李大强[1]2003年在《恶性肿瘤细胞与囊胚滋养层细胞侵袭性生物学行为的比较性研究》文中指出研究背景恶性肿瘤逐渐成为了威胁人类健康的主要疾患之一。随着人类基因组草图的完成和多种模式生物全基因组序列的获得，人类对恶性肿瘤等基本生命现象内在机制的研究, 已步入了后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)时代。但据1995年美国国立癌症研究所(NCI)报道，近20年来恶性肿瘤病人的死亡率并没有下降，反而在上升，这主要归因于人类尚未攻破其最坚固的堡垒-侵袭和转移。约70%的侵袭性肿瘤患者在首诊时已有微转移或可见转移灶，术后有40%~60%的患者发生复发和转移，80%~90%的肿瘤患者死于侵袭转移及相关并发症。由于恶性肿瘤细胞基因的多态性、生物学行为的复杂性以及缺乏理想的实验模型，目前对肿瘤侵袭和转移内在机制的研究仍处于探索阶段。自1829年Lobstein等提出肿瘤的胚胎性起源概念以来，早期胚胎细胞与恶性肿瘤细胞生物学行为的相似性研究日益受到重视。Murray等研究证实，侵袭性生物学行为不仅是恶性肿瘤细胞转移信号级联反应中的前提和基础，而且是囊胚滋养层细胞植入母体子宫内膜（胚胎植入）信号转导通路中的关键。两者在病理生理过程、细胞增殖分裂、基因表达（癌基因、细胞黏附分子、细胞外基质和基质降解酶等）、新生血管形成、细胞凋亡和免疫逃逸等诸多方面具有惊人的相似性。然而，与恶性肿瘤细胞无限侵袭和转移相比，侵袭特性的囊胚滋养层细胞在机体原癌基因、癌基因、细胞外基质、细胞黏附分子和基质降解酶等网络调控下，通过与子宫内膜对话(cross-talk), 从而有序侵袭母体内膜。故Even-Ram等认为，所谓胚胎植入是“假恶性”(pseudomalignant)的囊胚滋养层细胞发生的生理性转移(physiological metastasis)。其中细胞周期、信号<WP=8>转导和癌基因-抑癌基因平衡等精确调控，蕴藏了阴阳平衡等中医学整体思维和基因时序差异表达等现代科学哲理，为研究恶性肿瘤侵袭和转移的内在机制建立了天然的实验（分子）模型。21世纪的生命科学将是一个多学科创造性融合的时代。因此，两者研究方法学和哲学思维的交叉、渗透和融合，不仅对阐释囊胚滋养层细胞和恶性肿瘤细胞侵袭性生物学行为的内在机制，以及为开发和研究新的抗肿瘤侵袭转移的药物和技术等提供新的思路，而且对认识生命现象的多样性和生命本质的一致性具有重要意义。目 的1. 细胞是一切生命活动的基本单位，且细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的相互作用和通讯，更是胚胎植入和恶性肿瘤细胞侵袭转移等基本生命现象的本质。通过建立小鼠囊胚和恶性肿瘤细胞共培养模型，探讨这两种侵袭特性的生命形式细胞在体外相同的微环境（microenvrionment）下，动态的相互作用和侵袭性差异以及细胞侵袭相关基因的差异表达，试图从细胞社会学和微环境等整体思维的角度来解读这两种生命现象。2. 探讨在多种肿瘤组织和细胞中丧失表达的抑癌基因等负性调控分子，在体内囊胚滋养层细胞有序侵袭信号转导通路中的作用，从天然的抗组织侵袭模型-胚胎植入的角度，来阐释肿瘤无限侵袭转移的分子机制及其治疗靶点。3. 探讨抗囊胚侵袭的药物-米非司酮对人低分化淋巴结转移胃腺癌细胞株SGC-7901生长、侵袭和转移的影响，从而为促进两学科的交叉性研究以及临床应用等提供新的思路。意 义早期胚胎（有人称之为良性肿瘤）的高速、有序的增殖分化，以及“假恶性”的囊胚滋养层细胞有序侵袭子宫内膜，为研究恶性肿瘤细胞无限增殖和侵袭转移的内在机制建立了天然的实验（分子）模型。两者研究方法学和哲学思维的交叉、渗透和融合，为解读目前这两大生物学之谜的内在机制和临床治疗等提供新的思路。材料与方法1. 建立KM系小鼠围植入期囊胚细胞与正常细胞株（鼠成纤维细胞L929和NIH3T3、人气道上皮细胞9HTE和人脐静脉内皮细胞ECV-304）、不同组织学来源的<WP=9>恶性肿瘤细胞株（人鼻咽癌细胞HNE1、人胃癌细胞BGC-823和SGC-7901、人肾癌细胞786-0、人膀胱癌细胞BIU-87及BADM-60、人成骨肉瘤细胞Ros17/2.8和Saos-2、人子宫内膜癌细胞RL95-2及大鼠乳腺癌细胞SHZ-88）以及不同侵袭转移潜能的人肝癌（HepG2、SMMC-7721、QGY-7703及MHCC97-H）和乳腺癌细胞株（T47D、MCF-7、ZR75-30、Bcap-37、MDA-MB-231及MDA-MB-435s）共培养模型，探讨两种侵袭特性的生命形式细胞，在体外相同的微环境下动态地相互作用及整体生物学行为变化。2. 采用H.E染色、Giemsa染色、甲基绿-派洛宁染色以及扫描电镜检测，观察恶性肿瘤细胞和囊胚细胞在共培养系统中的形态学变化; 采用免疫细胞化学和原位杂交技术，探讨细胞侵袭相关基因整合素αv、焦点黏附激酶(FAK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、CD44v6、Ki-67和Cyclin D1在共培养系统中的差异表达。3. 采用免疫组织化学及原位杂交技术，探讨在肿瘤侵袭转移信号级联反应中下调或丧失表达的抑癌基因p16INK4a 蛋白及nm23/NDPK mRNA，在体内囊胚滋养层细胞有序侵袭信号转导通路中的作用。4. 采用细胞培养和建立裸鼠移植瘤模型，初步探讨抗囊胚侵袭的药物-米非司酮(MIF)对人低分化淋巴结转移胃腺癌细胞株SGC-7901生长及侵袭转移的影响。结 果1. 小鼠囊胚与不同组织学来
王焕英[2]2004年在《小鼠早期胚胎滋养层细胞与恶性肿瘤细胞侵袭性比较研究》文中研究表明肿瘤是导致人类死亡的第二位原因，是人类健康最受关注和被广泛研究的课题之一。在征服肿瘤的努力中，人们做了大量的工作，但至今尚未取得决定性的突破。近20年来肿瘤病人的死亡率非但没有下降，反而在上升，80％～90％的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭转移及相关并发症。这是由于人类还没有弄清肿瘤的起源和发生机制问题，从而不能针对根源采取对策。 早在1829年，法国生物学家Lobstein和Recamier就提出了肿瘤的胚胎性起源的概念。近年，随着细胞生物学、分子肿瘤学、实验胚胎学、实验肿瘤学以及免疫胚胎学的发展，对肿瘤形成与胚胎发育对比研究不断深入。大量的实验研究发现在肿瘤形成与胚胎发育之间存在着诸多的相似之处，提示两者具有同源性。这主要表现在肿瘤细胞与早期胚胎细胞均为发育学上“年轻”的细胞，具有强大的生命力和旺盛的增殖与生长能力，有许多相同的基因表达(癌基因／抑癌基因、异位激素、异位同功酶、胚胎抗原等)，有相似的血管形成和免疫逃逸机制，特别是在肿瘤细胞侵袭与胚胎植入(滋养层细胞侵袭子宫内膜)重庆医科大学博士论文过程中具有活跃的侵袭细胞外基质能力。本课题以肿瘤形成与胚胎发育同源性为理论基础，以恶性肿瘤细胞与胚胎滋养层细胞侵袭性相似性为切入点，进行以下研究:第一部分小鼠外胎盘锥滋养层细胞体外侵袭恶性肿瘤细胞的实验观察 目的:通过建立单纯的滋养层细胞与恶性肿瘤细胞体外共培养体系，观察这两种侵袭特性的细胞直接接触后的相互侵袭关系。以期证明单纯的胚胎滋养层细胞，在脱离了胚胎整体性调控后，体外侵袭能力仍强于恶性肿瘤细胞。在细胞水平上，重新认识和了解具有侵袭特性的胚胎滋养层细胞和恶性肿瘤细胞。 方法:建立孕D8.5小鼠外胎盘锥滋养层细胞与多种不同组织学来源的恶性肿瘤细胞(人子宫内膜癌细胞株RL95一2、人肝癌细胞株HePGZ及SMMC一7721、人乳腺癌细胞株Bcap一37及MDA一MB一231、人卵巢癌细胞株SKOV3、人宫颈癌细胞株Hela、人鼻咽癌细胞株HNEI、人胃癌细胞株SGC一7901、大鼠骨肉瘤细胞株LMS、人骨肉瘤细胞株R0517/2.8、小鼠黑色素瘤细胞株B16、大鼠乳腺癌细胞株SHZ一88)和正常细胞(鼠成纤维细胞NIH3T3和L929、人脐静脉内皮细胞ECV-304和人气道上皮细胞gHTE)体外共培养体系，倒置显微镜下观察这两种侵袭特性的细胞直接接触后的相互侵袭关系，及在体外相同的微环境 重庆医科大学博卜论文下，表现出的整体生物学行为。 结果:小鼠外胎盘锥滋养层细胞可以在恶性肿瘤细胞上呈侵袭性扩展生长。在共培养48h一96h之间，外胎盘锥滋养层细胞扩展生长速度最快，在144h其扩展面积基本达峰值，形成近似“S”形的扩展面积曲线。共培养72h(扩展高峰期)和144h(扩展面积峰值)，肿瘤细胞组的外胎盘锥滋养层细胞扩展面积均显着大于正常细胞组(P<0.05)。小鼠外胎盘锥周围的恶性肿瘤细胞有生长方向的改变，呈隆起的圆形或椭圆形状，重迭式生长，堆积、环绕在新生滋养层细胞周围。小鼠外胎盘锥滋养层细胞与恶性肿瘤细胞之间形成清晰的界限。 结论:小鼠胚胎滋养层细胞作为机体正常的组织细胞，在脱离胚胎整体性调控后，其体外侵袭能力仍强于恶性肿瘤细胞，并表现为自限性的过程。恶性肿瘤细胞可以促进小鼠外胎盘锥滋养层细胞侵袭性扩展生长。
张慧娟, 宋学茹, 白晓红, 吕睿, 糜若然[3]2010年在《共培养体系中小鼠囊胚对人卵巢癌细胞系HO-8910PM的影响》文中进行了进一步梳理目的:观察两种具有侵袭特性的小鼠囊胚细胞与人卵巢癌细胞在相同的体外微环境下,动态的相互作用和整体生物学行为变化。方法:建立小鼠囊胚与人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM体外共培养模型,应用MTT法检测HO-8910PM细胞黏附率的改变;应用Transwell体外细胞侵袭实验观察HO-8910PM细胞体外侵袭及趋化性运动能力的变化;应用RT-PCR检测HO-8910PM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2mRNA的表达。结果:癌细胞与小鼠囊胚共培养24h后,大部分囊胚开始边脱带边黏附,推开底层的癌细胞,在囊胚与肿瘤细胞间形成了明显的界限。共培养组的HO-8910PM细胞的黏附率低于对照组。Transwell小室体外侵袭实验及体外趋化性运动实验显示,共培养组穿过滤膜的细胞数明显少于对照组。共培养组MMP-2、MMP-9mRNA的表达及MMP/TIMP较对照组明显下降,TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达略有增加。结论:当人HO-8910PM细胞与小鼠囊胚共培养时,肿瘤细胞失去了特有的侵袭性;小鼠囊胚能显着降低HO-8910PM细胞的黏附、体外侵袭能力、运动迁移性及MMP-2、MMP-9mRNA的表达。
王雅琴[4]2014年在《USP22基因在人早孕期母—胎界面的表达及对滋养细胞侵袭性的影响》文中认为母-胎界面正常妊娠滋养细胞具有类似肿瘤细胞的高增殖和侵袭能力。胚胎着床时,胚胎的滋养层细胞与子宫内膜细胞相互接触,启动粘附、迁移、基质降解侵蚀母体血管及新生血管生成、侵袭子宫内膜等信号级联反应,完成与肿瘤细胞类似的粘附、侵袭和迁移叁个生理过程。但在胎盘形成后,滋养层细胞的侵袭行为又出现与肿瘤细胞侵袭完全不同的节制性。滋养层细胞的侵袭过程是受到人体严格而精细调控的,一旦调节失控则会导致病变。例如滋养层细胞过度侵入与多种妊娠滋养细胞疾病(如葡萄胎、绒毛膜上皮癌等)形成有关,而侵入不足则会造成反复着床失败、自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫或妊高征等。因此,阐明滋养层细胞的侵袭机制将为防治滋养层细胞侵入异常相关的疾病提供理论基础。泛素特异性水解酶22(ubiquitin specific peptidase22, USP22)是新近发现的一种肿瘤细胞标记基因,其编码产物在多种肿瘤组织高表达并参与调控与细胞转化和细胞周期相关基因的转录。目前关于USP22参与滋养细胞侵袭的研究尚未见报道。为探究USP22在母-胎界面表达及其作用机制,本研究用免疫组化、实时荧光定量PCR及Western-blot技术检测USP22在人早孕期正常妊娠妇女和不明原因复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达,继而利用RNAi技术阻断USP22基因在人绒毛膜癌JEG-3细胞中的表达,观察JEG-3细胞侵袭行为的变化,并测定基质金属蛋白酶MMP-2和9的表达,试图从分子和细胞水平探讨该基因在母-胎界面的表达及其对滋养细胞侵袭调控的影响,为进一步加深对生理状态(胚胎植入)和病理性疾病(自然流产、滋养细胞疾病等)的理解提供新的线索。第一部分USP22基因在人早孕期母-胎界面的表达调控目的探讨USP22基因在人早孕期正常妊娠及复发性流产患者母-胎界面的表达及定位。方法分别采用免疫组织化学方法、荧光实时定量PCR法、Western blot检测20例早孕期正常妊娠妇女及15例不明原因复发性流产患者绒毛、蜕膜组织中USP22的定位、mRNA及蛋白表达水平。结果(1)免疫组化显示在早孕期正常妊娠及复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中均表达USP22,且在绒毛细胞滋养细胞中高表达；早孕期随孕周的增加,绒毛滋养细胞USP22的表达逐渐增强(P<0.05);与正常妊娠组比较,复发性流产患者绒毛及蜕膜组织USP22的表达量显着下降(P<0.05)。(2)实时定量PCR显示绒毛及蜕膜组织中均可见USP22mRNA表达；与正常妊娠组比较,复发性流产组绒毛USP22mRNA表达水平显着降低(P<0.05),蜕膜组织中USP22mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(3) Western blot检测亦显示绒毛及蜕膜组织中均表达USP22蛋白；与正常妊娠组比较,复发性流产组绒毛USP22蛋白表达水平显着降低(P<0.05),蜕膜组织中USP22蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论USP22在人早孕期母-胎界面表达,并参与了正常早孕期绒毛滋养细胞侵袭的调控和正常妊娠的维持；母-胎界面USP22表达下降可能是导致自然流产发生的原因之一。第二部分干扰USP22的慢病毒的制备和感染目的针对USP22蛋白编码序列设计能转录生成shRNA的寡核苷酸片段,构建慢病毒介导的siRNA表达载体,包装病毒并感染靶细胞,建立USP22基因稳定下调的JEG-3细胞株。方法依据USP22序列采用设计分析软件制备针对USP22基因的siRNA寡核苷酸序列,将其克隆至慢病毒载体PGCL-GFP上构建重组质粒PGCL-USP22,脂质体转染包装细胞293T。24h后,收集上清液,经浓缩,感染JEG-3细胞。采用荧光定量PCR和Western Blot检测JEG-3细胞中USP22的沉默效率。结果对重组质粒PGCL-USP22测序结果证实shRNA表达模板成功克隆于PGCL载体上,插入序列完全正确无碱基突变和缺失。利用实时定量PCR和Western blot检测慢病毒感染的JEG-3细胞中USP22的沉默效率,发现：3个PGCL-RNAi细胞克隆出现不同程度的USP22表达下调,其中USP22shRNA-C表达下调均超过70%,确定为USP22有效沉默。结论成功构建慢病毒介导的siRNA表达载体,包装病毒并感染靶细胞,建立了USP22基因稳定下调的JEG-3细胞株。第叁部分下调USP22对绒癌细胞株侵袭行为的影响目的进一步探讨siRNA稳定下调USP22的表达后对绒癌滋养细胞生物学行为及相关分子表达的影响。方法比较siRNA稳定下调USP22后绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力的变化,荧光实时定量PCR及Western blot法检测干扰USP22后滋养细胞MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表达量的变化。结果Transwell实验显示：下调USP22表达后JEG-3细胞的细胞穿透数目(12.145±3.125)与对照组(20.143±3.128)相比明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。实时定量PCR显示干扰USP22表达后绒毛膜癌细胞MMP-2及MMP-9mRNA较未干扰组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)；Western blot法测定干扰USP22表达后绒毛膜癌细胞MMP-2及MMP-9的蛋白表达量较未干扰组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论抑制USP22的表达显着降低JEG-3细胞的侵袭能力。USP22促进JEG-3细胞的侵袭可能通过对MMP-2、MMP-9的转录激活来实现的。
参考文献：
[1]. 恶性肿瘤细胞与囊胚滋养层细胞侵袭性生物学行为的比较性研究[D]. 李大强. 重庆医科大学. 2003
[2]. 小鼠早期胚胎滋养层细胞与恶性肿瘤细胞侵袭性比较研究[D]. 王焕英. 重庆医科大学. 2004
[3]. 共培养体系中小鼠囊胚对人卵巢癌细胞系HO-8910PM的影响[J]. 张慧娟, 宋学茹, 白晓红, 吕睿, 糜若然. 天津医药. 2010
[4]. USP22基因在人早孕期母—胎界面的表达及对滋养细胞侵袭性的影响[D]. 王雅琴. 武汉大学. 2014