用于间接免疫荧光检测的羊口疮病毒单抗杂交瘤细胞的筛选与鉴定

论文摘要

羊口疮（Orf）是一种急性、高度接触性传染病,对绵羊和山羊等小反刍经济动物健康养殖影响较大,引发该病的病原是羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）。常规ORFV检测方法,如间接ELISA、PCR、细胞培养技术等,在Orf的流行病学调研、病原特性和病毒鉴定等方面的研究中发挥了极其重要的作用,但难以满足对感染组织器官和细胞中的ORFV抗原进行定位和直观判断的试验目的。间接免疫荧光（IFA）可特异、直观地检出组织细胞上的病毒抗原,在细胞水平对抗原进行定位,因此获得理化性状均一,结合抗原特异性强的ORFV的单抗,对于病毒的实验室研究和诊断等深入探究具有重要的价值。本研究以羊口疮疑似组织病料为材料,采用PCR、细胞培养技术等,对临床样品进行了检测和ORFV分离鉴定;以接种了ORFV的牛睾丸上皮细胞为检测标本,未经亚克隆化的ORFV杂交瘤细胞为材料,采用有限稀释法、间接免疫荧光试验（IFA）,筛选分泌抗ORFV单抗的杂交瘤细胞,并对其进行鉴定。ORFV阳性山羊口唇部组织,制备冰冻组织切片,用经过鉴定的ORFV单抗进行IFA试验检测。本研究获得如下结果:1.从临床羊口疮疑似病料中分离出了一株羊口疮病毒地方毒株,该毒株可在牛睾丸上皮细胞大量增殖,F7细胞毒在牛睾丸上皮细胞的TCID50为10-6.39/100μL;2.优化IFA检测羊口疮病毒抗体的条件为103.70 TCID50 ORFV接种牛睾丸上皮细胞培养42 h,荧光素标记的二抗1:400稀释;3.利用IFA方法筛选获得了2株单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为C8和E8;4.C8分泌的单抗类型为IgG1,识别表位大小为100-130Ku;E8分泌的单抗类型为Ig2b,识别蛋白约为100ku;5.C8和E8杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体,均对ORFV感染的培养细胞的IFA呈现特异性阳性结果,其中C8的单克隆抗体对确诊Orf患羊的口唇部组织切片的IFA呈现特异性阳性结果。结论:1.成功分离了一株羊口疮病毒地方毒株;2.优化了IFA检测羊口疮病毒抗体的条件;3.获得了2株分泌抗ORFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株细胞分泌的单克隆抗体可用于病料组织中ORFV的IFA检测。

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摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章羊口疮研究进展

1.1 病原学及基因组

1.2 流行病学特征

1.3 病毒毒力因子与宿主免疫逃避

1.4 ORFV感染宿主的免疫应答

1.5 实验室诊断

1.5.1 显微镜检查

1.5.2 血清学检测

1.5.3 分子实验

1.6 羊口疮病毒单抗研究进展

1.7 本研究的目的及意义

试验研究

第二章羊口疮病毒凤翔株的分离和鉴定

2.1 材料

2.1.1 病料来源

2.1.2 细胞与菌株

2.1.3 主要试剂和材料

2.1.4 主要仪器

2.1.5 主要试剂的配置

2.2 方法

2.2.1 病料的处理

2.2.2 引物设计

2.2.3 DNA的提取

2.2.4 PCR检测

2.2.5 牛睾丸上皮细胞的培养

2.2.6 羊口疮病毒的接种

2.2.7 ORFV的鉴定

2.2.8 B2L基因序列分析与进化树的绘制

2.2.9 TCID50 的测定

2.3 结果

2.3.1 Orf疑似病料PCR检测结果

2.3.2 ORFV感染牛睾丸上皮细胞的病变观察

2.3.3 ORFV的 PCR检测结果

2.3.4 菌液PCR结果

2.3.5 PCR产物序列测定结果

2.3.6 B2L基因的系统发育分析

2.3.7 羊口疮病毒TCID50 测定结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章羊口疮病毒单抗杂交瘤细胞的IFA筛选与鉴定

3.1 材料

3.1.1 细胞株

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 试剂配制

3.2 方法

3.2.1 杂交瘤细胞的复苏与传代

3.2.2 间接免疫荧光法检测羊口疮病毒抗体方法的优化

3.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选

3.2.4 ORFV单克隆抗体类别鉴定

3.2.5 Western blot检测

3.2.6 组织冰冻切片的免疫荧光染色

3.3 结果

3.3.1 ORFV感染细胞培养样品的IFA检测时间优化结果

3.3.2 ORFV接种滴度优化结果

3.3.3 荧光二抗最适工作浓度优化结果

3.3.4 ORFV单抗阳性杂交瘤细胞的筛选结果

3.3.5 抗体类别鉴定结果

3.3.6 ORFV的纯化

3.3.7 Western blot鉴定

3.3.8 组织中羊口疮病毒的间接免疫荧光检测

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宁梦夏

导师: 陈德坤

关键词: 羊口疮病毒,牛睾丸上皮细胞,间接免疫荧光,单克隆抗体,组织冰冻切片

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 青海绵羊规模化养殖中主要疫病防控关键技术集成示范与推广(2018-NK-12) 咸阳市重大科技项目(2017K01-34)

分类号: S852.65

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用于间接免疫荧光检测的羊口疮病毒单抗杂交瘤细胞的筛选与鉴定

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