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番茄lncRNA39042与PI100的克隆及其抗病作用

2020-12-02阅读(766)

番茄lncRNA39042与PI100的克隆及其抗病作用

论文摘要

番茄（Solanum lycopersicum）原产于南美洲,由于其果实营养丰富,具有特殊风味,在中国广泛栽培。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是发生在番茄上最严重的病害,为了防止降低产量,在分子水平上对此病进行防治尤为重要。植物体内起自我保护作用蛋白质的合成与积累,可直接抑制病原物的生长,这类抗性蛋白质如病程相关蛋白（Pathogenesis Related Protein,PR）,在其表达时,会受到长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的调控。lncRNA是一类长度大于200 nt,不具备编码蛋白能力的线型RNA片段,目前,已有研究揭示其与植物病害相关,但关于植物中影响PR-6即蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor,PI）功能相关的lncRNA未见报导。本研究围绕上述问题进行科学探究,具体过程和实验结果如下:首先,本研究筛选出晚疫病相关的SLPI100（S.lycopersicum Protease Inhibitor 100）及位于其反义链上的lncRNA39042,二者均存在于番茄10号染色体上且含有响应生物胁迫的启动子元件;从番茄叶片中分别克隆出lncRNA39042及SLPI100基因片段,长度为310 bp与285 bp,SLPI100的半衰期30 h、平均疏水性0.189、理论等电点9.38、相对分子量10.52 kD、为疏水性蛋白,具有PI功能结构域,属于马铃薯蛋白酶抑制剂I家族。其次,lncRNA39042及SLPI100分别在番茄的叶和根中表达量最高,推测其在抗土传病害和叶部病害过程中发挥重要功能;在致病疫霉菌的侵染下,二者的相对表达量呈现先升高后下降的趋势,表明其能够很好地响应致病疫霉的侵染;随后成功获得了lncRNA39042与SLPI100基因的克隆载体以及过表达载体;在通过体外sgRNA活性检测后,构建lncRNA39042的CRISPR-Cas9双靶点载体。最后,获得根癌农杆菌工程菌株,并分别建立番茄同源和烟草异源瞬时表达体系,与转化pBI121质粒的对照组相比,在过表达lncRNA39042和SLPI100基因的番茄叶片中,番茄呈现抗病表型,PR表达量显著升高,在烟草中呈现相似的趋势;而lncRNA39042的敲除番茄叶片中,番茄易感病,PR显著下调,表明lncRNA39042与SLPI100基因能够在番茄与致病疫霉互作的过程中发挥抗病作用。本研究通过生物信息学分析结合生物学实验的方法,初步探究了lncRNA39042与SLPI100基因在植物与病原物互作中的抗性,不仅为lncRNA与PI基因作用机制的研究奠定基础,同时为其他植物的抗病功能研究提供依据。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 文献综述
  •   1.1 番茄晚疫病的研究进展
  •     1.1.1 番茄与致病疫霉
  •     1.1.2 番茄晚疫病的研究现状
  •     1.1.3 番茄晚疫病的防治策略
  •   1.2 植物先天免疫系统与蛋白酶抑制剂的研究进展
  •     1.2.1 植物先天免疫系统
  •     1.2.2 植物免疫防御过程中的病程相关蛋白
  •     1.2.3 植物蛋白酶抑制剂
  •   1.3 植物lnc RNA的概述
  •     1.3.1 植物lnc RNA的结构及种类
  •     1.3.2 植物lnc RNA的作用方式
  •     1.3.3 植物lnc RNA的功能
  •   1.4 植物lnc RNA与基因功能的研究策略
  •     1.4.1 过量表达技术
  •     1.4.2 基因敲除技术
  •     1.4.3 CRISPR-Cas9基因敲除技术
  •   1.5 本研究的目的及意义
  • 2 lncRNA39042与SLPI100基因的筛选、克隆与生物信息学分析
  •   2.1 实验所用软件、材料及试剂
  •     2.1.1 实验所用软件
  •     2.1.2 实验材料及试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 lncRNA39042与SLPI100基因的筛选
  •     2.2.2 lncRNA39042与SLPI100基因的启动子元件分析
  •     2.2.3 番茄叶片基因组DNA的提取
  •     2.2.4 叶片的RNA提取与c DNA合成
  •     2.2.5 lncRNA39042与SLPI100的克隆
  •     2.2.6 SLPI100的理化性质、多序列比对、结构及亲疏水性分析
  •     2.2.7 SLPI100与Pin家族成员系统进化树的构建
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 lncRNA39042与SLPI100基因的序列信息
  •     2.3.2 lncRNA39042与SLPI100基因的启动子元件信息
  •     2.3.3 番茄叶片的基因组DNA
  •     2.3.4 番茄叶片的RNA
  •     2.3.5 lncRNA39042与SLPI100基因的克隆结果
  •     2.3.6 SLPI100的理化性质、多序列比对、结构及亲疏水性
  •     2.3.7 SLPI100与Pin家族成员进化关系
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 3 番茄lncRNA39042与SLPI100基因的表达特性及载体构建
  •   3.1 实验材料及试剂
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 实验试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 lncRNA39042与SLPI100的组织特异性分析
  •     3.2.2 致病疫霉侵染下lncRNA39042与SLPI100的表达特异性分析
  •     3.2.3 lncRNA39042与SLPI100过表达载体的构建
  •     3.2.4 lncRNA39042的CRISPR-Cas9双靶点载体的构建
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 lncRNA39042与SLPI100基因的组织特异性
  •     3.3.2 致病疫霉侵染下lncRNA39042与SLPI100基因的表达特异性
  •     3.3.3 lncRNA39042与SLPI100的植物过表达载体
  •     3.3.4 lncRNA39042的CRISPR-Cas9双靶点载体
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 4 lncRNA39042与SLPI100基因的功能分析
  •   4.1 实验材料与试剂
  •     4.1.1 实验材料
  •     4.1.2 实验试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 制备根癌农杆菌工程菌
  •     4.2.2 lncRNA39042与SLPI100基因在番茄中的同源瞬时表达
  •     4.2.3 lncRNA39042和SLPI100基因在烟草中的异源瞬时表达
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 鉴定的根癌农杆菌工程菌
  •     4.3.2 lncRNA39042和SLPI100基因在番茄中的同源瞬时表达检测
  •     4.3.3 lncRNA39042和SLPI100基因在番茄叶片中瞬时表达后的抗性
  •     4.3.4 番茄瞬时表达体系中致病疫霉处理下病程相关基因的表达特性
  •     4.3.5 在烟草中预测的lncRNA39042异源表达的最小自由能
  •     4.3.6 烟草中的异源瞬时表达特性
  •     4.3.7 烟草异源表达体系中致病疫霉处理下病程相关基因的表达特性
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录A 培养基配方
  • 附录B 论文中所用质粒图谱
  • 附录C lncRNA39042和SLPI100基因序列
  • 附录D 四种茄科植物蛋白酶抑制剂的序列
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马宁

    导师: 栾雨时

    关键词: 番茄,致病疫霉,基因

    来源: 大连理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 大连理工大学

    基金: 国家自然基金31872116

    分类号: S641.2;Q943.2

    DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2019.000351

    总页数: 79

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