表达猪Ⅲ型干扰素重组植物乳杆菌构建、表达及活性研究

论文摘要

Ⅲ型干扰素（IFN-λ）是一种新发现的能够抗病毒、抗增殖以及具有免疫调节等生物学活性的细胞因子。在抵御病原微生物侵害的同时,不会产生类似Ⅰ型IFN的一定程度血液及神经毒副作用,有望成为临床疗效高且副作用小的新型干扰素药物。我国于2017年首次合成出猪Ⅲ型干扰素[1],主要作用于黏膜上皮细胞,在肠道等黏膜组织抗病毒、抗细菌感染中起着非常重要的作用。乳酸菌是“公认安全”的,存在于人与动物体内的益生菌,有天然的抗菌、增强机体免疫力的作用。乳酸杆菌是唯一没有致病性的乳酸菌菌种,一些筛选过的植物乳酸杆菌能够直接口服,不仅对胃液中的强酸以及小肠内的胆盐有极强的耐受能力,并且能够定植在肠道内。因此,植物乳酸杆菌可被制作成为一种口服类活菌载体,分泌、递送目的蛋白,在增强机体免疫能力、刺激机体黏膜免疫应答反应的同时,对许多疾病进行靶向性治疗。为获得猪Ⅲ型干扰素λ1（pIFN-λ1）基因序列并对其进行表达验证及生物活性研究,本研究从猪肺巨噬细胞系CRL2845细胞总RNA中通过RT-PCR技术扩增出猪Ⅲ型干扰素λ1（pIFN-λ1）基因序列,对其进行遗传进化分析以及信号肽预测。同时将扩增获得的猪Ⅲ型干扰素λ1（pIFN-λ1）基因克隆至pMD-19T Simple载体以及pcDNA3.1真核表达载体,使用常规质粒的转化、筛选、提取及酶切鉴定方法,获得重组质粒p19T-pIFNλ1和重组质粒pcDNA-pIFNλ1。通过脂质体转染CRL2845细胞48h后,采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）、Western blot、间接免疫荧光（Indirect immunofluorescent assay,IFA）手段对pIFN-λ1的表达及胞内定位进行分析。通过qRT-PCR方法,对收集的转染细胞总RNA进行干扰素刺激基因ISG15和干扰素相关基因OAS1、PKR、IFITM3的表达进行分析。同时利用携带报告基因的重组痘病毒VTT-EGFP感染瞬时表达pIFNλ1的CRL2845细胞,通过流式细胞术分析pIFNλ1的抗痘病毒效果。结果显示,本研究成功从猪肺巨噬细胞系CRL2845中获得pIFNλ1基因,并在CRL2845细胞内成功表达,且瞬时表达后能诱导干扰素相关基因OAS1、ISG1的表达,并对痘苗病毒感染CRL2845细胞具有抑制作用,抑制率为38%。结果表明,瞬时表达pIFNλ1可以选择性诱导干扰素相关基因的表达,同时具有抗病毒活性。为获得一株能够在植物乳杆菌LP18中表达pIFN-λ1蛋白的重组乳杆菌,本研究利用Trizol总RNA抽提试剂盒对植物乳杆菌LP18进行基因组提取,通过PCR手段从植物乳杆菌LP18基因组中扩增出1320信号肽基因序列。以从猪肺泡巨噬细胞系CRL2845细胞中扩增获得的pIFN-λ1为模板,通过PCR、融合PCR技术,获得含有靶向肽M及His标签的扩增产物1320-λ1-MH。使用双酶切手段酶切质粒pSIP411,回收载体片段后通过无缝克隆技术将扩增产物1320-λ1-MH与载体片段连接,获得重组质粒pSIP-1320-λ1-MH。通过电转化技术,使用乳酸乳球菌NZ3900作为中间宿主,将重组质粒pSIP-1320-λ1-MH电转进入植物乳杆菌LP18中,对阳性克隆进行筛选后,通过Western blot手段对pIFN-X1蛋白的表达进行分析。同时利用原核表达系统优化策略,从诱导温度,诱导时间、诱导浓度及重组菌传代次数这四个方面对pIFN-λ1蛋白的表达进行优化。结果显示,本研究成功从植物乳杆菌LP18基因组中扩增获得1320信号肽基因序列;通过融合PCR、无缝克隆技术成功获重组质粒pSIP-1320-λ1-MH;成功获得一株能够顺利表达pIFN-λ1蛋白的重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1;同时获得优化表达条件为:37℃、100ng/mL诱导剂条件下培养12h可获得pIFN-λ1蛋白最佳表达量,为体内活性实验奠定基础。为了研究重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1在动物体内的生物活性功能,本研究通过构建小鼠肠炎沙门氏菌灌胃致死模型,将120只小鼠分为预防组与治疗组,每组设6个小组,每个小组10只小鼠。利用生物统计学及流式细胞术,通过对小鼠的体表毛发情况、精神状态、体重、采食量、细菌体内分布情况及死亡率进行分析,验证重组乳酸杆菌LP18-pIFNλ1的体内活性,对重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1的预防和治疗效果进行评价。结果显示,预防组中,重组菌植物乳杆菌LP18-pIFNλ1预防组小鼠的死亡率为70%,其他组死亡率均为100%;治疗组中,所有组小鼠死亡率均为100%,原因可能是因为肠壁结构受损,导致重组菌无法定植,从而没有治疗效果。重组菌植物乳杆菌LP18-pIFNλ1预防组能显著提高小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+双阳性细胞的数量（*P<0.05）,且显著高于LP18组和PBS对照组（*P<0.05）。结果表明,重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1具有体内抗肠炎沙门氏菌功能,且能够刺激小鼠机体产生细胞免疫应答。本研究成功构建出一株能够表达pIFN-λ1蛋白的重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1,并对其蛋白表达进行优化;同时进行体内实验,对重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1的体内生物活性功能进行了初步探究,为后续的深入研究奠定基础。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

第一篇文献综述

1.干扰素

1.1 干扰素（IFN）简述

1.2 干扰素的临床应用及副作用

1.3 Ⅲ型干扰素（IFN-λ）的优势

1.4 Ⅲ型干扰素IFN-λ1

2.乳酸菌

2.1 乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）简述

2.2 乳酸菌与胃肠道黏膜（GI）

2.3 乳酸菌载体

第二篇实验内容

第一章猪Ⅲ型干扰素pIFN-λ1扩增、克隆及功能分析

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 pIFN-λ1基因的扩增、克隆及鉴定

2.2 pIFN-λ1基因遗传进化及信号肽分析

2.3 重组质粒pcDNA-pIFN-λ1鉴定

2.4 pIFNλ1在CRL2845细胞中的表达鉴定

2.5 pIFNλ1调节干扰素相关基因的转录

2.6 pIFN-λ1限制重组痘苗病毒感染

3.讨论

第二章表达pIFN-λ1重组植物乳杆菌构建及表达

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 植物乳杆菌LP18基因组提取及鉴定

2.2 SIP-1320扩增产物鉴定

2.3 λ1-MH扩增产物鉴定

2.4 融合PCR扩增产物鉴定

2.5 载体pSIP411双酶切、重组质粒pSIP-1320-IFNλ1-MH提取鉴定

2.6 重组乳酸菌LP18目的蛋白验证结果

3.讨论

3.1 信号肽1320的使用

3.2 靶向肽M的序列及使用

第三章重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1目的蛋白表达的优化

1.材料与方法

1.1 材料

1.2.方法

2.结果

2.1 不同诱导浓度、诱导温度对重组植物乳杆菌蛋白表达量的影响

2.2 不同诱导时间对重组植物乳杆菌蛋白表达量的影响

2.3 不同传代次数对重组植物乳杆菌蛋白表达量的影响

3.讨论

3.1 乳酸乳球菌NZ3900的选择及载体构建

3.2 目的蛋白的表达及载体优化

第四章重组植物乳杆菌LP18-pIFNλ1抗细菌感染研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.2.方法

2 结果

2.1 体表毛发、精神状态、体重、采食量

2.2 剖检观察及细菌体内分布情况检测

+CD4⁺、CD3⁺CD8⁺双阳性细胞数量的影响'> 2.3 重组菌LP18-pIFNλ1、LP18对预防组小鼠脾脏CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺双阳性细胞数量的影响

2.4 重组乳酸杆菌LP18-pIFNλ1的预防与治疗效果

3.讨论

全文小结

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马彬尧

导师: 朱国强,金宁一

关键词: 猪型干扰素,植物乳酸杆菌,重组植物乳杆菌,优化表达,肠炎沙门氏菌

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划(编号2017YFD0501000),国家自然科学基金(编号31802224)

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000408

总页数: 80

文件大小: 5397K

下载量: 77

表达猪Ⅲ型干扰素重组植物乳杆菌构建、表达及活性研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢