副溶血性弧菌在模拟消化过程中变化的初步研究

论文摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为一种常见的食源性致病菌,是沿海地区夏秋季引发食物中毒的重要病原菌之一,能引起发烧、呕吐、腹泻及流产等症状,严重的可导致原发性败血症甚至致人死亡,对食品安全和公众健康构成了极大的威胁。对副溶血性弧菌致病机理的揭示一直是人们关注的焦点,其有助于揭示其导致人体患病的根本原因,从源头上遏制了副溶血性弧菌的患病风险,但对副溶血性弧菌在达到肠道引起致病前,如何通过人体消化道等过程的描述尚属空白。模拟消化液“黄金”标准配方及人工模拟消化道模型的应用,有助于监测副溶血性弧菌在人体消化道中的命运变化,可提供一种全新的视角,进一步探明该菌的致病机理,在其相关疾病的诊断、治疗、新药物的研发中发挥巨大的作用。因此,为清楚了解副溶血性弧菌在人体消化道中的命运变化,本文进行了如下的研究工作:（1）副溶血性弧菌在三种模拟消化液中的命运变化;（2）人工模拟静态消化模型中副溶血性弧菌的命运变化;（3）胃酸的变化和副溶的逃逸。本研究的主要研究内容和研究结果如下:1.副溶血性弧菌在三种模拟消化液中的命运变化探究分析了上海市不同来源副溶血性弧菌在三种模拟消化液中的存活率、形态变化、异质性及基因表达的变化,为副溶血性弧菌致病机理的研究提供数据基础。利用Minekus的标准化配方,通过传统平板涂布方法,对上海市60株不同来源的副溶血性弧菌（28株临床菌株、30株食品源菌株及2株ATCC标准菌株）进行在三种模拟消化液中的存活率监测,对其异质性进行相关分析,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察了该菌在三种模拟消化液形态变化,进一步利用荧光定量PCR技术揭示副溶血性弧菌在三种模拟消化液中的毒力基因相对表达变化。结果显示唾液对副溶血性弧菌无明显影响,不具备杀菌作用;副溶血性弧菌在胃液（pH=2.0/3.0）中不能存活,细胞的显微结构受到严重损伤,当胃液酸碱度增加到4.0时,细菌存活率为54.70±1.11%,致病菌株在胃液中的存活能力高于非致病菌株,临床来源菌株的存活能力高于环境来源菌株。肠液的杀菌效果低于胃液。基因表达结果显示肠液处理后的毒力相关基因表达明显高于唾液和胃液处理。本研究首次系统地比较了食品与临床分离的致病性与非致病性副溶血性弧菌在模拟消化液中的存活,形态变化,异质性及毒力基因表达,初步分析了人体消化道对该菌的主要杀菌部位,及该菌在人体消化道的相关变化,对该菌的传播与控制提供了可靠的数据支持。2.人工模拟静态消化模型中副溶血性弧菌的命运变化本章在第二章的基础上,利用人工静态消化模型对上海市不同来源副溶血性弧菌在人体模拟消化过程中的存活率、形态变化、异质性及基因表达的变化进行了验证性研究。利用Minekus的体外连续静态消化模型,通过传统平板涂布方法,对上海市60株不同来源的副溶血性弧菌（28株临床菌株、30株食品源菌株及2株ATCC标准菌株）进行在消化过程的存活率监测,对其异质性进行相关分析,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察了该菌在消化过程中的形态变化,进一步利用荧光定量PCR技术揭示副溶血性弧菌在消化过程中的毒力基因相对表达变化。在人体消化过程中,唾液对副溶血性弧菌无明显影响,不具备杀菌作用;副溶血性弧菌在胃液中存活率低,细胞的显微结构受到严重损伤,这一发现与第二章的发现基本吻合,对副溶血性弧菌最有效的杀菌部位是人体胃,致病性（trh+trh+、trh+tdh-、tdh-trh+）和非致病性（trh-tdh-）菌株的存活率也存在显著差异。不同的是,在连续消化过程中,副溶血性弧菌存在VBNC现象,细菌通过胃液后,肠道的pH值约为7.0,再加上人体37°C的体温,为副溶血性弧菌提供了最佳的生长环境,副溶血性弧菌在肠液处理阶段,无论形态或者数量上都出现了“复苏”的现象。基因表达结果显示肠液处理后的毒力相关基因表达明显高于唾液和胃液处理。综上所述,本研究采用体外连续消化模型,验证了部分副溶血性弧菌能够通过口腔和pH较高的胃环境存活到肠道,在肠道内复苏,表达毒力相关基因。3.人工模拟动态消化模型中副溶血性弧菌的命运变化为了研究随着食物摄入,胃部pH的变化及副溶血性弧菌的逃逸,本研究将浓度为107CFU/g的副溶血性弧菌接种于三文鱼和南美白对虾中,运用体外人胃仿生原位消化系统进行消化模拟,经过120min后,测定食物排空率、胃部pH值变化及幽门排出食糜中副溶血性弧菌的存活情况。结果显示三文鱼的胃排空滞后时间为60min,南美白对虾为90min,模拟消化120min时,两种食糜均未完全排空。胃部的pH值为1.6±0.1,在食物摄入10min后大幅上升,随着胃酸的不断分泌及食物的消化分解,其pH开始下降,并保持在5.41左右。在食品消化120min进入肠道后,副溶血性弧菌并没有完全被胃酸杀灭,对虾中该菌的存活率为0.119±0.025%,而三文鱼中存活率为0.007±0.005%。综上所述,副溶血性弧菌可随食物基质的消化分解通过胃排空进入肠道,从而躲避胃酸的杀灭并导致人体患病。本研究初次运用了一种仿真模拟的动态人胃原位模拟系统,分析了食物摄入及致病菌的存活的相关关系,为理解副溶性弧菌的致病机理提供了一种新的思考方式,并为后期构建真实模拟消化模型提供了可靠的基础数据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王思琦

导师: 赵勇

关键词: 副溶血性弧菌,模拟消化液,致病机理,人工模拟消化道模型,毒力基因表达,异质性

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海海洋大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000314

总页数: 80

文件大小: 3960K

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