基因Ⅱ型、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的构建及免疫效果评价

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的急性、烈性、高度接触性传染病,在易感家禽中死亡率高达100%,对世界各地的养禽业和贸易往来造成严重经济损失,是世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）必报动物疫病之一,也是我国重点防控的一类疫病。近年来,我国按照国家总体部署,防控力度加大,疫情发病率总体维持在较低水平。但控制和根除ND绝非易事,尤其当前防控手段主要依赖传统疫苗接种,无法有效阻止病毒感染与复制,造成局部地区病毒污染比较严重,疫情呈持续性地方流行,且传统疫苗均是针对全病毒设计,常规血清学检测方法不能区分野毒感染抗体和疫苗免疫抗体,无法及时、准确地对疫情作出诊断,对ND的监控十分不利。我国养禽业倡导“绿色、安全”养殖模式,在《国家新城疫防治指导意见（2017—2020年）》中明确提出到2020年年底,全国曾祖代、祖代种鸡场达到净化标准。因此,研发一种安全、高效、能有效鉴别野毒感染抗体及疫苗免疫抗体的新型疫苗对ND的防控及净化至关重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的一种或多种结构蛋白组装而成的纳米级空心颗粒,因形态、大小和自然病毒相似而得名。VLPs适宜的大小及独特的表面结构可被天然免疫细胞和分子有效识别,诱导良好的先天性免疫应答和适应性免疫应答,且VLPs不含有病毒的感染性核酸,安全性较高,近年来成为疫苗领域中的研究热点。本研究立足于VLPs生产平台,以ND的经典商品疫苗株基因II型LaSota株和流行优势基因型强毒株基因VII型NA-1株为研究对象,利用昆虫杆状病毒表达系统,构建以LaSota株的M蛋白为囊膜内部骨架蛋白,囊膜外展示LaSota株及NA-1株的保护性抗原蛋白（F蛋白和HN蛋白）的二价NDV VLPs,并从免疫指标、攻毒保护、体内病毒载量和体外排毒时间四个方面对颗粒疫苗的免疫效果进行评价。同时,针对二价NDV VLPs只含有M、F、HN三种结构蛋白的特点,以NP蛋白为靶点,建立能够鉴别诊断ND野毒感染与VLPs疫苗免疫的ELISA方法。为ND的防控及净化提供安全、高效的候选疫苗株并为其野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断提供新策略。1、二价NDV VLPs的构建与鉴定利用胞外域替换策略,将LaSota株F、HN基因的胞外域替换为NA-1株F、HN基因的胞外域。通过重叠延伸PCR技术将NA-1株F、HN基因的胞外域与LaSota株F、HN基因的胞内域及跨膜区相连,命名为rNA-1 F、rNA-1 HN基因。利用昆虫杆状病毒表达系统表达含有LaSota株M、F、HN基因及rNA-1 F、rNA-1HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 F、rBV-rNA-1 HN。将五种重组杆状病毒同时感染悬浮培养的sf9细胞,96h后收取细胞上清,经纯化后利用SDS-PAGE、Western Blot技术和透射电子显微镜技术鉴定,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的纳米级颗粒,表明正确构建了含有LaSota株M、F、HN蛋白和NA-1株F、HN蛋白的二价NDV VLPs。2、二价NDV VLPs的免疫效果评价以SPF鸡为实验动物,通过肌注方式免疫不同剂量的二价NDV VLPs。与弱毒商品疫苗相比,血凝抑制试验结果显示颗粒疫苗能快速激发较高水平的HI抗体效价;流式细胞术分析结果显示颗粒疫苗能有效诱导更多的CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞产生;在两种强毒株（NA-1株和Herts33株）攻击下,颗粒疫苗提供完全保护,且在排毒时间及病毒载量方面呈现出明显优势。3、区分ND野毒感染抗体与VLPs疫苗免疫抗体的ELISA方法建立利用原核表达系统制备NDV NP蛋白,亲和层析法纯化后经SDS-PAGE、Western Blot技术鉴定,结果表明制备的NP蛋白纯度较高,可用于后续实验。随后以NP蛋白为靶点建立间接ELISA方法,对包被量、样品稀释度、抗体工作条件等环节进行优化,并对检测方法的性能进行评价,结果表明建立的ELISA检测方法敏感性、特异性较高,重复性较好,能够准确区分NDV VLPs疫苗免疫及野毒感染的血清样品。综上,本研究正确制备同时含有ND经典商品疫苗株（LaSota株）及流行优势基因型强毒株（NA-1株）保护性抗原蛋白的二价NDV VLPs,免疫后诱导较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,在同源强毒株及异源强毒株的攻击下为免疫鸡群提供100%的临床保护,且在体内病毒载量与体外排毒时间方面均优于传统商品疫苗。同时,以NDV NP蛋白为靶点,建立的间接ELISA检测方法能够对NDV VLPs疫苗免疫抗体和野毒感染抗体进行准确鉴别诊断。为ND的防控及净化奠定基础。

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中文摘要

Abstract

中英文缩写表

绪论

第一篇文献综述

第1章新城疫与新城疫病毒的研究进展

1.1 新城疫的发展现状

1.2 新城疫病毒的结构基础及致病性

1.3 新城疫商品疫苗的研究现状

1.4 新城疫的鉴别诊断方法

第2章病毒样颗粒的研究进展

2.1 病毒样颗粒概述

2.2 病毒样颗粒表达系统

2.3 病毒样颗粒疫苗与免疫应答

2.4 新城疫病毒样颗粒疫苗的研究现状

第二篇研究内容

第1章基因II型、VII型二价新城疫病毒样颗粒的构建与制备

1.1 材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

第2章二价新城疫病毒样颗粒的免疫效果评价

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章区分新城疫野毒感染与VLPs疫苗免疫的间接ELISA检测方法的建立

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

导师简介

作者简介及在学期间所取得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丁佳欣

导师: 丁壮

关键词: 新城疫,二价,病毒样颗粒,免疫效果,检测方法

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

分类号: S852.4

总页数: 92

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