楚雄州人民医院云南楚雄675000
摘要：目的：本文对抑癌基因PTEN、BRCA-1在卵巢癌中的表达情况进行研究，探讨其在卵巢癌的发生中的作用。方法：应用RT-PCR法检测正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌组织中PTEN、BRCA-1的表达。结果：PTEN在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌中的阳性表达率分别为100%（10/10）、90%（9/10）、50%（5/10）；BRCA-1在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌中的阳性表达率分别为100%（10/10）、100%（10/10）、60%（6/10）。结论：本实验从基因水平上表明PTEN和BRCA-1在卵巢癌的阳性表达率低于正常卵巢、良性卵巢肿瘤，提示了PTEN和BRCA-1可能抑制了卵巢癌的发生。
关键词：卵巢癌逆转录-聚合酶链反应；第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因；乳腺癌卵巢癌易感基因
卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，其发病率位于妇科恶性肿瘤第3位，但其死亡率居女性妇科恶性肿瘤第一位[1]。由于卵巢癌的早期症状不典型或无明显症状，这使得卵巢癌的早期诊断率低。长期以来，组织病理学和细胞病理学分析无疑仍为肿瘤诊断的金标准，但卵巢癌相关基因的深入研究对于判断卵巢癌的生物学行为，提高卵巢癌的早期诊断，判断预后及指导治疗具有重要意义。本文通过RT-PCR法检测PTEN、BRCA-1基因在卵巢癌中的表达情况，为发现新的卵巢癌肿瘤标志物、提高卵巢癌早期诊断率的研究积累经验。
1材料与方法
1.1研究对象
收集昆明医学院第二附属医院及昆明医学院第三附属医院（肿瘤医院）2010年住院手术病理证实的新鲜卵巢组织标本共30例。其中卵巢癌10例；卵巢良性肿瘤10例；因子宫肌瘤行全子宫及双附件切除术并经病理证实的正常卵巢组织10例。所有标本切除后立即置液氮中保存备用。
1.2方法
①组织样品采集②组织中总RNA的提取：采取Trizol（异硫氰酸胍）法提取组织总RNA③总RNA的鉴定④除去RNA中的基因组DNA⑤纯化后的RNA质量检测和定量⑥逆转录成cDNA⑦PCR扩增反应⑧PCR产物琼脂糖凝胶电泳
注：引物序列
PTEN
Human-PTEN–f5'CATAACGATGGCTGTGGT3'
Human-PTEN–r5'GGCAGGTAGAAGGCAACT3'
扩增片段：146bp
BRCA-1
Human-BRCA-1-f69745'CCTTTGCTCCCTGTTGCTG3'
Human-BRCA-1-r72075'TGGAAGTGTTTGCTACCAAGTT3'
扩增片段：234bp
GAPDH
Human-GAPDH–f11335'GCAAGAGCACAAGAGGAAGAGA3'
Human-GAPDH–r13105'GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT3'
扩增片段：178bp
引物设计时，首先从Genebank中找出目的基因的mRNA序列，然后由PrimerPremier5软件辅助设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3统计学处理
采用SPSS16.0软件进行数据处理，表达阳性率的组间差异显著性检验采用X2检验（P<0.05有统计学意义）。
2结果
2.1组织RNA的电泳鉴定
提取组织总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的18s、28s条带，而且条带间无弥散，证明提取的组织总RNA没有降解，有较好的完整性。
2.2PTEN基因在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌中的表达
PTEN基因在正常卵巢组织中均表达100%（10/10）；良性卵巢肿瘤的阳性表达率为90%（9/10）；卵巢癌中的阳性表达率为50%（5/10）。PTEN基因的阳性表达率在卵巢癌中低于正常卵巢组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；PTEN基因的阳性表达率在卵巢癌中低于良性卵巢肿瘤，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表）
2.3BRCA-1基因在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌中的表达
BRCA-1基因在正常卵巢组织中均表达100%（10/10）；良性卵巢肿瘤的阳性表达率为100%（10/10）；卵巢癌中的阳性表达率为60%（6/10）。BRCA-1基因的阳性表达率在卵巢癌中低于正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表）
附表
注：PTENmRNA卵巢癌与正常卵巢组织比较：?2=6.667，P=0.010（P<0.05）；PTENmRNA卵巢癌与良性卵巢肿瘤比较：?2=3.810，P=0.051（P<0.05）；PTENmRNA正常卵巢组织与良性卵巢肿瘤比较：?2=1.053，P=0.305（P>0.05）；BRCA-1mRNA卵巢癌与正常卵巢组织比较：?2=5.000，P=0.025（P<0.05）；BRCA-1mRNA卵巢癌与良性卵巢肿瘤比较：?2=5.000，P=0.025（P<0.05）
3讨论
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器常见的三个恶性肿瘤之一，目前虽然用于检测卵巢癌的标记物已有多种，但敏感性和特异性都有一定的局限性，因此，寻找敏感和特异的肿瘤标记物成为妇科学界的研究热点。
第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen，PTEN），又称作多种进展期癌中发生突变的基因（mutatedinmultipleadvancedcancers，MMAC-1）。PTEN基因是1997年Li等[2]发现的一种新的肿瘤抑制基因。其编码的蛋白在胞浆中表现出双重特异性磷酸酶活性，是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因[3]。本研究结果显示，PTEN的阳性表达率在卵巢癌中低于正常卵巢组织，差异有统计学意义，PTEN的阳性表达率在卵巢癌中低于良性卵巢肿瘤，差异无统计学意义。PTEN在卵巢癌和良性卵巢肿瘤中的表达差异无统计学意义，可能与样本数少有关。PTEN基因在卵巢癌中表达降低，为PTEN基因可能作为卵巢癌的潜在分子靶点治疗提供了实验依据。
乳腺癌卵巢癌易感基因（breast/ovariancancersusceptibilitygene，BRCA-1），1990年Hall等[4]用连锁方法发现BRCA-1。1994年Miki等[5]成功地将该基因分离和克隆，BRCA-1基因被认为是一个经典抑癌基因，呈常染色体显性遗传。正常BRCA-1基因编码BRCA-1蛋白，对肿瘤的生长起负调节作用。本研究结果显示，BRCA-1基因的阳性表达率在卵巢癌中均低于正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤，其差异均有统计学意义。目前国外研究表明BRCA-1基因与遗传性卵巢癌的关系密切，但与散发性卵巢癌的关系尚不清楚，而国内外有关这方面的研究结论亦有争议。本实验研究的10例卵巢癌患者均无血缘关系，可能为散发性卵巢癌患者。本研究结果初步证实了，BRCA-1在散发性卵巢癌中可能存在基因突变，并且可能在散发性卵巢癌的发生中起作用。
综上所述，本实验通过采用RT-PCR法在mRNA水平检测抑癌基因PTEN、BRCA-1在卵巢癌中的表达情况，提示了它们可能在卵巢癌发生中发挥着重要的作用，为探讨卵巢癌的发生机制、预后判断及基因治疗的靶点提供了一定的实验依据，为进一步发现新的卵巢肿瘤标志物及卵巢癌早期诊断的研究积累了一定的经验。
参考文献：
[1]连利娟，曹冬焱.卵巢肿瘤的分类与分期[A].见：连利娟，主编.林巧稚妇科肿瘤学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2006：505-511
[2]LiJ，YenC，LiawD，etal.PTEN，aputativeproteintyrosinephosphatasegenemutatedinhumanbrain，breast，andprostatecancer[J].Science，1997，275（5308）：1943-1947
[3]JiangBH，ZhengJZ，AokiM，etal.Phosphatidylinositol3-kinasesignalingmediatesangiogenesisandexpressionofvascularendothelialgrowthfactorinendothelialcells[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97（4）：1749-1753
[4]HallJM，LeeMK，NewmanB，etal.Linkageofearly-onsetfamilialbreastcancertochromosome17q21[J].Science，1990，250（4988）：1684-1689
[5]MikiY，SwensenJ，Shattuck-EdiensD，etal.AstrongcandidateforthebreastandovariancancersusceptibilygeneBRCA-1[J].Science，1994，266（5182）：66-71