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碳酸酐酶异源表达及在微藻中CO2固定作用机制的研究

2020-12-02阅读(677)

碳酸酐酶异源表达及在微藻中CO2固定作用机制的研究

论文摘要

本文以雨生红球藻为研究对象,首先克隆嗜无机碳（Ci）微藻碳酸酐酶（CAs）,研究CAs水合CO2固碳效率,构建体外酶法固碳体系,增强CO2的固定;此外,构建微藻遗传体系,转外源CAs至雨生红球藻中,以期进一步强化Ci的利用;同时采用转录组学分析雨生红球藻碳代谢网络,为微藻综合固碳解决温室气体,生产高质产品奠定基础。具体结果如下:1.使用PCR扩增技术得到CAs DNA目的片段,构建pCold-CAs蛋白表达载体,转入BL21（DE3）中表达并优化诱导条件。结果表明:16°C、1 mM IPTG诱导24 h条件下可溶性融合目的蛋白质量达21.15 mg/L。将CAs蛋白用镍柱结合超滤离心管纯化,得到分子质量在110 kD左右的目的CAs蛋白,使用Xa因子蛋白酶（Factor Xa）去除His标签后获得单一的、高纯度的CAs,并进行质谱鉴定,确认该多肽序列为α-CA2。2.利用酸碱指示剂（溴百里酚蓝）法测得酶活为726.8 WAU,在此基础上构建CAs体外固碳体系,通过探索Tris、NaOH、KOH等3种碱液在不同温度、不同浓度NaCl溶液条件下对固碳效果的影响,结果显示100μg CAs在1 M Tris（pH 9.5）、45°C条件下固碳效果最好,固碳产生碳酸钙质量为21.00 mg,固碳效率可达商业Sigma-CAs效率的91.3%。利用水合反应检测CAs的稳定性,结果显示CAs在第7 d酶活保持较好达到90.95%,高于商业酶的77.61%。3.对雨生红球藻进行抗性筛选,确定30μg/mL博来霉素致死率100%。通过PCR扩增、酶切、酶连等手段构建含卡那霉素抗性基因的表达载体pCAMBIA1301-CAs,采用农杆菌侵染法将构建的载体转入藻细胞,成功获得9株阳性转化子。4.使用Ilumina Hi Seq TM 2000测序平台分析高碳培养下雨生红球藻碳代谢途径,结果显示CO2固定通路、糖酵解途径、脂肪酸及虾青素合成相关基因表达量显著增强,揭示了雨生红球藻中碳从CO2到次级代谢物合成网络,为微藻固碳生产高值产品提供理论支持。图41幅;表20个;参67篇。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 引言
  • 第1章 综述
  • 2捕集方法'>  1.1 CO2捕集方法
  •     1.1.1 吸收法
  •     1.1.2 吸附法
  •     1.1.3 膜法
  •     1.1.4 生物法
  •   1.2 碳酸酐酶
  •     1.2.1 碳酸酐酶简介
  •     1.2.2 碳酸酐酶的结构及催化机制
  • 2研究进展'>    1.2.3 碳酸酐酶捕集CO2研究进展
  •   1.3 藻类基因工程研究进展
  •     1.3.1 藻类基因工程简介
  •     1.3.2 微藻遗传转化研究进展
  •   1.4 雨生红球藻转录组学的研究进展
  •     1.4.1 雨生红球藻简介
  •     1.4.2 转录组学简介
  •     1.4.3 高通量测序技术在雨生红球藻转录组学的应用
  •   1.5 本论文研究内容及意义
  • 第2章 碳酸酐酶的克隆及异源表达
  •   2.1 材料与仪器
  •     2.1.1 藻种及培养方法
  •     2.1.2 仪器与试剂
  •     2.1.3 常用试剂的配置
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 目的片段的获取
  •     2.2.2 pCold-CAs表达载体的构建
  •     2.2.3 蛋白表达条件优化
  •     2.2.4 蛋白的纯化及鉴定
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 目的片段获取及鉴定
  •     2.3.2 阳性菌落鉴定
  •     2.3.3 诱导表达及条件优化
  •     2.3.4 蛋白的纯化
  •     2.3.5 蛋白的鉴定
  •   2.4 小结
  • 第3章 酶法固碳体系构建
  •   3.1 材料与仪器
  •     3.1.1 仪器及试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 酸碱指示剂法测CAs活性
  •     3.2.2 固碳系统构建
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 酸碱指示剂法测酶活
  •     3.3.2 不同条件对CAs固碳影响
  •   3.4 本章小结
  • 第4章 雨生红球藻遗传转化
  •   4.1 材料及试剂
  •     4.1.1 实验材料及试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 雨生红球藻抗性筛选
  •     4.2.2 pCAMBIA1301-CAs双元载体的构建
  •     4.2.3 农杆菌EHA105侵染雨生红球藻
  •     4.2.4 电镜观察被侵染雨生红球藻
  •     4.2.5 微藻转化子筛选
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 雨生红球藻对博来霉素的敏感性
  •     4.3.2 雨生红球藻遗传转化
  •   4.4 小结
  • 第5章 雨生红球藻碳代谢通路分析
  •   5.1 材料
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 基因功能注释及分类
  •     5.2.2 雨生红球藻碳代谢分析
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 Unigenes功能注释
  •     5.3.2 NR注释结果
  •     5.3.3 GO分类
  •     5.3.4 差异基因统计结果
  •     5.3.5 碳固定代谢途径分析
  •   5.4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 导师简介
  • 作者简介
  • 学位论文数据集

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 柴文静

    导师: 王巍杰

    关键词: 碳酸酐酶,雨生红球藻,遗传转化,碳代谢

    来源: 华北理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华北理工大学

    分类号: Q948

    总页数: 83

    文件大小: 2888K

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