导读:本文包含了膜融合蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,蛋白,杆状,家蚕,空肠,核型,棉铃虫。
膜融合蛋白论文文献综述
于海佳,刘英辉,Jingshi,Shen[1]（2018）在《Sec1/Munc18与SNARE蛋白作用调控膜融合的分子机制》一文中研究指出真核生物细胞内囊泡膜融合需要通过SNARE(可溶性N-乙基马来亚胺敏感蛋白受体)和SM(Sec-1/Munc18)蛋白来调控。位于靶膜上的t-SNAREs蛋白和位于囊泡表面的v-SNARE蛋白之间通过形成具有拉链结构的四螺旋复合物为膜融合提供能量,SM蛋白通过与SNARE复合物之间相互作用调控膜融合过程。细胞内囊泡运输是一个由众多蛋白参与的多阶段复杂过程,SM蛋白与SNARE之间的作用机制还未研究清楚。我们通过大分子拥挤和膜蛋白功能重组构建了类似于生理条件下的体外膜融合平台,并且证明了SM蛋白通过促进SNARE复合物的组装来调控膜融合过程。进一步的研究发现SM蛋白作用于SNARE蛋白的C端SNARE结构域。通过序列分析,我们观察到SM蛋白Domain 3a上的一段小肽与SNARE蛋白的C端SNARE结构域序列相似。我们发现SM蛋白通过这段小肽与t-SNARE蛋白结合,促进SNARE复合物的组装和膜融合反应的发生。(本文来源于《中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2018年全国学术会议摘要集》期刊2018-10-25）
王晶哲,王小铃,王娟,杨鑫鑫,闫美娜[2]（2018）在《mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达》一文中研究指出目的:构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。方法:分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体。将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况。结果:通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIH-mLumin融合蛋白。结论:成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。(本文来源于《江苏大学学报(医学版)》期刊2018年03期）
冯敏[3]（2018）在《家蚕核型多角体病毒入侵宿主机制及囊膜融合蛋白GP64与宿主蛋白的互作研究》一文中研究指出家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)属于杆状病毒家族的α-杆状病毒属,是引起家蚕病害的主要病原。BmNPV在感染宿主细胞的过程中会产生两种遗传物质相同但形态结构各异的病毒粒子,即出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV)。ODV经口感染昆虫中肠引发原发性感染后,产生的BV随后感染其他细胞引起水平传播,最终导致宿主的全身性感染。GP64是BV的一种主要囊膜融合蛋白,在介导病毒感染和水平传播过程中发挥了关键作用。本研究旨在探究BV入侵宿主的分子机制,鉴定与BV结合的细胞表面蛋白,以及筛选宿主细胞中的GP64互作蛋白,从分子水平阐述杆状病毒出芽型病毒粒子BV入侵宿主细胞以及病毒主要囊膜蛋白GP64与宿主互作的分子机制。主要结论如下:1、BV病毒粒子入侵宿主细胞的机制利用内吞体酸化抑制剂在BV感染前处理家蚕BmN细胞,发现病毒增殖受到显着抑制,表明BV通过低pH介导的内吞作用途径进入BmN细胞。利用网格蛋白依赖的内吞作用途径抑制剂处理以及siRNA干扰网格蛋白重链CHC表达,结果表明网格蛋白介导的内吞作用途径参与了 BV入侵宿主细胞过程。此外,动力蛋白抑制剂处理实验证明了动力蛋白参与了 BV对宿主细胞的有效入侵。进一步通过siRNA干扰胞内囊泡运输和融合调控因子Rab蛋白,结果显示BV感染过程受到Rab5和Rab7调控,而Rabll不参与其中,表明早期和晚期内体的运输在BV病毒粒子入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。2、与BV结合的宿主表面蛋白筛选利用病毒覆盖蛋白结合实验,分离并纯化BV病毒粒子以及BmN细胞表面蛋白,并进行孵育。利用GP64抗体检测到3个明显蛋白条带,表明细胞表面存在与病毒相互作用的蛋白。进一步通过质谱分析,从3个阳性分离胶条中共鉴定到158种蛋白。GO分析表明这些蛋白涉及细胞组分、分子功能和生物过程。蛋白分子功能聚类结果显示,在这些鉴定到的蛋白中结合活性蛋白占比45%,转运活性蛋白占比4%,催化活性蛋白占比32%。以上数据为进一步鉴定与BV结合的宿主细胞膜蛋白受体打下了基础。3、BV关键囊膜融合蛋白GP64与宿主互作蛋白鉴定构建了家蚕BmN细胞酵母文库,以GP64作为诱饵蛋白进行酵母文库杂交分析,共筛选到8个与GP64结合的候选蛋白,分别为E3泛素连接酶SINA-like 10(E3 ubiquitin-protein ligase SINA-like 10)、RAN 结合蛋白 9(ran-binding protein 9)、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazolecarboxylase)、卵裂和多腺苷化特异性因子 5(cleavage and polyadenylationspecific factor 5)、Abrupt-like 蛋白(protein abrupt-like)、NADH 泛醌氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),以及两个未知蛋白 uncharacterized protein LOC101738779 和scaf49 2190774-2191531(-)。4、GP64互作蛋白SINAL10对病毒感染的影响对上述酵母双杂交鉴定的8个候选蛋白作进一步免疫共沉淀验证,发现E3泛素连接酶SINA-like 10(SINAL10)与GP64存在体外相互作用且在细胞内存在共定位。过表达和siRNA抑制实验表明SINAL10能够促进病毒在细胞内增殖,并在病毒的感染周期中发挥重要作用。本论文研究结果初步揭示了家蚕BmNPV BV入侵宿主细胞的途径,明确了该过程涉及网格蛋白介导的内吞作用,依赖于动力蛋白功能,并受到Rab5和Rab7蛋白调控,从分子水平上初步揭示了BV入侵宿主的机制。初步筛选了与病毒结合的细胞表面蛋白,并对其功能进行了注释分析。进一步利用酵母双杂交技术筛选到8个与病毒关键囊膜融合蛋白GP64相互作用的宿主靶标蛋白,并鉴定了其中一个蛋白SINAL10与GP64的互作关系,证明该蛋白对BV增殖具有促进作用。(本文来源于《浙江大学》期刊2018-04-25）
南文斌[4]（2018）在《BmNPV膜融合蛋白GP64中胆固醇结合位点活性分析》一文中研究指出杆状病毒(Baculovirus)是一类基因组大小为80-180kb,主要感染鳞翅目类昆虫的DNA病毒。因为其对人和环境无害,因此被广泛应用于生产生活中。近年来,家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹核型多角体病毒(AcMNPV)研究的较为深入,而两者在农业上的应用的差异引起了人们的广泛关注。两者虽都对环境无害,但家蚕核型多角体病毒宿主域窄却易获得,而苜蓿银纹核型多角体病毒宿主域广但宿主却难饲养。如果将两者彼此优势相结合,则会给农业生产带来极大的经济效益。一般情况下,囊膜病毒在入侵细胞时,起始于病毒囊膜糖蛋白与细胞表面受体的特异性结合,而受体则决定了病毒的宿主域。核型多角体病毒主要以GP64作为出芽型病毒。因此,GP64膜融合蛋白的研究对探究病毒的入侵机制有着深远的意义。BmNPV gp64与AcMNPV gp64同源性在95%以上,BmNPV囊膜蛋白GP64介导病毒以巨胞饮的内吞方式进入细胞。同时本实验室前期研究证实,胆固醇也为BmNPV入侵所必需,而且呈剂量依赖性。因此由胆固醇介导BmNPV入侵机制尚不清楚。本文主要从以下3个方面探究BmNPV gp64胆固醇识别位点与病毒入侵宿主细胞间关系:1.构建BmNPV gp64缺失病毒:设计带有同源臂的缺失引物,通过同源重组的方式将BmNPV gp64基因缺失;2.BmNPV gp64 CRACs感染性验证:BmNPV gp64上有四个胆固醇识别位点,分别将其关键氨基酸Y突变,回复至BmNPV gp64缺失Bacmids,探究四个胆固醇识别位点与病毒感染性的关系;3.BmNPV GP64蛋白表达及生物学活性测定:通过Western-Blot、病毒拯救以及免疫荧光来分析点突变对GP64蛋白的表达定位的影响;通过绘制生长曲线、半数致死时间来测定点突变gp64对病毒生物学活性的影响;通过研究,我们初步揭示了BmNPV入侵宿主细胞的主要机制。BmNPV胆固醇识别序列CRAC2、CRAC3参与病毒的扩增。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2018-04-25）
谢文艳[5]（2016）在《人副流感病毒3型融合蛋白连接区对膜融合功能的影响及机制研究》一文中研究指出背景：人副流感病毒3型(human parainfluenza virus 3, HPIV3)是一种含有不分节段的单股负链RNA基因组的包膜病毒,为副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒属(paramyxovirus)的家族成员之一。在全球范围内,HPIV3主要引起5岁以下婴幼儿的上下呼吸道感染,例如肺炎、细支气管炎、喉炎等。当前仍没有安全有效的疫苗和抗病毒药物来预防和治疗该病毒引起的感染,而开发疫苗和药物的主要障碍在于对该病毒感染宿主细胞的机制还不清楚,因此必须进一步弄清HPIV3的致病机制。HPIV3入侵宿主细胞的先决条件为病毒包膜和宿主细胞膜的融合,同时细胞膜之间的融合也是HPIV3入侵宿主细胞的典型病理特征,该过程主要是通过同源性血凝素-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase, HN)蛋白协助,由融合(fusion, F)蛋白介导完成的。F蛋白为型病毒糖蛋白,最初合成的是非活化的蛋白前体F0,经过加工修饰后被宿主细胞蛋白酶裂解为二硫键连接的F1和F2。研究表明F蛋白上的多个结构域对膜融合活性有重要作用。其中融合肽(fusion peptide, FP)能够插入宿主细胞膜中从而启动膜融合过程；两个疏水性的七重复基元(heptad repeat motif,HR),即HRA和HRB,具有很强的亲和力,能够在膜融合过程中形成稳定的6-螺旋束(six-helical bundle,6HB)促进病毒包膜和靶细胞膜的融合；而跨膜区(transmembrane region, TM)为形成融合小孔所必须。在HRA和HRB之间有大约250个氨基酸(amino acid, aa),主要包括叁个结构域(DⅠ-DⅢ)和两个连接区(DⅠ-DⅡ连接区和HRB连接区)。DⅠ-DⅡ连接区(369aa-374aa)连接结构域DⅠ和DⅡ,HRB连接区连接结构域DⅡ和HRB。当前只有HPIV3 F蛋白融后合构象的X-射线晶体结构是已知的,且HRA、HRB、结构域DⅠ-DⅢ和两个连接区均可在该结构上观察到。到目前为止,虽然已有F蛋白的多个结构域对膜融合活性影响的报道,但DⅠ-DⅡ连接区对膜融合活性的影响还未有报道。目的：确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合活性的影响,探讨DⅠ-DⅡ连接区影响膜融合功能的机制,以期为研究安全有效的疫苗和抗病毒药物提供线索。方法：1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL软件上以PIV5(parainfluenza virus 5, PIV5) F蛋白融合前构象的晶体结构(PDB ID:4GIP)为模板得到HPIV3 F蛋白的融合前构象的模型,以确定DⅠ-DⅡ连接区在融合前构象上的位置。2.采用定点突变和体内同源重组相结合的方法构建出该区域(369aa-374aa)的九个单氨基酸突变体,测序确定构建成功后将它们在真核瞬时表达系统内进行蛋白表达。3.采用叁种不同类型的膜融合试验,即吉姆萨染色法,指示基因法,染料转移法,定性和定量检测各突变体蛋白对膜融合功能的影响。4.采用流式细胞术来检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达效率。5.采用免疫共沉淀试验来检测各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力。6.采用SPSS 17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.成功构建出HPIV3 F蛋白融合前构象的同源结构模型,通过氨基酸序列比对确定了HPIV3 F蛋白融合后构象的DⅠ-DⅡ连接区(369-374aa)在它的融合前构象中仍然扮演DⅠ-DⅡ连接区的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的9个单氨基酸突变体(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均构建成功。2.各突变体F蛋白在膜融合过程的所有阶段均表现出降低的膜融合活性。与野生型蛋白相比,突变体F蛋白形成的合胞体不仅数目减少而且面积也较小,其中K369E、S370A、V373A、V373T和P374T突变体几乎丧失了形成合胞体的能力,仅为野生型的5%以下,内容物混合的能力也极度降低,分别为野生型的18.0%、17.3%、 16.4%、18.9%和15.4%,同时它们的半融合活性也大幅度降低,半融合的速率和程度均低于野生型水平的15%；而剩下的4个突变体(K369A、D371A、I372A和P374A)虽具有合胞体形成能力,但均低于野生型水平,其中K369A和D371A突变体内容物混合的能力均约为野生型的66.7%,半融合的速率和程度约为野生型水平的五分之四(82.2%、82.0%)和四分之叁(74.5%、75.2%),而1372A和P374A突变体内容物混合的能力分别为野生型的水平的57.6%和54.5%,半融合的速率分别降低到野生型水平的58.5%和51.8%,半融合的程度分别降低为野生型的62.6%和60.6%。3.DⅠ-DⅡ连接区的突变对F蛋白在细胞表面的表达水平无影响。各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平均处于野生型F蛋白的93.1%-105.9%之间,与野生型相比差别无统计学意义(P>0.05)。4.DⅠ-DⅡ连接区的各突变体与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低,其中K369E、V373A、V373T和P374T这4个突变体几乎丧失了与HN蛋白相互作用的能力,均低于野生型水平的10%；S370A突变体与HN蛋白相互作用的能力约为野生型的五分之一；K369A、D371A、I372A和P374A突变体与HN蛋白相互作用的能力分别为野生型的41.4%、66.0%、26.9%和15.2%。结论：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合功能有重要影响,且各氨基酸残基对膜融合活性影响的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突变导致各突变体F蛋白与同源性HN蛋白在细胞表面的相互作用能力降低所致。背景：HPIV3入侵宿主细胞是通过病毒包膜和靶细胞膜的融合来实现的,该过程能将单负链不分节段的RNA基因组导入宿主细胞质内,是病毒完成生命周期的关键步骤。HPIV3包膜上有两种与膜融合相关的糖蛋白,即HN蛋白和F蛋白,两者协同完成了该过程。HN蛋白负责介导病毒与靶细胞表面的吸附,而F蛋白则直接介导膜融合过程。在F蛋白HRA和HRB之间有一段过渡性的区域,主要包含叁个结构域DⅠ,DⅡ和DⅢ,它们通过连接区相连。DⅠ和DⅡ结构域由DⅠ-DⅡ连接区(369aa-374aa)连接；DⅡ和HRB结构域由HRB连接区连接；D1和D3结构域直接相连,两者之间并没有氨基酸序列连接,所以我们定义为“伪连接区”,对该区域的氨基酸进行序列比对后发现其含有亮氨酸拉链类似结构。亮氨酸拉链类似结构是一种特殊的类七重复基元结构,最显着的特征是亮氨酸或异亮氨酸总是有规律地每隔6个氨基酸就出现一次,将该氨基酸序列用假想的α螺旋轮展示时,第“a”位的全部氨基酸残基和第“d”位的大部分氨基酸残基均为非极性氨基酸。对叁种不同副粘病毒融合蛋白亮氨酸拉链类似结构的研究表明该基序对膜融合活性有重要影响。然而位于HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性的影响尚未见报道。目的：确定HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性的影响,寻找亮氨酸拉链类似结构干扰膜融合功能的机制。方法：采用PCR定点突变和体内同源重组相结合的方法将该区域的亮氨酸和其它保守氨基酸(L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299)分别突变为丙氨酸,同时将中间的叁个高度保守的亮氨酸(L271、L278和L285)进行了联合突变,应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达,之后采用合胞体形成试验、内容物混合试验、R18探针试验,半融合动力学试验检测突变对膜融合功能的影响；采用流式细胞术检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平；采用免疫共沉淀试验来检测突变对HN蛋白和F蛋白在细胞表面的相互作用能力的影响。采用SPSS 17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.应用PCR单点突变和联合突变的方法成功构建出了HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构的7个单点突变体(L257A、V264A、L271A、 L278A、L285A、Q292A和I299A)、3个二联突变体(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1个叁联突变体(L271A-L278A-L285A)。2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时,在膜融合过程的所有阶段均表现出降低甚至消失的膜融合活性。与野生型相比,突变体蛋白形成的合胞体不仅数量减少而且面积也较小,3个单点突变体(L257A、L271A和I299A)和3个二联突变体的合胞体形成能力极度降低,低于野生型水平的6.0%,内容物混合的能力只有野生型水平的16.0%以下,且只观察到极少量的半融合事件,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%；而V264A、L285A和Q292A这3个突变体的合胞体形成能力略微降低,分别为野生型水平的64.7%、69.1%和68.5%,内容物混合的能力仍维持在野生型水平的85%左右,介导半融合能力轻微降低,半融合的速率分别为野生型的88.8%、87.6%和85.0%,半融合的程度分别为野生型的85.5%、87.2%和83.1%；此外,L278A突变体的合胞体形成能力约为野生型水平的38.1%,内容物混合的能力只有野生型的一半,半融合的速率和程度分别为野生型水平的52.8%和60.6%；剩下的叁联突变体丧失了合胞体形成能力,内容物混合能力仅为野生型的2.2%,也没有观察到半融合事件的发生,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%。3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉链类似结构的各丙氨酸取代株在细胞表面的蛋白表达水平均与野生型近似,差别无统计学意义(P>0.05)。4.所有的突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低,其中叁联突变体没有检测到与HN蛋白的相互作用；3个二联突变体与HN蛋白的相互作用能力约为野生型的一半；L257A.L271A和I299A突变体与HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30%:V264A.L278A.L285A和Q292A突变体与HN蛋白的相互作用能力分别为野生型水平的63.3%、65.1%、64.3%和66.7%。结论：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性有重要影响；其中叁联突变体对膜融合活性的影响最大；该结构的完整性是完成膜融合过程必不可少的。背景：HPIV3F蛋白属于Ⅰ型病毒膜融合蛋白,通常先合成非活化的前体蛋白F0,然后在宿主细胞蛋白水解酶的作用下裂解为二硫键连接的F1和F2。已有研究表明F1亚单位上的FP、HRA和HRB能够在细胞融合过程中发挥重要作用。值得注意的是,Yin等发现在副流感病毒5型(parainfluenza virus 5, PFIV5) F蛋白融合前构象的X射线晶体结构中HRB的N-端有一段电子密度较弱的区域,即HRB连接区。对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) F蛋白HRB连接区的第454位谷氨酰胺(glutamine, Q)进行氨基酸突变分析后发现其对膜融合活性有重要影响。Russell等在猴病毒5型(Simian virus 5, SV5) F蛋白HRB的N-端靠近HRB结构域的连接区内构建突变体发现第447位亮氨酸(leucine, L)和第449位异亮氨酸(isoleucine, I)是影响F蛋白融合功能和形成六螺旋束(6HB)的关键氨基酸,提示HRB连接区域可能具有类似“开关”F蛋白构象折迭的作用；目前对HPIV3F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响尚不清楚。目的：确定HPIV3F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响,探讨该区域影响膜融合功能的机制。方法：采用定点突变和体内同源重组相结合的方法将HRB连接区内的T429、E432、1443和N446位氨基酸进行单点突变,应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达,之后采用吉姆萨染色法、指示基因法、染料转移法检测突变对膜融合活性的影响；采用SPSS17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.成功构建了HRB连接区的6个突变体T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时,膜融合活性表现为两种类型。T429A、T429L和N446A这3个突变体形成的合胞体不仅个数少,而且面积也比较小,内容物混合的能力也降低,只有野生型水平的36.6%、42.3%和15.2%,同时半融合活性只有野生型水平的34.8%、42.7%和12.4%；而E432A、I443A和N446S这3个突变体的膜融合活性均比野生型略增强,分别相当于野生型的109.4%、113.2%和118.6%,但半融合活性差别无统计学意义。结论：HPIV3 F蛋白HRB连接区内的氨基酸突变对细胞融合活性有重要影响,其中N446为关键氨基酸位点。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-09）
贠炳岭[6]（2016）在《禽偏肺病毒F蛋白介导膜融合及抑制β-干扰素机制研究》一文中研究指出禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属。aMPV感染火鸡引起火鸡鼻气管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),感染鸡引起肿头综合征(Swollen head syndrome,SHS),aMPV感染对养禽业造成经济损失和严重威胁。aMPV入侵宿主细胞需要病毒囊膜和细胞膜融合,这一过程是由融合蛋白(Fusion,F)介导的。然而,aMPV F蛋白介导膜融合的机制尚不清楚。另外,aMPV感染造成继发感染病毒或细菌,但这种免疫抑制效应尚不清楚。本研究旨在阐述aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫机理。aMPV和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)都属于肺病毒属。对于hMPV,胰酶和低pH诱导F蛋白介导膜融合呈现毒株依赖性。本研究中发现叁个亚型的aMPV(aMPV/A,aMPV/B和aMPV/C)F蛋白介导细胞融合不需要胰酶。添加胰酶可以促进aMPV/C F蛋白融合活性。通过突变F蛋白100或101位点的氨基酸,发现胰酶调节aMPV F蛋白的融合活性是由100和101位点决定。另外,低pH环境不能促进aMPV/A和aMPV/B F蛋白融合活性,但能促进aMPV/C F蛋白融合活性。突变F蛋白294位点的氨基酸,发现低pH调节aMPV F蛋白的融合活性是由残基294G决定的。剖析aMPV F蛋白介导细胞融合所需基本条件有助于理解aMPV入侵机制。aMPV F蛋白裂解不依赖外源性的胰酶,意味着内源性的蛋白酶就可以裂解aMPV F蛋白,但是宿主中的裂解酶尚未确定。我们发现跨膜丝氨酸蛋白酶(Transmembrane serine protease 12,TMPRSS12)有助于裂解aMPV/B F蛋白。过表达TMPRSS12提高aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。干扰TMPRSS12降低aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。另外,我们发现aMPV/B F蛋白的100和101位点被TMPRSS12识别,并证实HDS(组氨酸,天冬氨酸,丝氨酸)叁联体是TMPRSS12催化核心。重要的是我们发现TMPRSS12的mRNA在aMPV的靶器官存在。以上结果说明TMPRSS12有助于裂解aMPV/B F蛋白,为aMPV的预防与治疗提供技术支持。裂解的aMPV F蛋白介导膜融合的前提是与细胞表面的受体结合,但是aMPV F蛋白受体尚不清楚。已知的aMPV/B F蛋白含有保守的RDD基序。我们假设RDD与细胞表面的整合素结合启动F蛋白介导膜融合。为验证我们的假设,首先我们证实封闭整合素的多肽降低了aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制。同时我们通过抗体阻断,干扰试验和过表达确定是aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制所需的是整合素αv和β1。其次,过表达整合素αv和β1使得aMPV/B F蛋白和aMPV能在非允许细胞系分别吸附和感染。最后突变RDD成RAE,aMPV/B F蛋白吸附能力和融合活性显着下降。以上结果说明整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白受体,促使aMPV/B F蛋白介导膜融合和aMPV/B感染。临床观察aMPV感染引起免疫抑制,但是免疫机理尚未阐明。I型干扰素(Type I interferons,IFN-I)像β-干扰素(Interferon-β,IFN-β)是机体防御的重要组分,在抵抗病毒和细菌感染中发挥重要作用。本研究发现aMPV/B感染的鸡和DF-1细胞后,IFN-β的表达降低。我们进一步证实是aMPV/B F蛋白抑制IFN-β的产生。突变aMPV/B F蛋白的100,101,93位点发现aMPV/B F蛋白裂解水平决定aMPV/B F蛋白抑制IFN-β程度。干扰试验和多肽阻断证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β通过Toll样受体3(Toll-like receptors 3,TLR3)和Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)途径,干扰试验和流式分析证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β与簇分化抗原14(Cluster of differentiation 14,CD14)有关。重要的是aMPV/B F蛋白降低脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的免疫效应。以上结果说明aMPV/B引起鸡的免疫抑制好像是通过F蛋白与CD14结合从而降低IFN-β的产生。aMPV F蛋白介导膜融合需要经过裂解和结合受体的过程,剖析这些过程有助于了解aMPV的入侵和感染。上述研究证实,aMPV F蛋白的100,101和294位点决定胰酶和低pH调节F蛋白融合活性。我们进一步揭示aMPV/B F蛋白裂解不需要胰酶的原因是TMPRSS12可以裂解aMPV/B F蛋白。而且发现整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白和aMPV/B感染的受体。另外,我们证实aMPV/B F蛋白裂解程度决定IFN-β表达量,同时发现CD14参与aMPV/B F蛋白下调IFN-β。本研究阐明了aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫抑制机理,有助于理解aMPV的发病机制。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2016-05-01）
梁飞[7]（2016）在《BmNPV膜融合蛋白GP64作用机制初步研究》一文中研究指出杆状病毒是双链DNA病毒的一个大家族,该病毒主要感染鳞翅目、双翅目、膜翅目昆虫及甲壳类动物,区别于其它病毒的显着性特征是它具有双相复制周期,其生活周期中产生两种结构与功能不同的病毒粒子:出芽病毒(BV)和包涵体病毒(ODV)。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是昆虫杆状病毒科核多角体病毒属的代表成员,虽然关于其感染的机制进行了大量研究,但仍有许多问题需要进一步解决,本论文主要对GP64及胆固醇介导BmNPV BV入侵细胞机制及GP64信号肽特性作了进一步的研究,以揭示膜融合蛋白GP64胆固醇识别序列(cholesterol recognition amino acid consensus,CRAC)与胆固醇的相互作用是BV入侵细胞的关键,同时也证明了GP64信号肽在引导GP64跨膜转运后并没有发生切割。本研究丰富了杆状病毒感染分子机制的理论。本论文主要从以下几个方面研究GP64与胆固醇介导BmNPV BV入侵细胞的分子机制:BmNPV GP64序列分析及信号肽特性分析、BmNPV gp64缺失病毒的构建、BmNPV GP64 CRACs分析及与胆固醇互作探究。这些研究结果为后期阐述BmNPV入侵细胞机制提供参考。1)BmNPV GP64序列分析及信号肽特性分析:BmNPV gp64全长1593 bp,编码530个氨基酸,其N端信号肽序列为38个氨基酸残基。通过序列比对发现BmNPV GP64与AcMNPV GP64的同源性达到93%;在BmNPV GP64信号肽内部加上c-Myc-Tag,再转染BmN细胞,通过western blot验证BmNPV GP64信号肽在完成跨膜转运后是否被切割。2)BmNPV gp64缺失病毒的构建:利用同源重组的方法将打靶DNA分子通过电击转化到Red重组系统中,通过两种抗性筛选阳性克隆。设计鉴定引物及缺失基因内部引物进行PCR鉴定,将鉴定正确的缺失病毒重新构建新的Bac-to-Bac系统。该成果将为后续研究奠定基础。3)BmNPV GP64 CRACs分析及与胆固醇互作探究:通过序列比对发现,AcMNPV GP64含有3个CRACs,而BmNPV GP64含有4个CRACs,其中一个CRAC正好在BmNPV GP64的信号肽内;为了研究BmNPV GP64哪个CRAC与胆固醇具有结合活性,我们设计了一系列重组病毒Bacmid,通过转染进行感染性验证。通过上述研究,我们成功构建了BmNPV gp64缺失病毒,首次揭示了BmNPV GP64信号肽序列在蛋白质后期加工中并没有被切割,为进一步研究BmNPV入侵细胞机制提供了新的参考。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2016-04-25）
沈姝,王曼丽,李鑫,李淑芬,邓菲[8]（2013）在《棉铃虫核多角体病毒膜融合蛋白N-糖基化修饰的突变和功能研究》一文中研究指出F蛋白是棉铃虫核多角体病毒(HearNPV)上最主要的囊膜糖蛋白。N-糖基化修饰对大多数糖蛋白的功能起着重要作用,而就杆状病毒而言,N-糖基化修饰对于F蛋白的功能扮演着何种角色,仍有待进一步研究。迄今为止,只有F_2亚(本文来源于《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2013-11-21）
曾丹云[9]（2012）在《杆状病毒膜融合蛋白HaF融合肽和钾离子通道调节剂ImKTx104的核磁共振结构研究》一文中研究指出核磁共振波谱(NMR)技术能测定溶液状态下的蛋白质结构,并且获得蛋白质的动力学信息,目前已成为结构生物学研究的重要手段。经过多年的发展,NMR技术在蛋白质结构解析方面已建立了较为完善的理论体系和实验方法。同时,硬件的开发也使NMR技术不断突破分子量瓶颈,向着更广阔的应用领域发展。本论文以核磁共振方法为主要手段,选择了与细胞膜融合和跨膜信号转导功能有重要关系的两个多肽为研究对象,通过对它们的结构研究,展示了NMR技术在解决重要生物问题上的应用能力。研究内容一：杆状病毒囊膜蛋白F蛋白融合肽的结构与膜融合机理的研究病毒浸染细胞是生命体致病的主要原因之一,而膜融合正是病毒入侵宿主细胞的必要途径。弄清膜融合机理,将为发现新靶标和研发新药物提供信息和线索,从而对一些病毒性疾病进行有效的防治。然而,目前膜融合机理尚不十分清楚。本论文以棉铃虫核多角体病毒F蛋白(HaF)融合肽为研究对象,通过用液体NMR技术解析和详细比较它的4个融合功能强弱不同的突变体(D11L、I2N、 N1G、G3L)和同源的野生型舞毒蛾核多角体病毒F蛋白(LD130)融合肽的结构,归纳了杆状病毒融合肽的结构与功能的关系；以及通过顺磁增宽实验测定各多肽与胶束的结合状态,揭示了融合肽插膜的部分机理。野生型杆状病毒HaF融合肽在类膜体系中呈规则的倒“V”(或回旋镖)形结构,具有代表性意义。而它的4个突变体结构均发生了不同的变化。在结构对比中发现,刚性转角和完整的两亲性表面对倒“V”(或回旋镖)形构象的融合活性意义重大。另一方面,以野生型LD130融合肽为代表的“直棒”形构象虽然也具有两亲性,但螺旋含量极高,无转角,结构的线性程度越高功能越强。该构象的发现揭示了融合肽结构的多样性,也为理解融合肽结构与功能的关系提供了新视角。结合顺磁增宽实验,我们推测杆状病毒融合肽结构可分为“融合区域”和“结构区域”两部分,而插膜是两部分协同作用的结果。这些研究结果从一定程度上揭示了膜融合机理的部分规律。研究内容二：酸性蝎毒肽ImKTx104的结构解析与动力学性质测定钾离子通道对细胞膜传递信号有重要作用,因而也与许多疾病息息相关。以KCNQ钾离子通道为例,其下属5个亚家族中,就有4个的突变能引起重大疾病。蝎毒肽是天然高效的离子通道调节剂,能特异性地对离子通道产生作用,有效治疗与该通道相关的疾病,它们的结构是新药设计的重要模板。遗憾的是,目前还有许多离子通道的特异性多肽类调节剂未被发现。最近,第一个作用于KCNQ1通道的蝎毒肽调节剂—-ImKTx104被发现,它是a-KTx亚家族新成员,但一级序列的同源性不高。本论文以液体NMR为主要手段,详细解析了ImKTx104的叁级结构和动力学性质,发现其结构除一段310-螺旋外,其他部分均呈现无规卷曲状态。动力学实验和氢氘交换实验表明,该结构柔性不高。通过与同族蝎毒肽的结构比较发现,该结构在空间上保持了经血CS-a/p折迭的结构特性。因此,我们认为ImKTx104的蛋白折迭是一种“形变的CS-α/β折叠”,而保守的叁对二硫键和"CXXXC---GXC---CXC"序列框架对维持结构框架的稳定性和这种折迭的特性起到了重要作用。该结构的发现拓展了我们对CS-α/β折叠的认识,也揭示了蝎毒肽的结构多样性,同时为研究KCNQ1通道与其调节剂的相互作用机制提供了信息,并为以该通道为靶标的药物开发提供了分子框架和设计思路。(本文来源于《中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）》期刊2012-08-01）
张华威[10]（2012）在《空肠弯曲菌膜融合蛋白CmeA、外膜蛋白CmeC的表达、纯化与结晶筛选》一文中研究指出空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是最常见的导致肠炎的细菌,它也可通过神经节苷脂模拟机制导致周围神经系统自免疫紊乱的格林巴利综合征,对人类健康造成危害。临床经验表明,空肠弯曲菌在人体肠道内的生存和繁殖过程中,对四环素、红霉素和氯霉素敏感,对青霉素、大灵碱、喹啉酮和头孢霉素表现出很强的耐受性。通过对其感染过程及抗性机制的了解,有针对性地设计药物与抗体,从而减少空肠弯曲菌对人类健康的危害,成为近年来的一个较重要的课题。CmeABC系统是空肠弯曲菌中的多重耐药外排系统,在对抗生素以及胆盐的抗性中起着主要作用。CmeABC系统包括叁种蛋白：细胞膜融合蛋白CmeA,细胞内膜蛋白CmeB和细胞外膜蛋白CmeC其中CmeA蛋白主要功能为连接CmeB和CmeC,帮助形成外排通道。CmeC蛋白主要是作为通道,将抗生素和胆盐等从细菌体内运到体外。外源性的抗体、药物分子可以通过作用于外膜蛋白CmeC影响到CmeABC系统的功能,所以它是一个潜在的药物作用靶点。本课题对空肠弯曲菌膜融合蛋白CmeA、外膜蛋白CmeC蛋白进行表达、纯化和结晶筛选,为以后解析CmeA, CmeC蛋白的结构、针对性地设计药物、治疗相关疾病打下基础。并可借此深入理解此类蛋白的结构与功能特征,理解CmeABC系统在空肠弯曲菌生存、增殖和感染中的作用。(本文来源于《复旦大学》期刊2012-05-20）
膜融合蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。方法:分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体。将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况。结果:通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIH-mLumin融合蛋白。结论:成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
膜融合蛋白论文参考文献
[1].于海佳,刘英辉,Jingshi,Shen.Sec1/Munc18与SNARE蛋白作用调控膜融合的分子机制[C].中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2018年全国学术会议摘要集.2018
[2].王晶哲,王小铃,王娟,杨鑫鑫,闫美娜.mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达[J].江苏大学学报(医学版).2018
[3].冯敏.家蚕核型多角体病毒入侵宿主机制及囊膜融合蛋白GP64与宿主蛋白的互作研究[D].浙江大学.2018
[4].南文斌.BmNPV膜融合蛋白GP64中胆固醇结合位点活性分析[D].江苏科技大学.2018
[5].谢文艳.人副流感病毒3型融合蛋白连接区对膜融合功能的影响及机制研究[D].山东大学.2016
[6].贠炳岭.禽偏肺病毒F蛋白介导膜融合及抑制β-干扰素机制研究[D].中国农业科学院.2016
[7].梁飞.BmNPV膜融合蛋白GP64作用机制初步研究[D].江苏科技大学.2016
[8].沈姝,王曼丽,李鑫,李淑芬,邓菲.棉铃虫核多角体病毒膜融合蛋白N-糖基化修饰的突变和功能研究[C].2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集.2013
[9].曾丹云.杆状病毒膜融合蛋白HaF融合肽和钾离子通道调节剂ImKTx104的核磁共振结构研究[D].中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）.2012
[10].张华威.空肠弯曲菌膜融合蛋白CmeA、外膜蛋白CmeC的表达、纯化与结晶筛选[D].复旦大学.2012
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