞计数法分析 yijP蛋白对 HBMEC的生长抑制作用； ③光学显微镜下观察HBMEC的形态变化； ④利用荧光显微镜观察细胞核的改变； ⑤流式细胞仪检测亚二倍体峰； ⑤琼脂糖凝胶电泳观察 DNA ladder； ①Western blotting方法检测 caspase－3的活性片段； ③采用t－检验进行统计学分析。 研究结果 1．6 X HIS·tag－yijP蛋白质的表达与提纯： 大量扩增M15bREPo囚－”）菌体纲胞。将IW’n诱导后 0一 h的细胞裂解物进行 SDS—PAGE分析，在 41 KD处可见一条逐渐增高的蛋白条带，这与推断的m·tag－九P融和蛋白分子量相符。蛋白经过Ni－NTA Agwtse亲和层析和再折迭3DS－PAGE分析表明亲和层析提纯与复性后的蛋白条带位置与细胞裂解物中的位置一致。 2．yijP蛋白质功能分析： o rs实验检测结果发现沟 蛋白可引起明显的细胞增殖抑制作用，yiP实验组与对照组存在统牌意义u＜0．05入并存在浓度依赖性。 雕统方法做细胞生长曲线，连续观察发现：从给药后的第16 h开始，＜liP组和对照组出现差异（P＜0．01X 44 h后 tjP组细胞几乎全部死亡。说明yijP蛋白对HBMEC的毒性作用存在时间依赖性。 udrnl yijP蛋白与 HBMEC孵育 16 h后，相差显微镜和荧光显微镜下细胞表现出凋亡特征。 ④流式细胞仪可在正常二倍体峰前检测出一个亚二倍体峰， ·2·同时 GO／Gl期细胞J期和 GZ／M期细胞所占比例下降。 ⑤DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带。 ⑤Western hi。ting可检测到一p。e－3的活性片段。 结 论 1．成功地表达并提纯了大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白yije。 2．对yijn蛋白功能分析表明，oe蛋白对体外培养的人脑微血管内皮细胞有较强的毒性作用，提示yijP的编码产物可能是一种毒素。 3．yiP蛋白的毒性效应可能在于诱导脑血管内皮细胞发生凋亡。
师震宇[4]2011年在《禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究》文中进行了进一步梳理禽的大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的细菌性疾病,对养禽业危害极大,同时具有公共卫生意义。新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis E. coli, NMEC)是导致新生儿脑膜炎主要病原菌之一,目前在NMEC的研究中,已确定ibeA、ibeB、yijP、aslA、ypdP和ompA等多个基因与其穿越血脑屏障有关。APEC和NMEC在基因组结构上很相似,且具有很多相同的毒力因子。侵袭并穿越血脑屏障是细菌导致脑膜炎的关键步骤,侵袭相关基因ibeB、yijP在APEC中广泛分布,显示其具有重要的公共卫生意义。根据已登陆GenBank的侵袭相关基因ibeB、yijP的序列,设计并合成两对引物,检测ibeB、yijP基因在100株不同来源、不同地区大肠杆菌中的分布,结果表明,所有菌株都含有ibeB、yijP基因。以APEC鸭源株DE205B株基因组为模板PCR扩增ibeB和yijP开放阅读框,连接pMD18-T载体后测序。将测序结果与GenBank中APEC O1、BL21(DE3)、CFT073、RS218、UT189、O157:H7菌株进行比对和进化树分析。结果显示,DE205B的ibeB、yijP基因与上述菌株有较高同源性,同源率在96.9%-100%之间。对不同菌株的ibeB和yijP基因进行进化树分析表明,DE205B与APEC O1、RS218、UT189同处于一个小进化分枝中,亲缘关系较近；与O157:H7、BL21(DE3)亲缘关系较远,与CFT073的亲缘关系介于前两个类群之间。将DE205B的ibeB和yijP基因全长序列定向克隆于经同样酶双酶切的pET-32a(+)中,转化表达宿主菌BL21 (DE3).经IPTG诱导可表达分子量约69.3kDa、83.4kDa的IbeB、YijP重组蛋白。超声破碎,裂解物作SDS-PAGE凝胶电泳,显示两个蛋白条带,均存在于包涵体。免疫转印结果显示,IbeB、YijP重组蛋白都能被DE205B全菌抗血清识别,表明二者具备免疫原性。蛋白经镍柱纯化、透析脱盐复性,分别免疫新西兰大白兔,获得效价较高的免疫血清。侵袭抑制试验证明,免疫血清能抑制DE205B对DF-1细胞的侵袭。为进一步研究ibeB基因的功能,利用Red重组系统构建DE205B ibeB基因缺失株及其互补株。对野生株、缺失株、互补株的生物学特性进行分析,结果显示,ibeB缺失株对小鼠及雏鸭的致病力低于野生株,且互补株的致病力高于缺失株,提示ibeB在APEC的致病过程中发挥一定作用。ibeB缺失株对DF-1细胞和脑组织的侵袭能力显着低于野生株(P<0.05),且互补株的侵袭能力显着高于缺失株(P<0.05),提示ibeB基因在APEC侵袭细胞并穿透血脑屏障过程中发挥一定作用。ibeB缺失株中ibeA基因的相对表达率低于野生株,且互补株中ibeB基因的相对表达率高于缺失株,提示ibeB基因可能通过调控ibeA基因的表达水平影响APEC的致病能力。
王淳, 方文刚, 陈誉华[5]2005年在《大肠杆菌yijP侵袭蛋白诱导人脑微血管内皮细胞凋亡》文中认为为研究大肠杆菌的脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的功能,将yijP基因(1.04kb)克隆到pQE30表达载体,构建表达产物为N末端带有6个组氨酸(His)序列的yijP汇合蛋白,以M15(pREP4)为受体菌,大量表达(His)6-yijP汇合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析纯化汇合蛋白,将经透析法复性的一定浓度的(His)6-yijP蛋白加入到体外培养的人脑微血管内皮细胞中,结果显示yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞有较强的细胞毒作用:在相差显微镜下可观察到细胞皱缩、胞膜呈泡状膨出,随着时间延长细胞逐渐脱落;荧光显微镜下可见细胞核呈现为致密团块状或圆形浓染颗粒状,呈凋亡样改变;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带;流式细胞仪显示在正常二倍体峰之前出现一个亚二倍体峰;Western印迹可检测到caspase-3的活性片段。这些现象均出现在yijP蛋白作用于人脑微血管内皮细胞的16h之后,提示在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,yijP蛋白可能起到诱导脑微血管内皮细胞迟发性凋亡的毒素作用。
惠长野[6]2010年在《大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T毒力相关功能研究》文中提出大肠杆菌是存在于人和许多动物肠道中的优势菌群,主要寄生在大肠内,属于肠道正常菌群成员之一,某些血清型菌株的致病性强,可引起腹泻等肠道内感染,另一类大肠杆菌在一定条件下可引起肠道外感染,称之为肠外致病性大肠杆菌,可引起泌尿系统感染,败血症和脑膜炎等。大肠杆菌是最常见的致新生儿脑膜炎的G菌,已经有超过100个K荚膜抗原被鉴定,但新生儿大肠杆菌脑膜炎分离株中,带有K1荚膜多糖的大肠杆菌株约占80%,这些分离株本身属于肠道的正常菌群并已知存在于产道。大多数新生儿和儿童的脑膜炎发病是血源性传播的结果,很多研究表明菌血症的水平与脑膜炎的发病相关。细菌的侵入起始于脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC),这是构成血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的主要组成细胞。前期的体外研究实验表明大肠杆菌体外穿越BBB而没改变BMEC单层的完整性。体内研究表明,脑膜炎的发病进展导致了BBB透过性的改变,并诱发脑膜炎,这种透过性的改变所涉及的机制可能是多因素的。越来越多的研究表明黏附和随后侵入BMEC涉及病原体和宿主多因子的参与,但又是两个相对独立的过程。随着BMEC体外模型及脑膜炎动物模型的建立,多个大肠杆菌K1株特异的菌体蛋白被鉴定,如IbeA, IbeB, IbeC, IbeT, YijP, CglD为侵入BMEC所需要的。一些大肠杆菌常见的菌体结构和蛋白也被证实与毒力有关,如荚膜、菌毛、外膜蛋白等。此外,S菌毛结合蛋白和IbeA的多个受体在BMEC表面也得到鉴定。大肠杆菌外膜蛋白T,是定位于大肠杆菌外膜的一种蛋白酶。OmpT在体外引起重组蛋白的降解而引起人们的注意,甚至是在高浓度尿素极端变性的情况下依旧保持活性,目前商品化的大肠杆菌表达宿主都是ompT缺陷型。虽然研究者很早就已将OmpT进行柱层析纯化,并对其基因进行克隆测序,但对其在体内的功能知之甚少。有研究表明ompT在脑膜炎致病株中的分布高达96%,远远高于其它典型的脑膜炎致病毒力基因。关于ompT在脑膜炎发病机制中的作用还不清楚,ompT是否参与介导菌体侵袭及相关毒力机制还有待研究。近年越来越多的研究表明,OmpT不仅具有蛋白酶活性,还可能与细菌感染相关,携带ompT基因在粪来源的大肠杆菌中十分常见,但流行病学分析表明尿路感染大肠杆菌分离株ompT基因的检测率更高,显着高于其它来源菌株。因此ompT是假定的尿路感染毒力因子,但一直缺少实验依据直接证实其与尿路感染发病相关。外膜蛋白作为大肠杆菌高度保守的蛋白家族,其在微生物感染中的作用越来越引起研究关注。虽然只有很少的OmpT天然底物被鉴定,但我们可以通过其降解重组表达蛋白的情况来推测其生理功能,可能包括分泌型蛋白,尤其是一些毒力蛋白的加工成熟及胞内外源蛋白的降解。OmpT活性结构域位于菌体外膜,优先识别并水解连续的碱性氨基酸残基形成的肽键,因而推测其在抵抗阳离子抗菌肽杀伤菌体细胞方面起着重要的作用,这些有利于侵入机体内的大肠杆菌更好的存活。已证实大肠杆菌外膜成分可以体外激活人血纤溶酶原,由于OmpT在结构及功能上与鼠疫耶尔森菌的外膜纤溶酶原激活剂Pla蛋白有着很高的同源性(47%),OmpT也被推测是一种纤溶酶原激活剂。与纤溶酶系统的作用有利于细胞外基质的降解、菌体扩散及向深部组织侵袭。OmpT作为一种多功能蛋白酶,推测应该以一种混合机制参与致病。一是通过发挥蛋白酶活性,参与毒力因子前体的加工,降解细胞分泌的抗菌肽等；二是通过激活纤溶酶原降解细胞外基质促进侵袭,这其实也与OmpT酶活相关；叁是可能与一些毒力基因的表达调控相关,这方面在霍乱弧菌中的研究较深入。本文为了研究ompT基因在大肠杆菌K1株感染中的毒力机制,利用染色体同源重组构建了大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因敲除株,人BMEC单层细胞体外BBB模型显示,ompT基因敲除导致大肠杆菌K1株体外黏附及侵袭BMEC能力降低,OmpT低表达水平质粒可以基本回补突变株黏附能力至野生株水平；OmpT的表达可增强菌株的细胞毒效应；血源扩散乳鼠脑膜炎动物实验证实,ompT基因敲除后菌株突破BBB的能力大大降低；OmpT体外功能研究表明,两步柱层析纯化得到的大肠杆菌K1株外膜蛋白组分可以激活人血纤溶酶原并呈一定量效关系；利用超滤结合阳离子交换层析制备了人尿来源抗菌肽,和野生株相比,ompT基因敲除株对尿阳离子抗菌肽的抵抗能力降低。一、大肠杆菌K1致病株ompT基因敲除及特性分析1、为了研究ompT基因在大肠杆菌致病中的毒力相关功能,构建ompT基因敲除株OTD3。以E44基因组为模板,通过OMT-S1和OMT-B1引物PCR扩增得到1.57 kb的片段FOT5,通过OMT-B2和OMT-X2引物PCR扩增得到1.27 kb的片段FOT3,两个DNA片段利用引物引入的BamH I位点连接得到2.84 kb的ompT基因中间缺失片段FOT53。利用SalⅠ及SacⅠ位点连入自杀载体pCVD442,构建重组自杀性质粒pCVT53, pCVT53转化入SM10λpir,与E44野生株接合转移,PCR筛选得到突变株并命名为OTD3,并测序验证基因缺失。2、K1株E44的ompT基因全长954bp,编码317个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽序列,BLAST表明与大肠杆菌K12株OmpT(P09169316氨基酸)有96.2%氨基酸序列同源性,两者仅在肽链C端有部分氨基酸序列存在差异,C末端并不参与构成酶活性中心及维持蛋白特定空间构象。将带有完整ORF的ompT基因序列插入质粒pUC13得到重组质粒pUCT。ompT基因处于lac_promoter的操控,用作回补实验载体。3、与E44相比,OTD3表现出了微弱的生长优势,E44及OTD3菌体的菌落形成能力并无显着差异。ompT的敲除并未影响大肠杆菌重要黏附素Ⅰ型菌毛的表达。总体上ompT敲除对K1株基本属性无显着影响,因而突变株适用于研究该基因对感染相关毒力的影响。4、鱼精蛋白是一类天然的阳离子抗菌肽,富含连续的Arg。我们考察了0、0.01、0.1和1 mg/ml的鱼精蛋白对E44生长的影响,高浓度鱼精蛋白直接杀灭菌体,低浓度范围内对菌体生长有抑制作用,且呈一定量效关系。与野生株E44相比,OTD3对0.1 mg/ml的鱼精蛋白敏感,引起生长抑制。同样的结果也在基因工程常用菌株BL21(DE3)、JM109及DH5α中得到证实,ompT+株对鱼精蛋白的杀菌活性表现出了更强的抵抗。鱼精蛋白是OmpT的底物,对其敏感性间接反映了OmpT的表达水平及质粒回补效果,在随后的侵袭相关研究中,利于对比OmpT的表达对侵袭各环节的影响。二、ompT基因敲除降低大肠杆菌K1株致病能力1、体外模型采用人BMEC单层细胞,实验前24 h,将BMEC铺至24孔板,待细胞汇合成单层后备用(约105细胞/孔)。待测细菌37℃静置培养24 h至稳定期,PBS适当稀释备用,以OD600估算菌浓,按感染倍数,即细菌数：细胞数约100：1接入待测菌,同时留样涂平板培养计数得确切菌浓。37℃孵育2h后,PBS清洗4次后裂解细胞并涂布LB平板计菌落数,此为黏附的细菌总数,并计算黏附率。侵袭组叁个复孔,与100μg/ml庆大霉素37℃孵育1h来杀死所有胞外细菌,PBS清洗4次,裂解细胞涂布LB平板计菌落数,即为胞内菌数,并计算侵袭率。与野生株E441、2和3h的黏附率相比,OTD3黏附BMEC单层细胞能力显着降低。庆大霉素保护实验结果表明,侵袭能力上也表现出了相应比例的降低,侵袭能力降低源于黏附能力的降低。OTD3转化入低OmpT表达水平的回补质粒pGEM-OmpT后,突变株黏附能力基本得到恢复,而OmpT高表达质粒pML19并不能回补突变株黏附能力。推测BMEC表面存在某种OmpT的底物,对其适度的水解利于菌体黏附过程。2、待测菌37℃静置培养24 h至稳定期,PBS适当稀释后,取约107细菌接入汇合的BMEC单层中,37℃孵育2,4和6h,取上清并测定LDH活性,LDH释放活性大小间接反映了细胞膜的受损程度。与ompT基因缺失株OTD3相比,野生株E44感染后4和6h的细胞毒效应更高。转化了pML19的OTD3,过表达的OmpT介导的细胞毒效应明显高于携带空载体pUC19的野生株E44。与空白对照相比,ompT的非致病株BL21(DE3)与BMEC孵育也可以引起轻微的细胞毒效应,转化了pML19后,BL21(DE3)/pML19的细胞毒效应大幅地提升。不同菌株的细胞毒效应反映了一个趋势,OmpT的表达量与LDH的释放即胞膜损伤正相关,某种程度上证明了BMEC胞膜表面存在着OmpT的作用底物。3、五日龄的乳鼠被接种同剂量的E44及OTD3,感染18h后,血样及CSF样本涂布LB平板计菌落数。接种ompT基因缺失株OTD3可以引起与野生株E44相似水平的菌血症,23只接种了OTD3的乳鼠只有7只发生脑膜炎(30%),而17只接种了野生株E44的乳鼠当中,12只CSF培养呈阳性,占了71%。ompT基因缺失显着降低了大肠杆菌K1株穿越BBB的能力,与前面BMEC单层培养的体外BBB模型结果相符,综合体内外实验结果,ompT乍为一种辅助毒力因子与菌体侵入BBB相关。叁、大肠杆菌K1株OmpT体外功能1、裂解E44菌体,膜组分沉淀经反复抽提粗纯化后上样至丝氨酸蛋白酶抑制剂亲合层析柱Benzamidine Sepharose Fast Flow, NaCl梯度洗脱,分段收集并电泳检测,按分子量判断外膜蛋白集中在200 mmol/L NaCl洗脱,此步亲和层析去掉绝大部分杂蛋白；再经SOURCE 30Q强阴离子交换层析进一步精纯,收集约180 mmol/L NaCl洗脱组分,得到较纯的外膜蛋白,主要由二个条带组成,为分子量集中在37 kDa的包括OmpT在内的大肠杆菌外膜组分,可用于随后的体外活性研究。2、S-2251生色发光底物法测定外膜蛋白对人血纤维蛋白溶酶原(plasminogen, Plg)的激活效应,激活产生的纤溶酶plasmin水解S-2251释放对硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm处有强吸收,pNA显色的深浅与激活剂的活性成正比。由于商品化Plg中,残存少量纤溶酶,所以对照组Plg的OD405也呈上升趋势。实验组加入高低两个浓度的E44膜组分,Plg被激活,曲线斜率呈上升趋势,表明Plg不断被激活,且与膜组分的加入量呈一定量效关系。而ompT敲除株OTD3制备的外膜组分不具有体外激活Plg的效应。利用相关毒力因子激活纤溶酶原是普遍存在的病原体突破宿主生理屏障、获取养分及逃避宿主防御机制的策略。3、采用1 kDa截留分子量的Pellicon超滤膜对尿液中全蛋白进行快速富集,随后采用50 kDa截留分子量的超滤膜按分子量进行分级分离,收集超穿组分即得MW<20 kDa的小分子尿蛋白,大分子量尿蛋白被截留。各步纯化组分均用BL21(DE3)作为测定菌株,琼脂糖扩散法测定抗菌活性。结果表明只有小分子尿蛋白组分表现出了明显的抗菌活性。弱阳离子交换CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到尿来源小分子阳离子肽。TSK G2000SWxl凝胶过滤HPLC分析各步分离组分的分子量分布,50 kDa超穿组分分子量呈多峰分布,经过阳离子交换层析后,得到了分子量分布呈单峰的洗脱组分,50 kDa超滤与阳离子交换层析两步即可制备分子量分布均一的尿来源阳离子肽类,代表了正常尿液中存在的抗菌肽类,随后考察了OmpT是否赋予了大肠杆菌对尿抗菌肽的抵抗能力。4、ompT阳性株表现出更强的抵抗尿抗菌肽杀菌活性的能力。培养过程中加入尿阳离子肽,K1株E44表现出了对抗菌肽更强的抵抗能力,生长速率高于其ompT基因缺失株OTD3, ompT基因的敲除,降低了OTD3抵抗尿抗菌肽的能力。同时我们考察了基因工程常用菌株BL21(DE3)(ompT突变)和DH5α(ompT阳性)的尿来源抗菌肽的敏感性。20μg/ml的尿抗菌肽加入后,BL21(DE3)的生长被完全抑制,甚至被杀灭。pML19回补后,过表达的OmpT抑制了BL21(DE3)/pML19生长的同时,也增强了其对尿阳离子肽的抵抗,但却没有达到DH5α对尿抗菌肽的抵抗能力。结果表明OmpT参与了尿来源阳离子肽类的水解失活。机体各组织细胞尤其是上皮细胞、吞噬细胞等都维持一定水平的抗菌肽表达,在炎症及感染发生时,抗菌肽表达水平会被迅速上调并持续高水平分泌,构成固有免疫的防御系统重要组成部分。病原体会通过各种途径实现对宿主抗菌肽杀菌活性的抵抗,来利于其完成黏附、侵袭过程,并在宿主体内成功存活而导致感染。
张可[7]2010年在《新生儿脑膜炎大肠杆菌毒力岛基因GimA的功能研究》文中研究表明目的新生儿细菌性脑膜炎是儿科严重感染性疾病之一,临床上尽管可以选用相应的抗生素治疗,但是病死率仍然得不到显着的改善。幸存者常伴有失听、失明、癫痫、智力和运动障碍后遗症。因此,探讨有效的新生儿细菌性脑膜炎的防治策略具有重要意义。大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)是导致新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌。从脑膜炎患儿脑脊液中分离的大肠杆菌中,80%以上均带有K1荚膜。现已清楚,E.coli K1通过血行播散入脑而引起脑膜炎。但是,血液中的E.coli K1如何穿过主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)组成的血脑屏障(blood brain barrier, BBB),迄今尚不清楚。借助于体外分离培养的人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)单层——血脑屏障模型,学者们先后鉴定了E. coli Kl中的参与侵袭HBMECs相关基因,如fimH, ompA, ibeA, ibeB, CNF1等,并对参与E.coli K1侵袭相关的细胞内信号转导通路如PI3K、PKB、PKC、RhoGTPase以及FAK等细胞骨架组装调控信号分子等进行了探讨。但已鉴定的这些E. coli K1穿过BBB的“决定因子”,特别是每个E. coli K1侵袭基因介导细菌侵袭HBMECs的功能差异、联系、及详细机制尚有待进一步研究。我们在先前的研究中,从致新生儿脑膜炎E.coli K1株RS218(O18:K1:H7)中克隆鉴定了一个E.coli K1毒力岛基因GimA (genetic island of meningitic E.coli containing ibeA)(图1)。GimA全长20.3kb,仅存在于E.coli K1,其他非脑膜炎大肠杆菌中如E.coli K12均不含GimA序列。GimA含有四个操纵子,编码15个基因：(1)ptnIPKC (GimAl),包括ptnI、ptnP、ptnK、ptnC;(2)CglDTEC(GimA2),包括cglD、cglT、cglE、cglC;(3)GcxKRCI(GimA3),包括gcxK、gcxR、gcxC、gcxI; (4) IbeRAT(GimA4),包括ibeR、ibeA、ibeT。其中,ibeA基因的功能已得到初步研究,它在Kcoki K1侵袭HBMECs中起作用；其余14个基因的功能尚不清楚。GimA中推断的各基因编码蛋白与目前GeneBank库中功能已知蛋白之间的同源性高低程度分析结果提示：GimAl中ptnl与磷酸烯醇型丙酮酸磷酸化转移酶有很高的同源性；GimA2中cglD与甘油脱氢酶的同源性为62%;GimA3中gcxC与乙醛酸.醛连接酶的同源性高达67%;GimA4中含有E.coli K1侵袭HBMECs有关的ibeA,而其中的两个基因ibeT和ibeR尚未发现与其他蛋白有较高的同源性,鉴于这两个基因与ibeA同处于一个操纵子,故提示可能参与E.coli K1侵袭HBMECs.探讨这些基因在Ecoli Kl致脑膜炎中的作用,可以使我们更好的了解大肠杆菌性脑膜炎的发病机制。因此,我们选取了GimA2中的cglD基因和GimA4中的ibeT基因作为研究对象,展开了本工作。方法一、大肠杆菌毒力岛基因cglD的功能研究(一)细菌培养大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。(二)细胞培养HBMECs于含有10%FBS、10%Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO2、100%湿度的条件下培养。(叁)E44:△cglD基因缺失突变株的构建将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除cglD基因。(四)互补实验将cglD基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44:△cglD。(五)细菌黏附和侵袭试验1、细菌黏附试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；2、细菌侵袭试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。(六)半数致死量和生存分析Bliss法计算大肠杆菌对新生鼠的半数致死量；Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。(七)新生大鼠实验性细菌性脑膜炎模型的建立皮下注射一定浓度的细菌,建立新生大鼠菌血症模型,脑膜炎模型由血行播散而致。(八)脑脊液白细胞计数及蛋白和乳酸含量的测定血细胞计数板计数脑脊液白细胞,BCA蛋白定量法测定脑脊液蛋白含量,乳酸脱氢酶比色法测定脑脊液乳酸含量。(九)组织病理学分析新生大鼠脑切片经HE染色后,显微镜观察脑膜以及大脑皮层区中性粒细胞的浸润。(十)人多形核白细胞(PMNs)跨内皮迁移实验从人新鲜的外周血中分离PMNs,计数经大肠杆菌趋化后穿过HBMECs单层的PMNs。(十一)重组蛋白的表达和纯化利用BL21(DE3)表达含有cglD基因的重组质粒,用亲和层析法纯化融合蛋白。(十二)甘油脱氢酶活性分析比色法测定菌体裂解液和纯化蛋白的甘油脱氢酶活性。二、大肠杆菌毒力岛基因IbeT的功能研究(一)细菌培养大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。(二)细胞培养HBMECs于含有10%FBS、10%Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO2、100%湿度的条件下培养。(叁)E44:△ibeT基因缺失突变株的构建将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除ibeT基因。(四)互补实验将ibeT基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44：△ibeT。(五)细菌黏附和侵袭试验1、细菌黏附试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；2、细菌侵袭试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。(六)细菌在细胞内存活试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,在继续培养指定时间收集细胞内的细菌,结果用菌落数表示。(七)细菌生长曲线测定将细菌接种于一定体积的培养基中培养,测定大肠杆菌在不同时间点波长为600 nm时的吸光度值,绘制生长曲线。(八)免疫荧光实验激光共聚焦扫描显微镜进行观察。(九)透射电镜观察利用超薄切片机将包埋块切成70～80nm的超薄切片,经染色后,利用透射电子显微镜观察。(十)细菌缓冲容量测定通过测定细菌胞内和胞外总的缓冲容量和细菌胞外缓冲容量,计算得到细菌胞内缓冲容量。结果一、大肠杆菌毒力岛基因cgID在实验性新生儿脑膜炎中的作用1、E.coli Kl等位基因cglD缺失突变株的构建2、cglD基因缺失延长脑膜炎模型鼠的存活时间,但并不影响E.coliK1穿过血脑屏障3、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑脊液的改变4、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑膜和脑皮质区中性粒细胞的浸润5、CglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性二、毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解1、E.coli K1等位基因ibeT缺失突变株的构建2、E.coli K1 ibeT基因缺失影响E.coli K1侵袭HBMECs3、ibeT基因缺失抑制了E.coli K1在HBMECs中的生长4、ibeT基因缺失导致E.coli K1逃逸HBMECs溶酶体的能力发生缺陷5、ibeT基因有利于E.coli K1从ECV中逃逸入细胞浆6、敲除ibeT基因后的E44:△ibeT突变株菌体胞内的缓冲容量下降结论毒力岛基因cglD作为E.coli K1的毒力因子,有利于E.coli K1的体内毒力,参与脑膜炎的炎症反应,但与穿越血脑屏障无关,cglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性。毒力岛侵袭基因ibeT有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制。
王少辉[8]2011年在《禽致病性大肠杆菌DE205B黏附及侵袭相关因子的致病作用》文中研究说明大肠杆菌是哺乳动物和禽类肠道内正常菌群之一,大部分大肠杆菌没有致病性,然而少数大肠杆菌对人和动物具有致病性。根据毒力因子、发病机制及病变的不同,将致病性大肠杆菌分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E. Coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC)。肠道外致病性大肠杆菌主要属于大肠杆菌B2进化群,包括尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E. coli, UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis E. coli, NMEC)和禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic E. coli, APEC)。人的ExPEC能感染人,引起尿道感染和新生儿脑膜炎。另外APEC还可引起禽类的大肠杆菌病,对养禽业造成巨大的损失。APEC和NMEC在基因组结构上很相似,且具有很多相同的毒力因子,如P菌毛、Ⅰ型菌毛、荚膜、铁摄取系统、侵袭素IbeA等。越来越多的试验提示APEC是人ExPEC (NMEC和UPEC)的毒力基因的贮库。因此,加强对我国禽致病性大肠杆菌的长期监测和研究,对养禽业和公共卫生具有重要意义。尽管致病微生物的致病机理不同,但是大部分致病菌致病都利用黏附和侵袭机制穿透宿主细胞的屏障,从而逃避机体的清除。定殖是病原菌的致病力的关键,在细菌感染并引起疾病的早期发挥重要的作用。病原菌的黏附能力是细菌成功定殖的关键,黏附素是病原菌重要的毒力因子,通过结合相应的特异性受体将细菌定殖于宿主细胞表面,在黏附过程中发挥重要的作用。细菌定殖后开始大量繁殖,随血液循环进入各个组织器官。大部分病原菌需要穿透机体屏障,从而引起疾病,侵袭相关蛋白在细菌的侵袭过程中发挥重要作用。1.禽致病性大肠杆菌DE205B自分泌黏附素AatA的致病作用自分泌黏附素基因aatA是通过抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)方法鉴定的APEC新基因,尚待深入研究。本研究分析APEC自分泌黏附素基因aatA的序列及其在779株不同致病性大肠杆菌中的分布,并利用Red同源重组系统构建APEC DE205B的aatA基因缺失株和互补株。通过比较野生株、缺失株和互补株的致病力、体外和体内黏附能力、凝集性及毒力基因表达水平,阐述自分泌黏附素AatA在APEC致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,aatA开放阅读框为3498 bp,编码的自分泌黏附素AatA具有自分泌蛋白家族的特性,包括信号肽区、自分泌重复序列、膜外功能区和跨膜区。流行病学调查结果表明,aatA在大肠杆菌中的分布率为23.9%,且在致病性大肠杆菌及非致病性大肠杆菌中均有分布,可能是aatA通过其上下游插入序列及转移酶在不同菌株之间水平转移所致。aatA主要分布于禽类,在禽致病性大肠杆菌中的分布率最高(32.7%)。结合大肠杆菌进化群和多位点序列(MLST)分析,确定aatA主要存在于大肠杆菌D进化群和STC93、ST140、ST117菌株。构建的aatA基因缺失株和互补株具有较好的遗传稳定性,但缺失株生长能力稍低于野生株。凝集试验表明自分泌黏附素AatA有助于细菌的凝集及沉降,但是Ⅰ型菌毛可以抑制其凝集作用。黏附抑制试验结果表明,自分泌黏附素AatA及其免疫血清能够抑制APEC对DF-1细胞和HEp-2细胞的黏附。缺失株的体外及体内黏附能力低于野生株,且毒力基因表达水平下调,导致其对雏鸭及小鼠的致病力降低。而互补株的黏附能力、毒力基因表达水平及致病力都显着高于缺失株,提示自分泌黏附素AatA是APEC重要的毒力因子,介导APEC对细胞的黏附。2.禽致病性大肠杆菌DE205B侵袭素IbeA的致病作用侵袭素基因ibeA位于脑膜炎大肠杆菌毒力岛(Genetic Island of Meningitic E. coli containing ibeA, GimA),在NMEC穿透血脑屏障并引起脑膜炎过程中发挥重要作用,但在APEC致病过程中的具体作用尚不清楚。有必要分析APEC的侵袭素基因ibeA序列及分布,并阐述其在APEC致病过程中的作用机理。APEC DE205B侵袭素基因ibeA开放阅读框为1371 bp,与另外两株禽致病性大肠杆菌APEC_O1和BEN2908以及新生儿脑膜炎大肠杆菌IHE3034的同源性为100%,而与另外一株新生儿脑膜炎大肠杆菌RS218的同源性为99.3%,提示ibeA基因不存在大肠杆菌的致病型特异性。流行病学调查表明,20株APEC含有ibeA基因,分布率为4.30%,且主要分布于大肠杆菌B2进化群。体外侵袭试验结果显示,NMEC和APEC可侵袭鸡胚成纤维细胞DF-1,因此可采用DF-1细胞研究APEC的侵袭机理。利用Red同源重组系统构建APEC DE205B的侵袭素ibeA基因缺失株,ibeA基因缺失株和互补株有较好的遗传稳定性,且二者的生长速度没有明显差异,提示ibeA与APEC的生长繁殖无关。ibeA缺失株的体内及体外侵袭能力显着低于野生株,且互补株的侵袭能力恢复到野生株水平。另外,ibeA的表达使大肠杆菌AAEC189获得了侵袭能力,并且侵袭素IbeA及其免疫血清能够抑制APEC对DF-1细胞的侵袭,提示侵袭素IbeA在APEC侵袭细胞并穿透血脑屏障过程中发挥作用。缺失株的黏附及侵袭相关毒力基因的表达水平下调,可能导致APEC侵袭能力及致病力的降低。生物被膜试验表明,侵袭素IbeA有助于APEC形成生物被膜,可能与细菌的致病力及生存有关。3.禽致病性大肠杆菌DE205B自分泌黏附素基因aatA和侵袭素基因ibeA双基因缺失株的生物特性分析黏附素和侵袭素在APEC黏附、侵袭并穿透血脑屏障过程中发挥重要作用,构建黏附素基因aatA和侵袭素基因ibeA双基因缺失株,研究其生物学特性,为弱毒疫苗的开发提供基础。利用Red同源重组系统,构建aatA缺失株,并成功将抗性基因去除,然后在单基因缺失株的基础上构建aatA和ibeA双基因缺失株。生物特性分析结果表明,双基因缺失株与野生株的生长速度没有明显差异,但双基因缺失株DF-1细胞的黏附及侵袭能力显着低于野生株,分别为野生株黏附率及侵袭率的59%、42%。体内感染试验结果表明双基因缺失株在血液、脑、肺、肝和脾的黏附及侵袭能力分别为野生株的37.2%、10.5%、23.6%、16.1%和63.1%。双基因缺失株在体内及体外黏附侵袭能力低于单基因缺失株,提示aatA、ibeA两个基因通过不同的信号通路发挥作用。致病性试验结果表明,双基因缺失株的致病力明显低于野生株,且低于单基因缺失株,提示其有可能作为弱毒疫苗的候选毒株。4.禽致病性大肠杆菌DE205B毒力岛GimA调控蛋白IbeR的致病作用ibeR基因位于脑膜炎大肠杆菌毒力岛GimA,但在NMEC和APEC致病过程中的作用尚不清楚。分析APEC DE205B的ibeR序列及在APEC中的分布,并比较ibeR基因缺失株、互补株与野生株的生物学特性,从而阐述调控基因ibeR在APEC致病过程中的作用。结果表明,APEC DE205B调控基因ibeR开放阅读框为1950 bp,与其他大肠杆菌的同源性为99-100%。流行病学调查结果表明,4.3%(20/467)APEC中国分离株含有ibeR基因,且主要为大肠杆菌B2进化群,ibeR与其下游基因ibeA在APEC中的分布完全相同。体外及体内侵袭试验结果表明,缺失株的侵袭能力明显低于野生株,可能导致APEC致病力下降,提示调控蛋白IbeR参与APEC对宿主细胞的侵袭。
参考文献：
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[4]. 禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究[D]. 师震宇. 南京农业大学. 2011
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[6]. 大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T毒力相关功能研究[D]. 惠长野. 南方医科大学. 2010
[7]. 新生儿脑膜炎大肠杆菌毒力岛基因GimA的功能研究[D]. 张可. 中国医科大学. 2010
[8]. 禽致病性大肠杆菌DE205B黏附及侵袭相关因子的致病作用[D]. 王少辉. 南京农业大学. 2011
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