论文摘要
苏氨酸醛缩酶能够以磷酸-5’-吡哆醛（PLP）为辅因子,催化甘氨酸与各种芳香族和脂肪族醛发生醛醇缩合反应,产生含有两个手性立体中心的β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸是许多药物的有效成分的重要前体,广泛应用于制药及精细化工行业,具有非常高的应用价值。本研究从恶臭假胞菌（Pseudomonas putida KT2440）基因组中钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因（ltaE）,构建重组表达质粒pET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21（DE3）,获得重组菌E.col BL21（DE3）/pET-KT2440,研究LTA的酶学性质,对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。研究了野生型LTA与突变酶T206S生物合成对甲磺酰基苯基丝氨酸的反应条件。具体研究内容包括:（1）从P.putida KT2440基因组中PCR扩增获取ltaE基因,构建重组表达菌株E.coli BL21（DE3）/pET-KT2440。SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中高效表达,分子量为40 kDa左右,与理论值相符。优化IPTG诱导温度,结果表明重组表达菌株在25℃下高效可溶性表达。重组蛋白经过镍离子柱亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示单一条带。（2）研究了LTA的酶学性质。酶学性质研究结果表明LTA的最适反应温度为50℃,在低于45℃条件下温浴1 h后,其残余酶活力仍能保持在80%以上;最适反应pH为8.0,在温度低于45℃,pH 5.0-9.0时,重组酶较稳定;在最适温度和最适pH条件下,LTA酶的Km和kcat值分别为23.95 mmol.L-1和19216.6 s-1 mmol.L-1的二价金属离子研究结果表明Mg2+、Ca2+对LTA的酶活有明显的促进作用,Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对LTA的酶活有明显的抑制作用,而Mn2+对酶活稍有促进作用,Co2+对酶活稍有抑制作用;有机溶剂研究结果表明LTA在叔丁基甲基醚（TBME）溶剂中具有很好的耐受性,在TBME中振汤荡 h后仍保留90%以上的酶活,而在二甲基亚讽（DMSO）、无水乙醇（EtOH）、四氢呋喃（TF）、乙腈（CH3CN）中剩余不到20%的残余酶活性。（3）构建了突变菌株,并测定了突变酶的酶活性。以P.putw KT2440基因组中的ltaE为模版,构建5种突变菌株,SDS-PAGE显示这些位点的突变不影响在大肠杆菌中的表达,突变酶经过经过镍离子柱亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示单一条带。酶活测定结果表明207位的突变酶对L-苏氨酸裂解活性丧失或者几近失活,酶活仅为野生型的0.3-4.8%,说明Lys207对酶催化功能是必需的。而T206S对酶活大小几乎没有影响,圆二色谱研究结果表明野生型KT2440的变性温度（Tm）为49.2℃,而T206S突变酶的变性温度为53.7℃,相比于野生型LTA酶,变性温度提高了4.5℃,说明该位点与酶的温度稳定性密切相关。（4）确定了野生型LTA与突变酶T206S生物催化合成对甲磺酰基苯基丝氨酸的反应条件。野生型LTA最适温度为50℃,最适pH 8.0,反应3 h后产率达到41%,突变酶T206S最适温度55℃,最适pH 8.0,反应3 h后产率达到43%。野生型的LTA的光学纯度在温度30℃、pH 8.0时较高,而突变酶T206S的光学纯度在温度35℃、pH 8.0时相对较高,两者的光学纯度皆随着时间的延长而持续下降。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李利宏
导师: 张荣珍
关键词: 恶臭假单胞菌,低特异性苏氨酸醛缩酶,酶学性质,温度稳定性,手性合成
来源: 江南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,一般化学工业
单位: 江南大学
分类号: TQ925
总页数: 45
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标签：恶臭假单胞菌论文; 低特异性苏氨酸醛缩酶论文; 酶学性质论文; 温度稳定性论文; 手性合成论文;