李伟[1]2003年在《海马脑片方法学的建立以及在脑损伤研究中的应用》文中研究表明脑损伤导致神经元死亡的两个主要机制是：氨基酸兴奋性毒性(amino acid excitotoxicity)和自由基损伤(free radical damage)。脑缺氧或其他损伤时，大量谷氨酸释放，Ca~(2+)内流，细胞内Ca~(2+)上升，最终导致细胞的损伤。离子型谷氨酸受体包括NMDA受体和非NMDA受体，后者又可分为AMPA受体和KA受体；其中NMDA受体在脑损伤中的作用受到关注。ROS(reactive oxygen species)包括超氧阴离子(superoxide anion)，羟自由基(hydroxyl radical)，过氧化氢(hydrogen peroxide，H_2O_2)等。ROS的毒性作用包括脂质过氧化物(lipid peroxidation)的形成，线粒体呼吸链酶的抑制，膜Na~+-K~+-ATPase的抑制，以及其它蛋白的氧化修饰作用。其中H_2O_2通过Fenton reaction与铁、铜等金属离子发生反应，产生羟自由基(hydroxyl radicals，OH)产生毒性作用。 本实验室已经建立了离体脑片缺血模型，为了在脑片水平更深入研究脑损伤的机制。首先，必须完善制备海马脑片的方法，制备能够维持海马长时间活性的浴槽，以及建立海马脑片的细胞外电生理等方法。本研究建立海马脑片制备、浴槽设计以及细胞外电生理等方法；在此基础上，建立海马脑片缺血模型和观察药物治疗作用的方法；最后初步探讨了H_2O_2对海马脑片损伤作用的机制以及自由基损伤与兴奋性毒性之间的关系。通过本研究，希望能够为今后更深入研究海马脑片生理、药理特点打下坚实的基础，另外能够阐明H_2O_2致脑损伤的特点，为今后开发抗脑损伤药打下必要的基础。 1、海马脑片研究方法学的建立浙江大学硕士学位论文 大鼠断头取脑切片，所有的过程均在冰冷的状况下操作。用巴斯德管和沾有脑脊液的毛笔转移海马脑片，避免外界物质直接接触造成海马损伤。将制备好的海马脑片转移至气－液交界式浴槽。气－液交界式浴槽包括内室和外室。内室主要为嵌入体，用于放置海马脑片。外室主要作用是用预热的水蒸汽湿化脑片，并提供足够的氧气。本实验设计的浴槽有两个显着的特点：一方面是气－液交界的方式，可以保证脑片有充分的氧气供应。另一方面，脑片周围充分的液体交换，可以保证代谢产物的排泄。通过减少嵌入体上的尼龙网与底部的距离代替减少内室的直径，缩小内室的体积，最终加快了脑片周围的液体交换速度。另外用流入口和流出口分别位于其直径的1／3处来代替设置在两边，也可以加快脑片周围的液体交换速度。利用电生理、生化、形态方面来验证浴槽的可行性。细胞外电生理结果表明，稳定sh和lh的海马脑片相比较，海马脑片的 CA区锥体细胞记录到的群峰电位没有显着差异。TTC染色结果表明，在稳定lh与8 h之问保持平稳，OD。。。值分别为0二44 士 0刀2和0二35 上 0刀3，两者之间没有显着的差异。电镜检查结果表明，经稳定sh后的脑片锥体细胞，细胞核呈圆型或椭圆型：核与胞浆比例较大：核内常染色质呈颗粒状均质分布，异染色质量少；突触结构清晰：与稳定lh后的脑片锥体细胞核以及突触比较没有显着的差异。甲苯胺蓝染色结果表明，经稳定吕卜后的脑片锥体细胞有规则地紧密排列，细胞大而明显，膜完整而光滑，胞体呈椭圆型，细胞中央有一个大而圆的细胞核，核异染质量少；与稳定lh后的脑片锥体细胞比较没有显着的差异。这些结果证明本装置可以至少sh内保持海马脑片的活性。 2、缺氧缺糖诱导大鼠海马脑片电生理改变以及药物作用 利用我们设计的浴槽与细胞外电生理方法，来观察缺氧缺糖（oxygen and glucosedeprivation，OGD）对海马脑片群峰电位的影响。OGD 4 min，恢复供氧和葡萄糖 lh后 PS波幅上升至 OGD前的（29．4士 6．2）％，OGD 7 min，恢复 lh后 PS波幅上升至 OGD前的（17．2士 6．l）％；缺氧缺糖 10 min，恢复 lh后 PS波幅没有回升。因此，选择 4 min OGD损伤模型来观察药物的作用。 氯胺酮 10和 100 mpol／L明显地提高 PS波幅的恢复程度，分别达到（82．8士 11．8）％和（69二士 10）％。依达拉奉1和10pmol／L明显增强PS波的恢复程度，分别达到（56土门．l）％和（69．1 士 12．2）％；但 0．l卜mol／L没有显示效果。ONO－10781 apol／L没有影响OGD脑片损伤，其恢复程度为（33．89土 9．8）％，与对照组（29．4士 6．2）o没有显着差异；米诺环素 10卜mol／L也没有明显影响，其恢复程度为（24．3士 3．l）％，与对照组无显 2浙江大学硕士学位论文着差异。这些结果表明，电生理检测可以评价海马脑片缺血性损伤以及药物作用，并发现NMDA受体桔抗剂氯胺酮及自由基清除剂依达拉奉有保护作用，而抗炎药米诺环素和白叁烯受体桔抗剂ONO－1078无效。 3、脑片HZOZ损伤的初步探讨 利用细胞外电生理法和脑片透光法，初步探讨H。OZ在脑片损伤中的作用。结果发现，HZO。对 PS波的影响呈浓度依赖关系。给予 H。O。4 mmol几处理脑片 15 min，15 min后引起 PS波幅轻微的降低，至给药前的 （7．8士 门．2）％；
李晨[2]2002年在《Ginkgolide B对低氧时大鼠海马脑片内源性神经递质释放的影响》文中认为背景 低氧是描述组织氧供不足的通用术语。低氧条件下，作为神经细胞执行其功能活动和神经元之间主要通讯方式的神经递质和一些信使分子参与了低氧致损神经元的过程。已知细胞膜脂质代谢过程的产物之一PAF在脑组织血供和氧供不足时水平明显升高。研究者们在筛选和寻找防治缺血缺氧性脑损伤的过程中，已经确实证明了天然银杏叶的组分之一Ginkgolide B是一种强有力的高特异性天然PAF受体拮抗剂，可与位于突触前膜的特异性PAF受体结合。因此，Ginkgolide B的神经保护作用很可能或至少部分是由于它可以与突触前膜的PAF受体结合而抑制谷氨酸等神经递质的释放。已有较多的在体实验研究证实了Ginkgolide B具有对抗神经元损伤的作用，但迄今很少有其具有直接的神经保护作用的证据。另一方面，目前关于Ginkgolide B对某些神经递质的释放有作用的研究报道大多基于某些脑区或核团中神经递质总含量即静态含量的测定，鉴于细胞外液和突触间隙中兴奋性氨基酸浓度过度增高和Ca~(2+)参与的受体过度激活被普遍认为是造成神经元死亡的“最后公路”，神经递质的静态总含量的测定事实上很难反映细胞外液中神经递质的水平及功能。 目的 1进一步探讨低氧对海马内源性神经递质释放的影响； 2观察低氧时诲马神经元细胞外液中神经递质含量的变化； 3评价细胞外液中Ca~(2+)在海马神经元内源性递质释放中的作用； 4研究Ginkgolide B对低氧时海马神经递质释放的影响，为其是否具有直接的神经保护作用提供实验依据。 方法 1利用海马脑片体外存活技术，建立大鼠离体海马脑片的急性低氧模型。低氧条件为向脑片孵育液中通入95％N_2/5％CO_2混合气体，低氧时间为10min。 2用反相高效液相色谱结合紫外检测法和电化学检测法测定海马脑片孵育液中氨基酸类神经递质和单胺类神经递质的含量。 3实验采用随机区组设计，动物随机分为叁组，各组动物制备的海马脑片分别进行叁种不同介质的灌流实验，即正常介质组、高K~+去极化组和无Ca~(2+)组；各组中由同一只动物制成的海马脑片再随机分到叁个不同的处理组，即：正常对照组、低氧组和Ginkgolide B预孵育组。海马脑片神经递质的基础释放量测定样本取自正常介质组；去极化释放量为高K~+刺激时的释放量，样本取自高K~+去极化组。共安排9种不同条件的实验。 4采用SPSS10．0和SAS6．12进行致据处理。用随机区组设计的方差分析进行总体均数 的差异显着性比较，组间比较用hD法和SNK法；不同神经递质之间的相关性分析用 Pearson相关分析法；不同孵育条件下同种处理组间比较用 Stwm’lt检验。 结果 氨基酸类递质 1低氧对海马脑片孵育液中氢基酸水平的影响 低氧时脑片孵育液中除Gn和Ala外，其余氨基酸的水平均卅高（Pd N），口豆U和GAB A 上升幅度最为明显，与对照组相比分别升高38．6％和126．0％。 2氨基酸基础释放量和去极化释放量比较 ①正常供氧条件下，除TaU外，海马脑片孵育液中各种氨基酸递质的去极化释放量与 基础释放量相比均升高：其中八甲（Pd．05）、GIU（P＜0．of）、GABA（P＜（．of）、la（Pd．05） 的去极化释放与基础释放量相比差异有显着性，分别升高52．4t，52．p，176．2％，33．0％。 Tau的去极化释放量低于基础释放量（Pd．of），降低了 18．7％． ②低氧条件下（向海马脑片孵育液中通人 95％Nof％COZ ＃＃＼体 l（h），高义刺激 对海马内源性氨基酸递质的释放影响较小：Gly和Tau的去侵化释放量大于基础释放量 （P＜（．05），分别升高 31．7％，44．l％，其余氨基酸的去极化释放量与基础释放量相比差异 无显着性（P＞（．05）。 3 C／”依赖性和非 Ca’”依赖性释放 ①正常供氧条件下去除脑片孵育液中的＊”后，海马脑片孵育液中Gn、Tl、Gly水 平与对照组相比分别降低38．4％，12．7％，14．0％，差异有显着性（P＜（．of，P＜（．of，P＜0．05）。 AsP、Gin、Asn、GABA、la的水平与对照组相比差异无显着性（PX）．05）。 ②低氧条件下去除孵育液中的CJ循，GABA水平与对照组相比降低32．4％，差异有 显着性（P＜0刀5）；Gb水平与对照组相比降低15．0％，差异显着（Paos）；其它氨基酸水 平在两种介质中差别无统计学意义（PX．05），其中AsP、Gill水平有升高趋势，但统计学检 验差异无显着性o劝．05）。 4 Pearson相关分析结果显示，叁种不同介质中海马脑片释放到孵育液中中各种氨基酸 呈现不同程度的相关性（一0．05，双侧检验）。每两种氨基酸之伺的相关性因孵育介质不同 而异。 5 MOlide B对低氧脑片孵育液中氨基酸水平的影响
华骏[3]2017年在《白果内酯对缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理脑卒中是当前全球第叁大致死类疾病,仅次于心血管疾病和癌症,而在我国,脑卒中已成为最主要的致死因素,也是导致重度、慢性成人残疾的主要原因,严重危害人类的生命与健康。根据其临床发病特点不同,可以将脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类。据统计,全球范围内缺血性脑卒中患者约占所有卒中患者的70%,而我国缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85%,死亡率高达50%,存活的缺血性脑卒中患者中约有3/4不同程度地丧失劳动能力或遗留有瘫痪,失语等严重的后遗症。近年来人们致力于研究缺血性脑损伤急性期的神经损伤性级联反应,并在动物模型上已发现很多具有神经保护作用的化合物,但转化后的临床疗效均不太理想。因此,阐明缺血性脑损伤的确切病理机制,提出新的卒中后神经保护策略,研发疗效确切并能让更多患者受益的治疗药物仍然是当前脑卒中治疗亟待解决的问题。此外,由于各种条件限制,能够在缺血性脑损伤"黄金3小时"内接受治疗的患者很少,多数患者在急性期接受保守治疗,损伤后期主要依靠神经营养和神经修复,通过促进机体内在的修复能力尽可能恢复患者的意识、感觉、认知和运动功能,并且这已经成为卒中后护理和治疗的关键所在。因此,发现促进卒中后期神经修复的关键机制和分子靶标,研发理想的恢复期治疗药物也已经成为脑卒中研究领域的热点。细胞自噬与凋亡是目前卒中机制研究比较重要的热门领域。缺血性脑损伤后脑组织主要因供血、供氧不足会发生神经细胞的坏死与凋亡。其中,缺血半影区脑组织主要发生细胞凋亡,一种受多基因严格控制的死亡方式。细胞自噬是机体内在调整稳态的有效机制,缺血缺氧引起的细胞内错误折迭或者不折迭的蛋白、受损的细胞器均需要通过自噬途径被运送至溶酶体降解,不能够及时被清除的病理因素会导致细胞凋亡或死亡。神经细胞在缺血、缺氧情况下激活保护性细胞自噬减少凋亡相关蛋白向线粒体内的聚集,通过减少细胞色素C或Caspase-3的活化从而抑制细胞凋亡。因此,研发可以靶向调节神经细胞保护性自噬并抑制细胞凋亡的药物,能够在缺血性脑损伤早期减少神经细胞死亡,减轻神经功能损伤。银杏是一种有着较早文献记载并具有重要药用价值的天然植物,在我国作为药用已有五千多年的历史,长期应用于防治心血管疾病,抗老防衰,抗癌和提高自身免疫力等方面。研究表明,银杏叶和银杏果中含有多种药用成分可用于多种疾病的防治,成分主要是银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯(bilobalide,BB)。其中白果内酯是从银杏叶中提取出的唯一一种倍半萜内酯,具有抗兴奋性毒性、抑制氧化应激损伤、抗炎以及抗血小板聚集等作用,主要以与其他银杏叶提取物联合制剂的形式应用于脑血管相关疾病的临床治疗。目前白果内酯含量较高的制剂是用于脑部、周围血流循环障碍的银杏叶提取物注射液金纳多(白果内酯含量约占标准提取物的2.9%);另有金阁莱(?)银杏内酯注射液,其中白果内酯含量高达48%,主要用于缺血性脑卒中恢复期脑梗死适应症的治疗。然而,尽管临床应用表明含白果内酯的混合制剂对脑卒中具有较好的疗效,但其具体有效成分不明,白果内酯单体对缺血性脑卒中急性期和恢复期的疗效和确切机制也不清楚,因此也限制了其在缺血性脑损伤及适应症治疗中的应用。本课题在前期研究发现含有白果内酯的银杏内酯注射液能够减轻缺血性脑卒中急性期损伤的基础上,进一步研究白果内酯对小鼠大脑中动脉阻塞(transient Middle Cerebral Artery Occlusion,tMCAO)形成的局灶性缺血性脑损伤急性期和恢复期神经损伤及其神经功能恢复的治疗作用,并阐明其相关机制。第一部分白果内酯对缺血性脑损伤急性期神经保护作用及其与自噬的相关性目的:建立小鼠缺血性脑损伤再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)模型,研究白果内酯对急性期神经损伤的保护作用,及对神经元自噬和凋亡的调节,为深入阐明白果内酯的作用机制并拓展其临床应用积累学术基础。方法:(1)参考Longa法制备小鼠tMCAO模型,于缺血1h、血流再灌注6h后分组给予金纳多(10 mg/kg),3.5 mg/kg,7 mg/kg和14 mg/kg白果内酯(BB,i.p.,bid)治疗。血流再灌注72h后神经功能评分,处死取材TTC染色,脑含水量测定。(2)制备小鼠tMCAO模型,并选取最小有效剂量7 mg/kg BB于血流再灌注6h后给药,再灌注72h后处死分别取组织脑片和缺血半影区脑组织,利用免疫组织化学方法标记缺血半影区NeuN+神经元,免疫荧光测定自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3与神经元的共标情况,Western Blot法分别对缺血半影区组织LC3,p62,Beclin1,BcL-2,Bax和Cleaved-Caspase 3等指标进行检测。(3)离体培养神经元细胞株N2a经离体氧糖剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)3h后,分别复糖复氧(Reoxygenation)0、3、6、12 和 24h,Western Blot 法分别检测胞内 LC3、p62、Beclin1、BcL-2、Bax和Cleaved Caspase-3等蛋白水平,观察复糖复氧后不同时间点自噬和凋亡的水平,并选择合适复糖复氧时间。(4)N2a细胞OGD3h后,用含不同浓度BB(0.01、0.1、1、10、25和50 μM)的完全培养基复糖复氧24h,MTT法评价药物对细胞活力的影响。(5)N2a细胞OGD 3h后,用含有1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用Western Blot法分别进行自噬相关蛋白LC3、p62和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3等指标进行检测。(6)N2a细胞OGD 3h后,同时给予细胞含2.5 mM自噬抑制剂3MA和1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用流式细胞仪和Western Blot法检测细胞凋亡。结果:(1)BB(7,14mg/kg)能够减少小鼠脑梗死体积,降低神经功能评分和脑含水量。(2)7 mg/kg BB能够减少tMCAO模型后小鼠缺血半影区神经元的丢失。(3)7 mg/kg BB能够升高模型72h后小鼠缺血半影区脑组织LC3荧光表达并抑制Cleaved Caspase-3荧光表达,其中LC3与Cleaved Caspase-3荧光都与神经元细胞有部分共标。(4)7 mg/kg BB治疗能够降低小鼠缺血半影区脑组织凋亡相关蛋白Bax,Cleaved Caspase-3,自噬底物蛋白p-62蛋白的表达,并升高BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达。(5)N2a细胞OGD/R后3h自噬水平较对照组升高,并随着时间推移细胞自噬水平下降,而细胞凋亡水平上升。(6)WB结果显示,BB促进复糖复氧24h后N2a细胞BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达,并降低Bax,Cleaved-Caspase 3,自噬底物蛋白p-62蛋白表达。(7)自噬抑制剂3MA能够部分取消BB对Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达的抑制作用;流式细胞术结果显示白果内酯能够减少处于早期凋亡和晚期凋亡及坏死的细胞数目,而3MA部分取消BB对N2a细胞凋亡的抑制作用。结论:自噬参与白果内酯对缺血性脑损伤急性期的神经保护作用。第二部分白果内酯对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节及其机制目的:研究BB对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节作用,阐明其对成体神经干细胞增殖、分化等功能的影响与机制,为揭示其脑卒中恢复期用药的促神经修复功能提供直接的实验依据。方法:参考Longa法制备小鼠I/R损伤模型,缺血1h、血流再灌注24h后利用神经功能评分进行模型筛选,将模型成功小鼠随机分为模型对照组(Vehicle组),白果内酯3.5 mg/kg、7mg/kg和 14mg/kg给药组(BB 3.5 mg/kg,7 mg/kg,14 mg/kg,i.p.,bid),给药14天和42天分别进行内源神经干细胞增殖和分化相关实验:(1)统计术后各组小鼠死亡率和体重,并分别于术后1、3、7、14、28和42天进行神经功能评分,3、7、14、28和42天进行踏空测试,于术后14和28天进行转角和转棒测试,分别记录小鼠足失误次数、右转率和从转棒滑落时间,评价BB对I/R损伤恢复期小鼠神经感知、运动功能的影响。(2)术后38-42天对小鼠进行Morris水迷宫测试,评价BB对小鼠空间学习与记忆能力的影响。(3)利用小动物MRI-T2加权成像技术在术后24h、7d、14d和42d在体观察模型及14mg/kgBB治疗组小鼠脑组织损伤情况。(4)术后12-13天给予小鼠腹腔注射 BrdU(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Sigma;50 mg/kg,连续给药4次,给药间隔为12h)标记S期增殖细胞,术后14天用于研究干细胞增殖的小鼠灌注取脑,完成BrdU免疫组化,评价干细胞增殖情况;用于研究干细胞分化的小鼠于术后42天灌注取脑,完成BrdU/NeuN免疫荧光,评价干细胞向神经元定向分化的情况;同时,为探讨药物对神经再生调节的机制,离体实验培养成体神经干细胞研究药物对干细胞存活、增殖和分化的影响,并初步探讨其作用机制。(5)离体培养成体神经干细胞(Adult neural stem cells,ANSCs),利用MTT和细胞计数法分别观察OGD/R和不同浓度BB(0.01、0.1、1、10和50 μM)给药对神经干细胞细胞活力和自我更新的影响。(6)利用BrdU免疫荧光标记法和流式细胞术评价BB对干细胞增殖和细胞周期的影响。(7)利用免疫荧光标记法观察OGD/R7天后神经干细胞向神经元(Tuj-1)和星形胶质细胞(GFAP)分化的比率以及不同浓度BB(0.1、1和10 μpM)对干细胞定向分化能力的影响。(8)检测OGD/R24h后,Western Blot法检测不同浓度BB(0.1,1和10 μM)对细胞p-Akt,p-p38和p-JNK水平的变化影响。(9)利用JNK激动剂茴香霉素(Anisomycin,Anis)预处理干细胞24h后,OGD2h后复糖复氧给予BB和Anis干预7天,免疫荧光法观察OGD/R 7天后BB对神经干细胞向Tuj-1神经元分化的影响。结果:(1)BB(7,14mg/kg)治疗小鼠长期存活率高于I/R模型小鼠,并且BB可以缓解I/R损伤导致的小鼠体重降低。(2)与模型对照组小鼠相比,7和14mg/kgBB治疗组小鼠神功功能显着改善,转角测试中右转率降低,转棒测试中棒上停留时间延长,同时,在踏空测试中踏空率显着降低。(3)Morris水迷宫定位航行测试中,BB能够降低小鼠找到水下平台的时间,同时在空间探索测试中BB能够增加小鼠穿越平台次数,增加小鼠在平台象限穿越的时间及次数。(4)MRI观察到术后24h模型小鼠损伤侧脑组织存在大面积高亮度信号,7天后信号变弱并出现脑组织缺损,14天时组织缺损边缘出现高密度信号,42天组织梗死导致的缺损体积相对固定,而给予14 mg/kgBB治疗能够延迟脑组织缺损的出现并减少梗死导致的脑组织缺损。(5)7mg/kg和14mg/kgBB增加术后14天小鼠SVZ和SGZ神经干细胞的数目和分布范围。(6)7mg/kg和14mg/kg BB增加术后42天小鼠SVZ和SGZ区BrdU+/NeuN+细胞数目。(7)0.1、1、10和50 μM BB能够增加OGD/R后ANSCs细胞活力且能够增加生长7天后神经球直径和个数。(8)BB增加OGD/R后BrdU+的ANSCs数目,并且能够增加处于S期的细胞数目。(9)BB促进OGD/R 7天后ANSCs向Tuj-1+神经元的分化。(10)BB抑制OGD/R后ANSCs内p38和JNK的磷酸化水平的升高,同时升高Akt的磷酸化水平。(11)10 μM JNK激动剂茴香霉素取消BB促进ANSCs向神经元分化的作用。结论:BB促进缺血性脑损伤恢复期神经再生,增强神经功能修复。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.发现白果内酯在I/R模型小鼠急性期的抗凋亡作用与调节自噬相关通过对I/R经典动物模型研究发现,白果内酯对缺血性脑损伤的急性期损伤包括神经运动障碍、脑梗死和脑水肿均具有显着改善作用,并且白果内酯可以促进神经元自噬并抑制神经元凋亡;同时,离体研究证实白果内酯通过促进神经细胞自噬并抑制神经元凋亡。研究为揭示白果内酯在缺血性脑损伤急性期的神经保护作用提供了直接的实验证据,为拓展其在缺血性脑损伤急性期的临床应用积累了重要学术基础。2.发现白果内酯在小鼠缺血性脑损伤恢复期发挥促神经再生作用研究发现白果内酯能改善缺血性脑损伤恢复期神经运动功能,并且能促进内源性神经再生。同时,离体实验确证白果内酯能够促进成体神经干细胞存活、自我更新、增殖和向神经元的分化,并且其对分化的积极作用与其对神经干细胞JNK MAPK通路的抑制作用相关。研究深化了对白果内酯应用于缺血性脑损伤临床恢复期的作用机制的认识,并为推广白果内酯联合制剂和单体制剂在防治缺血性脑损伤中的临床应用提供重要的理论依据。
张目[4]2003年在《钙调蛋白抑制剂叁氟拉嗪抗脑缺血作用与机制研究》文中认为脑缺血是危害人类健康的主要疾病之一，它导致脑功能及脑结构发生不可逆的变化，也是临床上常见的预后较差的一种疾病。如何防治脑缺血损伤引起了基础与临床研究的广泛重视。针对脑缺血损伤的某些环节，寻找切实有效的脑卒中防治药物已成为当今医学领域的重大课题。本文利用离体缺氧模型，研究了钙调蛋白抑制剂叁氟拉嗪的抗缺血机制与作用。 本文应用原代培养海马细胞的缺氧缺糖剥夺模型，通过使用激光扫描共聚焦显微技术和荧光标记技术，对缺氧过程中神经细胞的NO和钙离子变化进行了实时动态的检测。结果表明缺氧过程中，细胞内NO的合成和钙离子浓度有显着升高，NO和钙离子荧光的升高值分别为62％和174％；这种升高在去除细胞外液的钙离子后受到明显抑制，表明缺氧时胞内钙离子的增加主要来源于胞外的钙离子。 在培养海马细胞的缺氧缺糖剥夺模型中，钙调蛋白抑制剂叁氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)对缺氧导致的钙离子升高有明显的抑制作用，10μM和50μMTFP能够使缺氧诱导的细胞内Ca~(2+)的荧光升高降低56.4％和72.6％；TFP还能剂量依赖性抑制缺氧诱导的NO合成，50μMTFP能够明显抑制缺氧时细胞内NO合成的增加(P＜0.01)。由于通过NMDA受体内流的Ca~(2+)被认为在脑损伤中起重要作用，我们研究TFP对Glu诱发的Ca~(2+)升高的影响。结果表明TFP能够显着地抑制谷氨酸诱导的胞内Ca~(2+)的升高。这一结果也显示TFP可能通过作用NMDA受体来抑制缺氧时的钙离子升高。 采用海马脑片离体缺氧模型，我们观察了缺氧导致的兴奋性神经递质天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)与抑制性神经递质牛磺酸(Tau)、Y-氨基丁酸(GABA)的含量变化以及TFP对这些氨基酸变化的影响。实验表明：缺氧能促进海马组织各氨基酸的释放，而TFP可以显着降低由缺氧引起的兴奋性氨基酸的释放。 为了探讨TFP在缺氧损伤中对神经细胞的保护作用，我们采用神经电生理技术，从电生理角度研究了TFP在海马组织缺氧灌流中的保护作用。结果发现TFP可以降低缺氧损伤电位(HIP)的出现率，提高复氧后脑片群峰电位(PS)的恢复率和恢复程度；我们还应用WST—1法，研究了TFP对培养海马神经细 廊江大学尊士学哎讼文胞缺氧缺糖后活性的影响，发现用TFP作用后，细胞液的OD值比缺氧缺糖组有显着升高（P＜0．05）。以上结果表明 TFP在缺氧损伤中对神经细胞有明显的保护作用。 本论文研究了钙调蛋白抑制剂的抗缺血机制与作用，结果表明TFP对缺血过程中兴奋性氨基酸释放、细胞内Ca卜升高和NO合成有明显的抑制作用：TFP可能通过这些途径减轻缺氧对神经细胞的损伤，起到保护神经细胞的作用。本研究为脑缺血的病理研究与临床治疗提供了新的思路，为抗脑缺血药物的开发提供了新的筛选平台。
郝鹏[5]2017年在《NT3-壳聚糖活性材料支架诱导内源性神经发生修复成年大鼠脑损伤的研究》文中研究说明目的:明确NT3-壳聚糖载体能否促进创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后损伤区内新生神经元的产生,并探讨这些新生神经元能否功能性整合入脑环路以修复脑功能;观察TBI及NT3-壳聚糖对内源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的激活情况,阐明NT3-壳聚糖对海马齿状回(dental gyrus,DG)颗粒细胞下层(subgranular zone,SGZ)和侧脑室室旁区后部(posterior periventricle,pPV)NSCs的增殖、迁移和神经向分化的影响;探讨NT3-壳聚糖能否改善损伤区的微环境。方法:应用自制的脑吸除装置制备成年大鼠吸除性脑损伤模型,损伤范围为海马CA1区及以上皮质,术后立即向损伤区植入含或不含有神经营养因子3(neurotrophin 3,NT3)的壳聚糖载体,实验分为单纯壳聚糖组和NT3-壳聚糖载体组,同时设假手术组(只打开骨窗,不接受TBI手术)和损伤对照组(接受TBI手术,但术后不给予任何治疗措施)。HE染色观察各组脑组织再生情况;大鼠术后立即腹腔注射BrdU以标记增殖的细胞,BrdU/Tuj1和BrdU/NeuN染色检测术后不同时间点损伤区新生神经元的再生,同时应用vGluT1和GAD67染色观察损伤区内不同类型神经元的再生;BrdU/Tuj1/synapsin1和PSD95免疫荧光标记及MAP2免疫电镜检测损伤区内新生神经元之间的突触形成;MED64平面微阵列记录系统检测损伤区内新生神经元之间及新生神经元与宿主脑之间的功能性神经网络形成;BDA神经示踪观察再生神经元在海马内的神经环路重建;morris水迷宫评价大鼠的空间学习记忆功能。为了检测不同脑区nscs的增殖,大鼠灌流前48小时开始腹腔注射brdu,于术后不同时间点观察并计数海马dg不同亚区和ppv区增殖细胞的数量;brdu/neun/gfap免疫荧光叁标记检测dg增殖细胞的命运;brdu/dcx免疫荧光染色及dil体内标记观察sgz和ppv增殖nscs的迁移。cd45和cd11b染色观察nt3-壳聚糖对tbi后巨噬细胞和小胶质细胞的影响,实时定量pcr检测脑内促炎和抗炎因子的表达水平,reca-1染色观察损伤区内的血管再生。结果:1.brdu/tuj1和brdu/gfap/neun染色结果显示,nt3-壳聚糖能够促进损伤区内成熟神经元的再生,同时抑制胶质反应,并且新生神经元包含谷氨酸能神经元和gaba能神经元。2.brdu/tuj1/synapsin1和psd95免疫荧光染色及map2免疫电镜结果显示,nt3-壳聚糖促进损伤区内新生神经元之间的突触形成。med64进一步证明,nt3-壳聚糖促进新生神经元之间及新生神经元和宿主脑之间功能性神经网络的建立。bda神经示踪结果显示,新生神经元可重建受损的海马环路。3.morris水迷宫结果表明,nt3-壳聚糖可以改善损伤后期大鼠的认知功能,同时恢复海马内schaffer侧支-ca1突触的ltp特性。4.brdu/nestin染色结果显示,nt3-壳聚糖可激活内源性nscs,并促进它们向损伤区的迁移。5.brdu染色结果显示,tbi增加损伤同侧dgbrdu+细胞数,nt3-壳聚糖进一步增加tbi所致的增殖反应,术后各时间点损伤同侧nt3-壳聚糖组的增殖细胞均多于单损组。对dg增殖细胞的分布分析结果显示,术后不同时间点nt3-壳聚糖组和单损组brdu+细胞大部分仍位于神经发生区sgz区,且nt3-壳聚糖组阳性细胞数多于单损组,其余细胞分布于dg非神经发生区即分子层和门区。6.brdu/dcx染色结果显示,nt3-壳聚糖增加sgzbrdu+/dcx+细胞数,同时增加BrdU+/Dcx+细胞的比例,说明NT3-壳聚糖不仅增加SGZ新生成神经细胞的数量,而且增加成神经细胞在增殖细胞中的比例。BrdU/NeuN/GFAP免疫标记显示,NT3-壳聚糖促进DG增殖细胞的存活,同时增加DG新生颗粒神经元的数量,促进DG神经发生。7.BrdU/Dcx染色结果表明,NT3-壳聚糖促进SGZ NSCs向损伤区的迁移。8.BrdU染色结果显示,NT3-壳聚糖增加TBI所致的损伤同侧pPV NSCs的增殖,BrdU/Dcx免疫染色和Dil体内标记实验显示,NT3-壳聚糖促进室周区NSCs向损伤区的迁移,损伤区内检测到的Dil+细胞部分表达NSCs标记物nestin,部分表达成神经细胞标记物Dcx,说明室周区NSCs可能参与了损伤区新生神经元的再生。9.CD45和CD11b染色结果显示,NT3-壳聚糖抑制损伤区内巨噬细胞的浸润和小胶质细胞的激活,同时恢复损伤周围脑组织不同状态小胶质细胞的比例。实时定量PCR结果显示,NT3-壳聚糖抑制TBI后促炎因子IL-1β和TNF-α的表达,同时增加抗炎因子IL-4和IL-10的水平,提示NT3-壳聚糖的抗炎作用。10.Reca-1荧光染色结果提示,NT3-壳聚糖促进损伤区内的血管再生,增加损伤区再生血管的密度和直径。结论:NT3-壳聚糖载体通过持续释放NT3神经营养因子,显着激活SGZ和pPV内源性NSCs,并促进它们向损伤区的异位迁移。同时该生物活性材料为损伤区提供了一个抗炎和促血管再生的微环境,有利于迁移至损伤区的NSCs分化为成熟的神经元,并建立功能性神经网络,进而修复受损的脑功能。这些结果为NT3-壳聚糖活性生物材料修复成年脑损伤的临床应用提供了理论基础和实验依据。
周小勤[6]2015年在《UC-MSCs通过IL-8促进大鼠神经功能修复的实验研究》文中研究表明第一部分人脐带间充质干细胞基本生物学特性鉴定目的通过体外培养hUC-MSCs,鉴定其表面标志和神经分化能力,明确hUC-MSCs的基本生物学特性,为后续研究奠定基础。方法体外培养hUC-MSCs,倒置显微镜下观察不同培养代次(P2,P10,P15代)的细胞形态；通过染色体显带技术进行染色体核型分析,明确不同培养代次的hUC-MSCs染色带型稳定性；通过流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC、CD34、 CD45和HLA-DR;在诱导神经分化方面,采用浓度为1 μmol/L的ATRA进行预诱导,然后利用改良成神经诱导液MNM进行神经分化诱导24h,得到神经分化状态的1UC-MSCs(用Dif表示),撤掉MNM诱导液24h后,再次给予MNM诱导24h得到神经再分化状态的hUC-MSCs(用Re-Dif表示),倒置显微镜观察hUC-MSCs,Dif和Re-Dif细胞形态；采用Western Blotting和Real-time PCR检测hUC-MSCs,Dif和Re-Dif叁组细胞神经标志物NSE、MAP2、β-tubulinⅢ表达情况。结果(1)hUC-MSCs的培养及扩增：hUC-MSCs具有hMSCs的形态特征,细胞贴壁旋涡状生长,呈扁平梭形或细长针尖样,培养15代内均能保持干细胞的形态特征,细胞增殖能力较强,传代后3-4天可长满。(2)hUC-MSCs染色体显带分析：体外培养至第2代、第10代以及第15代的hUC-MSCs,染色体显带结果无异常,细胞传代至第15代仍能保持正常的染色体带型,不会发生染色体畸变。(3)hUC-MSCs流式技术鉴定：培养第3代的hUC-MSCs,99%以上的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC,阴性表达造血干细胞标志CD45和免疫原性标志HLA-DR。(4) hUC-MSCs神经分化、再分化诱导后形态变化：hUC-MSCs经神经分化诱导24h后,细胞形态较未经诱导的hUC-MSCs无明显变化,细胞仍呈现hMSCs的形态特征,细胞扁平呈梭形,旋涡状生长。但hUC-MSCs经神经再分化诱导24h后,细胞形态发生明显变化,呈现神经元样细胞形态,胞体收缩变圆而亮,细胞有单极或多极突起,部分突起连成网状,神经诱导率可达80-90%。(5)hUC-MSCs神经分化、再分化诱导后神经标志物表达情况：Real-time PCR结果显示,Dif组和Re-Dif组NSE、MAP2、 β-tubulinⅢ的表达均高于hUC-MSCs组,且Re-Dif组的表达高于Dif组,差异具有统计学意义(**P<0.01,***P<0.001, one-way ANO VA); Western Blotting检测结果与Real-time PCR结果一致。结论(1)hUC-MSCs具有hMSCs的形态特征和表面标志,细胞增殖能力较旺盛。(2)hUC-MSCs具有很好的生物学稳定性,体外多次传代不会对细胞染色体带型造成影响。(3)hUC-MSCs具有神经分化和再分化潜能,再分化hUC-MSCs较分化的hUC-MSCs表达更高的神经标志物。第二部分hUC-MSCs及分化、再分化hUC-MSCs移植测HIBD模型大鼠的神经修复作用目的利用新生SD大鼠建立HIBD模型,在体研究hUC-MSCs,分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠的神经保护作用。方法将134只7日龄健康SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=27)和HIBD造模组(HIBD组,n=1 07)；HIBD组大鼠行经典Rice法双结扎并离断左侧颈总动脉,并给予缺氧处理2.5h。Sham组大鼠仅分离并暴露左侧颈总动脉,但不结扎和离断也不给予缺氧处理；在建模后5d,将HIBD组实验大鼠随机分为PBS组(11=34)和细胞移植组(n=73),细胞移植组分为：未分化hUC-MSCs移植组(hUC-MSCs组,n=34),分化hUC-MSCs移植组(Dif组,n=21)和再分化hUC-MSCs移植组(Re-Dif组,n=18)；各组大鼠麻醉后固定,在脑立体定位仪指引下行颅内注射,每只实验大鼠给予细胞悬液量为5μL,细胞数量为2x105个,PBS组只给予5gL灭菌PBS颅内注射；细胞移植后2d,左侧脑组织石蜡切片行HE染色；颅内注射后1月,Morris水迷宫检测实验大鼠的学习记忆功能,Object-in-place行为学实验检测各组大鼠对新事物的探索能力,膜片钳记录实验大鼠海马脑片CA1区长时程增强电位情况。结果(1)hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠脑组织病理形态的影响：通过HE染色,HIBD组大鼠侧脑室周围脑组织疏松,呈现弥散状态,细胞核固缩呈空泡状。而经hUC-MSCs移植后,侧脑室周围脑组织较紧密,细胞核固缩、空泡情况较HIBD组改善,但仍达不到Sham组正常大鼠的脑组织形态特征。(2)hUC-MSCs移植对HIBD大鼠学习记忆功能的影响：Morris水迷宫实验发现,在第1d可见平台测试中,Sham (n=9), HIBD (n=18)和hUC-MSCs (n=17)叁组大鼠找到平台所用时间和距离没有统计学差异,提示HIBD建模和细胞移植不会对大鼠的运动和视觉能力造成影响。第2-5d定位航行训练中,Sham, HIBD和hUC-MSCs叁组大鼠找到平台所用时间均随着训练天数的增加而降低。HIBD组找到平台所用时间较Sham组明显增加,差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, Sham vs. HIBD, one-way ANOVA),而hUC-MSCs移植后,hUC-MSCs治疗组找到平台所用时间较HIBD组明显缩短,差异具有统计学意义(#P<0.05,HIBD vs. hUC-MSCs, one-way ANOVA)。第6d平台探索实验,hUC-MSCs治疗组找到平台次数明显多于HIBD组,但是仍少于Sham组(***P<0.001, Sham vs. HIBD;*P<0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. hUC-MSCs)。(3) hUC-MSCs移植对HIBD大鼠新事物探索能力的影响：通过Object-in-place行为学实验,发现HIBD组(n=8)大鼠对新事物的探索能力明显低于Sham组(n=9),差异具有统计学意义(***P <0.001, Sham vs. HIBD)。而hUC-MSCs移植组(n=8)较HIBD组大鼠对新事物的探索能力明显提高,差异具有统计学意义(*P<0.05, HIBD vs. hUC-MSCs)。(4) hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠海马脑片电生理功能的影响：通过膜片钳检测,发现Sham组,HIBD组和hUC-MSCs组实验大鼠海马脑片CA1区兴奋性突触后电位(fEPSPs)斜率在高频刺激(HFS)前20min的基线水平无差异,给予HFS刺激后,叁组海马脑片fEPSPs斜率值均不同程度增加。HFS刺激后30min,HIBD组(110.1%±11.7% of baseline,n=5) fEPSPs斜率增加值明显低于hUC-MSCs移植组(153.1%±17.5% of baseline, n=6)和Sham组(167%±21.8% of baseline, n=6),差异具有统计学意义(*P<0.05, HIBD vs. hUC-MSCs;***P<0.001, HIBD vs. Sham)。(5)分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠学习记忆功能的影响：通过Morris水迷宫实验,在第1d可见平台测试中,hUC-MSCs组(]n=17),Dif组(n=12)和Re-Dif组(n=10)叁组实验大鼠找到平台所用时间和距离没有统计学差异,说明叁组间具有可比性。第2-5d定位航行训练中,叁组大鼠找到平台所用时间无统计学差异(P>0.05, one-way ANOVA)。第6d平台探索实验,尽管Dif组和Re-Dif组找到平台次数较hUC-MSCs组多,但差异仍不具有统计学意义(P>0.05, one-way ANOVA)。(6)分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠新事物探索能力的影响：通过Object-in-place行为学实验,发现Dif组(n=9),Re-Dif组’(n=8)和hUC-MSCs组(n=8)叁组大鼠对新事物的探索能力相当,叁组间差异无统计学意义(P>0.05, one-way ANOVA)。结论(1)hUC-MSCs移植可减轻HIBD模型大鼠脑组织病理形态改变。(2)hUC-MSCs移植可提高HIBD模型大鼠的空间学习记忆能力和对新事物的探索能力。(3)hUC-MSCs移植可以提高HIBD模型大鼠海马CA1区长时程增强电位。(4)hUC-MSCs、分化及再分化hUC-MSCs叁种状态的细胞移植,都能促进HIBD模型大鼠空间学习记忆能力的恢复和提高大鼠对新事物的探索能力,但分化及再分化hUC-MSCs移植并没有较未分化的hUC-MSCs体现更大的神经修复潜能。第叁部分hUC-MSCs通过IL-8促进HIBD模型大鼠学习记忆功能恢复第一章全基因表达谱芯片明确hUC-MSCs在神经分化、再分化过程中可能的分子机制目的运用全基因表达谱芯片阐明hUC-MSCs在神经分化和再分化过程中的具体分子机制；同时,揭示hUC-MSCs发挥体内修复作用的可能机制。方法利用Affymetrix U133真核生物全基因表达谱芯片检测hUC-MSCs、Dif及Re-Dif叁种细胞的全基因表达情况；采用聚类分析对叁组细胞的差异基因表达模式进行分析；通过GO生物学分析软件,分析差异基因参与的具体生物学功能；通过KEGG-pathway分析,明确差异基因参与的信号通路情况；通过对常见细胞因子基因表达情况分析,明确hUC-MSCs表达细胞因子情况。结果(1)Affymetrix U133真核生物基因表达谱芯片检测hUC-MSCs、Dif、Re-Dif叁组细胞全基因表达模式：hUC-MSCs组基因表达模式与Dif组和Re-Dif组差异较大,呈现几乎对立的表达模式,而Dif组和Re-Dif组基因表达模式较接近。(2)hUC-MSCs、Dif、Re-Dif叁组细胞连续变化的差异基因聚类分析：hUC-MSCs、Dif和Re-Dif叁组中连续递增和连续递减的差异基因一共有483个,对这483个差异基因进行聚类分析,结果显示hUC-MSCs向Dif组分化以及向Re-Dif组再分化是一个连续变化的过程,其中Dif组处于中间过渡状态,而Re-Dif组呈现和hUC-MSCs组几乎完全对立的基因表达情况。(3)叁组细胞连续变化的差异基因GO生物学功能分析：这483个差异基因主要参与的生物学功能包括信号转导、发育、负性细胞增殖、细胞周期、缺氧反应、神经系统发育、细胞分化以及炎症反应。(4)hUC-MSCs、 Dif、Re-Dif叁组细胞连续变化的差异基因KEGG-Pathway分析：hUC-MSCs进行神经分化和再分化过程中有众多信号通路参与,主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用、P53信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路等,其中细胞因子-细胞因子受体相互作用是统计学差异最大的信号通路(P=-2.65E-10)。(5)全基因表达谱芯片检测hUC-MSCs细胞因子基因表达情况：hUC-MSCs表达许多细胞因子和趋化因子基因,TIMP-1、IL-8、CXCL1、TIMP-2、IL-1p、MCP-1、VEGF等细胞因子在hUC-MSCs中高表达。结论(1)hUC-MSCs与神经分化和再分化状态的hUC-MSCs具有不同的基因表达模式,而分化和再分化两种状态细胞的基因表达模式较相似。(2)hUC-MSCs进行神经分化和再分化诱导是一个动态变化的过程,再分化的hUC-MSCs较分化的hUC-MSCs呈现更成熟的终末基因表达状态。(3)hUC-MSCs进行神经分化和再分化诱导时,细胞因子参与的信号通路可能在其中发挥了主要作用。(4)TIMP-1、IL-8、 CXCL1、TIMP-2、IL-1β、MCP-1、VEGF等细胞因子可能与hUC-MSCs发挥治疗作用有关系。第二章hUC-MSCs分泌IL-8激活,INK信号通路促进HIBD大鼠海马血管生成目的探讨hUC-MSCs分泌IL-8参与HIBD模型大鼠神经修复的作用机制。方法实验设计分叁组：正常对照组(Sham组,n=6), PBS颅内注射组(HIBD组,n=6)和hUC-MSCs移植组(hUC-MSCs组,n=6),在颅内注射后2d取脑组织进行各项检测；通过ELISA检测hUC-MSCs培养上清液中IL-8、TIMP-1、CCL2、CXCL1四种细胞因子表达情况,验证芯片结果；通过ELISA和Western Blotting检测Sham组、HIBD组和hUC-MSCs组叁组实验大鼠脑组织hIL-8分泌水平和IL-8蛋白表达水平,以及CD31表达和VEGF分泌水平；通过CD31和BrdU双标免疫荧光实验,检测叁组大鼠海马区血管生成情况；通过Western Blotting实验,检测叁组大鼠脑组织JNK和p-JNK蛋白表达情况；通过siIL-8和GFP慢病毒转染,建立siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs稳定细胞株；通过Real-time PCR和Western Blotting实验,检测siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs两组细胞中IL-8基因和蛋白表达情况；将siIL-8-hUC-MSCs(n=14)和GFP-hUC-MSCs (n=14)稳定细胞株移植入HIBD大鼠体内,细胞移植后2d取脑组织进行检测；通过ELISA和Western Blotting实验,检测siIL-8-hUC-MSCs移植入HIBD大鼠脑组织后IL-8表达情况,以及CD31蛋白表达水平和VEGF分泌情况；通过CD31和BrdU双标免疫荧光实验,明确siIL-8-hUC-MSCs移植对海马区血管生成的影响；通过Western Blotting实验,检测JNK和p-JNK蛋白在siIL-8-hUC-MSCs组和GFP-hUC-MSCs组的表达情况；通过Morris水迷宫,检测siIL-8-hUC-MSCs组(n=8)和GFP-hUC-MSCs组(n=8)两组实验大鼠学习记忆功能情况。结果(1)hUC-MSCs分泌细胞因子情况：通过ELISA对芯片检测出最高的四种细胞因子进行验证,发现hUC-MSCs高分泌IL-8. TIMP-1、CCL2、CXCL1四种细胞因子,其中IL-8是最高分泌的细胞因子,其分泌量较其它叁种细胞因子有统计学差异(***P<0.001, IL-8 vs. TTMP-1, one-way ANOVA)。 (2) hUC-MSCs移植对IL-8表达水平的影响：通过对hUC-MSCs移植组大鼠脑组织在hIL-8分泌水平和IL-8蛋白水平进行检测,发现hUC-MSCs组表达IL-8水平高于HIBD组和Sham组,差异具有统计学意义(*P<0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. hUC-MSCs)。(3) hUC-MSCs移植对CD31和VEGF表达水平的影响：hUC-MSCs移植组CD31蛋白表达水平和VEGF分泌水平为叁组中最高,高于 Sham组和HIBD组,差异具有统计学意义(**P<0.01, HIBD vs. hUC-MSCs;**P<0.01, Sham vs. HIBD)。(4) hUC-MSCs移植对血管生成的影响：hUC-MSCs治疗组海马新生血管明显多于HIBD组,差异具有统计学意义(*P<0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. HIBD, one-way ANOVA)。(5) hUC-MSCs移植促进血管生成的可能机制：hUC-MSCs组p-JNK蛋白表达水平较HIBD组和Sham组明显增高,但JNK总蛋白表达水平在叁组没有明显差异。(6)siIL-8-hUC-MSCs细胞株的建立：通过倒置荧光显微镜观察,发现GFP空载慢病毒组和siIL-8'慢病毒组感染细胞稳定表达绿色荧光,与普通光学显微镜下的细胞相比,GFP组和siIL-8组慢病毒感染率均达85%以上,两组间无明显差异,并且病毒感染组细胞活力及增殖能力较未感染病毒的hUC-MSCs无明显减弱。(7)siIL-8-hUC-MSCs稳定细胞株的鉴定：Real-time PCR显示,siIL-8-hUC-MSCs组IL-8基因表达水平明显低于GFP-hUC-MSCs组,差异具有统计学意义(***p<0.001, Student's t test)。IL-8蛋白表达水平与基因水平一致。(8)siIL-8-hUC-MSCs移植对IL-8表达水平的影响：siIL-8-hUC-MSCs组大鼠脑组织中hIL-8分泌水平较GFP-hUC-MSCs组明显降低,差异具有统计学意义(***P< 0.001, Student's t test)。IL-8蛋白表达水平与hIL-8分泌水平一致。(9)siIL-8-hUC-MSCs移植对CD31和VEGF蛋白表达水平的影响：siIL-8-hUC-MSCs移植组在CD31蛋白表达和VEGF分泌水平均较GFP-hUC-MSCs移植组低,差异具有统计学意义(*P<0.05, Student's t test)。(10) siIL-8-hUC-MSCs移植对海马区血管生成的影响：siIL-8-hUC-MSCs移植组海马区BrdU+/CD31+细胞数量明显少于GFP-hUC-MSCs移植组,对阳性标记的新生血管进行计数,差异具有统计学意义(*P<0.05, Student's t test)。(11) siIL-8-hUC-MSCs移植对JNK信号通路的影响：siIL-8-hUC-MSCs组p-JNK蛋白表达水平明显低于GFP-hUC-MSCs组,而总JNK蛋白表达水平在两组无差异。(12)siIL-8-hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠学习记忆功能的影响：通过Morris水迷宫检测,发现siIL-8-hUC-MSCs移植组大鼠穿越平台次数明显少于GFP-hUC-MSCs组,差异具有统计学意义(*P<0.05, Student' s t test)。结论(1)hUC-MSCs分泌的IL-8可能通过JNK信号通路参与HIBD大鼠海马区血管生成。(2)体外成功建立siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs稳定细胞株。(3)利用siIL-8-hUC-MSCs反向证实hUC-MSCs移植通过分泌IL-8促进HIBD大鼠学习记忆功能的恢复。
张颖佩[7]2008年在《茶多酚对小鼠离体脑片氧糖剥夺及谷氨酸损伤的神经保护作用》文中研究指明目的:研究茶多酚(TP)(1、3、10mg/L)对小鼠离体脑片氧糖剥夺(OGD)损伤及谷氨酸(Glu)损伤的神经保护作用并探讨其作用机制。方法:采用健康、成年昆明种小鼠,通过使脑片遭受OGD损伤(皮层15min、海马10min),接着复灌60min,建立皮层、海马脑片OGD损伤模型;通过在孵育液中加入1mM的Glu损伤30min,建立皮层、海马脑片Glu损伤模型。TTC染色法和检测脑片在孵育液中LDH释放量用于评价脑片神经损伤的程度。此外,脑片SOD活力的测定用于评价TP对OGD损伤脑片抗氧化损伤能力的影响。并比较了含镁离子、无镁离子人工脑脊夜(ACSF)、TP(10mg/L)与MK801(0.03mM)对Glu损伤全脑脑片活性的影响。结果:1.TP对OGD损伤小鼠皮层、海马脑片TTC染色及LDH释放量的影响:空白对照组皮层、海马脑片TTC染色490nm处吸光度值(A490)分别为0.35±0.02(n=8)、0.18±0.01(n=10),LDH释放量分别为187.42±14.17U/mg?tissue(n=8)、106.32±8.61 U/mg?tissue(n=8)。与空白对照组比较,OGD15min或10min,可以显着降低皮层、海马脑片TTC染色A490,分别为0.13±0.01(p<0.01,n=8), 0.08±0.0(1p<0.01,n=10);也可显着增高其LDH释放,分别为271.00±18.24U/mg?tissue(p<0.01,n=8),179.48±3.85U/mg?tissue(p<0.01,n=8)。而TP(1、3、10mg/L)则可以明显提高OGD损伤皮层、海马脑片TTC染色A490,同时也能明显降低其LDH释放。2. TP对OGD损伤小鼠皮层、海马脑片SOD活力的影响:空白对照组皮层、海马脑片SOD活力分别为115.58±5.19U/mgprot(n=8)、114.31±4.82U/mgprot(n=8)。OGD15或10min后,脑片SOD活力显着降低,分别为74.30±6.42U/mgprot(p<0.01,n=8)、59.38±4.50U/mgprot(p<0.01,n=8)。而TP(1、3、10mg/L)则可剂量依赖性地明显提高OGD损伤脑片SOD活力,并且,TP(10mg/L)升高SOD活力分别到158.17±10.62U/mgprot(n=8)、126.52±2.39U/mgprot(n=8),比相应空白对照组更高(皮层脑片p<0.01、海马脑片p<0.05)。3. TP对Glu损伤小鼠皮层、海马脑片TTC染色及LDH释放量的影响:空白对照组皮层、海马脑片TTC染色A490分别为0.20±0.01(n=8)、0.13±0.005(n=8),LDH释放量分别为196.15±29.49U/mg?tissue(n=8)、119.94±9.93 U/mg?tissue(n=8)。与空白对照组比较,1mM的Glu损伤30min可以显着降低皮层、海马脑片TTC染色A490,分别为0.13±0.01(p<0.01,n=8);0.08±0.005(p<0.01,n=8);也可显着增高其LDH释放量,分别为368.73±30.14U/mg?tissue(p<0.01,n=8);217.19±8.32U/mg?tissue(p<0.01,n=8)。而TP(1、3、10mg/L)可稳定增加Glu损伤皮层、海马脑片的活性。TP对皮层脑片TTC染色的影响呈现出一定的剂量依赖性关系。4.含镁离子、无镁离子ACSF、MK801及TP对Glu损伤小鼠全脑脑片TTC染色的影响:1mM、3mM的Glu损伤30min可剂量依赖性地降低小鼠全脑脑片TTC染色A490。含镁离子空白对照组脑片A490为0.48±0.02,Glu1mM、Glu3mM损伤组A490分别降到0.40±0.02(与含镁空白对照组比p<0.05,n=6)、0.31±0.03(与含镁空白对照组比p<0.01,n=6),而用无镁离子ACSF孵育的脑片活性均低于相应用含镁离子ACSF孵育的脑片活性(p<0.01)。TP(10mg/L)与MK801(0.03mM)对Glu3mM损伤脑片呈现出相似的显着保护作用。并且,TP(10mg/L)对Glu3mM损伤脑片的保护率为1.40±0.07(含镁组),1.44±0.07(无镁组),两者比较,无显着性差异(p>0.05)。同样,MK801(0.03mM)对Glu3mM损伤脑片的保护率,含镁组与无镁组之间比较,也无显着性差异(p>0.05)。结论:1.TP(1、3、10mg/L)对OGD损伤及Glu损伤小鼠离体脑片具有明显的神经保护作用,其保护作用可能与提高脑片组织SOD活力有关,也可能与减弱由NMDA受体兴奋所引起的神经元兴奋性毒性损伤有关。2.含镁离子ACSF所提供的离子环境更适合脑片存活。在小鼠离体脑片水平,TP(10mg/L)对Glu损伤脑片产生的保护作用与MK801(0.03mM)产生的相当,它们产生的保护作用均不受含镁离子ACSF、无镁离子ACSF这两种孵育液的影响。
徐馨[8]2016年在《TUBB3在癫痫中的作用和机制研究》文中研究说明第一部分TUBB3在难治性癫痫患者及动物模型中的表达目的:检测TUBB3在难治性癫痫患者及两种慢性癫痫大鼠模型脑组织中的表达情况。方法:1.从课题组建立的由300多例难治性TLE患者术后脑组织组成的脑库中随机抽取癫痫脑组织标本(实验组)30例,非癫痫脑外伤患者脑组织(颞叶皮质)标本作为对照组10例。2.成年雄性SD大鼠(体重220±20g,7-8周龄),氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫持续状态(SE),构建SE后慢性TLE模型,分为有自发性反复癫痫发作组(SRS,6w,n=8)和无自发性反复癫痫发作组(non-SRS,6w,n=8)。3.构建戊四氮(PTZ)慢性点燃大鼠模型,分为点燃成功组(n=8)和未点燃成功组(n=8)。4.用免疫印迹方法检测TUBB3表达情况,免疫荧光检测TUBB3表达部位。结果:1.难治性TLE患者术后脑组织及对照脑组织中均有TUBB3表达,且TUBB3在癫痫患者术后脑组织中表达较对照组显着增高(★p<0.05)。2.在氯化锂-匹罗卡品诱导的慢性癫痫大鼠模型中,有自发性发作的大鼠皮质和海马tubb3表达水平均较无自发性发作组明显增高(★★★p<0.001,#p<0.05);ptz慢性点燃模型中,点燃成功组大鼠皮质和海马tubb3表达水平均较未点燃组显着增高(★p<0.05,##p<0.01)。3.癫痫患者脑组织中免疫荧光显示tubb3免疫反应阳性细胞有较长突起,主要在神经元胞质和轴突初段表达,且与抑制性神经元标记物(gad67)和成熟的抑制性突触标记物(gephyrin)共表达,与兴奋性突触标记物(psd95)无共表达;并在慢性癫痫大鼠模型脑组织中得到验证。结论:难治性tle患者和两种慢性癫痫大鼠模型脑组织中tubb3表达均明显增加,且tubb3与抑制性突触共表达,提示tubb3可能参与了癫痫的发生发展。第二部分tubb3对两种癫痫动物模型行为学的影响目的:为进一步探讨tubb3在癫痫发生发展中的作用,我们构建了tubb3-shrna和tubb3过表达基因的腺相关病毒(aav)载体,通过海马立体定位注射改变大鼠海马tubb3表达,观察tubb3对ptz慢性点燃模型和匹罗卡品慢性癫痫模型行为学的影响。方法:1.构建携带有tubb3-shrna和tubb3过表达基因的腺相关病毒载体。2.成年雄性sd大鼠随机分为叁组:海马立体定位注射腺相关病毒空载体组(aav-gfp);腺相关病毒tubb3-shrna组(aav-tubb3-shrna);腺相关病毒tubb3过表达组(aav-tubb3)。3.分别用免疫荧光、免疫印迹技术检测转染效率。4.ptz慢性点燃模型行为学观察:在沉默tubb3和过表达tubb3的癫痫模型中,我们利用阈下剂量ptz,每隔48h进行1次,观察点燃过程中各时间点平均发作分级。5.氯化锂-匹罗卡品癫痫模型行为学观察:在沉默tubb3和过表达tubb3的癫痫模型中,造模后持续视频监测大鼠srs情况。统计srs次数和用racine评分评估发作的严重程度。结果:1.aav-tubb3-shrna、aav-tubb3和aav-gfp海马立体定位注射后,免疫荧光结果显示海马ca1和齿状回均有gfp阳性表达。免疫印迹结果显示,与相应时间点对照组相比,tubb3-shrna组od值在病毒注射后第3周和第9周显着降低(★★p<0.01),tubb3过表达组od值在病毒注射后第3周和第9周显着增加(★★p<0.01)。2.ptz慢性点燃过程中,与对照组相比,tubb3-shrna组各时间点平均发作分级显着降低,tubb3过表达组各时间点平均发作分级显着升高(★p<0.05,★★p<0.01)。3.氯化锂-匹罗卡品诱导的se后慢性期内(3-6w),与对照组相比,tubb3-shrna组自发性发作次数和5级发作比例显着降低,tubb3过表达组自发性发作次数和5级发作比例显着升高(★p<0.05,★★p<0.01,★★★p<0.001)。结论:1.腺相关病毒tubb3-shrna或tubb3过表达海马立体定位注射后可显着改变海马tubb3的表达,转染在注射后3周有效,可持续至9周。2.腺相关病毒介导的海马tubb3-shrna能减轻ptz慢性点燃过程中各时间点平均发作分级,tubb3过表达产生相反的结果。3.腺相关病毒介导的海马tubb3-shrna能减少氯化锂-匹罗卡品诱导的慢性期自发性发作的次数并减轻发作严重程度,tubb3过表达产生相反的结果。第叁部分tubb3在癫痫发作中的作用机制目的:探讨tubb3对点燃动物神经元抑制功能的影响及其可能的潜在机制。方法:1.取25只成年雄性清洁级sd大鼠,根据海马内立体定位注射试剂不同分为叁组:aav-tubb3-sh组、aav-tubb3组和aav-gfp组。2.叁周后构建ptz慢性点燃大鼠模型,取材制作海马脑片。采用全细胞膜片钳技术检测各组海马ca1区锥体神经元抑制性突触后电流(mipsc)和成对脉冲比例(ppr)的变化情况。3.免疫印迹法检测ptz慢性点燃成功后大鼠海马gaba-a受体β2/3的总蛋白和膜蛋白表达情况。4.免疫共沉淀检测PTZ慢性点燃成功后大鼠海马中TUBB3、GABARAP和GABA-A受体β2/3叁者相互作用情况。结果:1.全细胞膜片钳技术对CA1区锥体神经元记录结果显示,与对照组相比,TUBB3-shRNA组中m IPSC幅度显着增高(★P<0.05);TUBB3过表达产生了相反的效果;mIPSC频率在TUBB3-shRNA组与GFP组之间无显着性差异(P>0.05);TUBB3-shRNA组与GFP组相比,PPR无显着性差异(P>0.05)。2.免疫印迹结果显示,TUBB3-shRNA组GABA-A受体β2/3膜蛋白/总蛋白比值显着增加(★P<0.05),TUBB3过表达组膜蛋白/总蛋白比值明显降低(★P<0.05);GABA-A受体总蛋白表达量无显着变化(P>0.05);GluR2/3无显着性差异(P>0.05)。3.免疫共沉淀结果显示癫痫大鼠海马组织中内源性TUBB3和内源性GABARAP、GABA-A受体叁者相互作用。结论:1.癫痫大鼠海马中下调TUBB3能显着增加海马CA1区椎体神经元的mIPSC幅度。2.癫痫状态下,TUBB3能与GABARAP相互作用选择性影响突触后GABA-A受体依赖性抑制性突触后电流。
张仲苗[9]2005年在《左旋四氢巴马汀抗脑缺血作用及机制研究》文中研究说明脑卒中是危害人类健康的主要疾病之一,它导致脑功能及脑结构发生不可逆的变化,也是临床上常见的预后较差的一种疾病。众所周知,脑缺血和缺血后再灌损伤是脑卒中危害的重要部分,寻找切实有效的脑卒中防治药物已成为当今医学领域的重大课题。中药提取物左旋四氢巴马汀(L-tetrahydropalmatine,L-THP)经实验证实对大鼠和小鼠脑缺血损伤具有保护作用,但是目前国内外对L-THP的抗脑缺血作用报道不多,而且主要涉及动物模型方面,机制方面的研究内容不多,在组织细胞分子水平上(海马脑片、细胞培养等)文献报道更少。因此,本文较系统地研究了L-THP抗脑缺血和缺血后再灌损伤作用机制。研究证明: 1、L-THP主要是通过降低Glu的合成和释放来起到脑保护作用 本文采用小鼠整体全脑缺血再灌模型发现,与对照组相比,模型组小鼠脑组织中Glu含量升高6倍以上(P<0.01),GABA的含量明显升高(P<0.01),Glu/GABA从2.15上升至3.37。L-THP(10,50,100μg/ml)均能明显降低脑缺血小鼠脑组织Glu含量(P<0.01);L-THP(10 μg/ml)组小鼠脑组织GABA含量较模型组明显降低(P<0.01),中、高剂量L-THP较模型组无明显差别(P>0.05);3种剂量L-THP剂量依赖地使Glu/GABA比值明显下降(P<0.01)。上述结果表明,与银杏相同,L-THP主要是通过降低Glu的合成和释放来起到脑保护作用。因此,在缺血早期,控制Glu大量释放,阻止Ca~(2+)内流是防止缺血性神经元损伤的重要环节。 2、L-THP通过减轻海马缺氧时可逆性和不可逆性损伤来发挥脑缺血保护作用 本文通过海马脑片离体缺氧模型,发现缺氧组约在78.5s时PS幅度开始减少,大约于286.3 s时消失;L-THP10μg/ml组的脑片PS幅度开始减小时间为201.4 s,消失时间为543.6 s,PS减小时间、消失时间与缺氧组相比有非常显着差异(P<0.01);L-THP50μg/ml组中,PS减小时间和消失时间分别为178.5s和482.3s,PS减小时间显着低于缺氧组(P<0.05)、消失时间非常显着低于缺氧组(P<0.01);L-THP100μg/ml组中,PS减小时间和消失时间分别为101.0s和327.5s,PS减小时间、消失时间显着低于缺氧组(前者P<0.05)。结果表明:L-THP能减缓缺氧时PS幅度的降低速度,但随着浓度的增加,效果逐渐弱。缺氧组脑片平均在658.8 s出现HIP,L-THP10μg/ml组和50μg/ml组脑片出现时间分别推迟为1152.4s和851.1s,与缺氧组相比均有非常显着差异(P<0.01);L-THP100μg/ml组脑片HIP
王志萍[10]2003年在《异氟醚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究表明目的 颈动脉内膜剥脱术、心跳骤停、急性创伤性休克等病人均潜在有脑缺血的可能，理想的脑保护措施一直是临床医生追求的目标。异氟醚由于其良好的可控性在临床麻醉工作中被广泛采用，有文献报道异氟醚虽然可能增加脑血流和颅内压，但可以通过降低脑代谢明显改善不完全性脑缺血神经预后，与低温有相似的阻止神经元死亡作用，但也有报道认为异氟醚虽延迟但并无明显减少梗死灶作用，异氟醚的脑保护作用尚有争议。本研究拟通过神经电生理学-神经病理学-分子神经生物学-功能行为学等多个层面，在整体上观察大鼠局灶性脑缺血再灌注期间脑功能行为、梗死体积、皮质海马氨基酸含量变化及异氟醚的保护作用；在离体海马脑片观察缺氧无糖损伤和异氟醚应用对细胞外液氨基酸含量和细胞外群峰电位影响及其可能作用机制。 材料和方法 1整体局灶性脑缺血再灌注损伤实验 1．1局灶性脑缺血再灌注损伤模型及实验分组 选择雄性SD大鼠，体重280～320g，腹腔注射40mg／kg戊巴比妥钠麻醉，应用Longa线栓法大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery，Occlusion，MCAO)模型，于近心端结扎左侧颈总和颈外动脉，血管夹夹闭颈总动脉远端，在颈总动脉上剪一小口，选择直径0.25～0.30mm、长度不低于4cm的尼龙线，头端用酒精灯烧制成光滑球形，边松血管夹，边进线，一般置入颈内动脉20～22mm，直到有轻微阻力感不能再进为止，手术插线深度小于10mm者剔除，阻闭120min后抽出尼龙线，恢复再灌注。术中持续监测鼓膜温度并用烤灯维持脑温37℃～38℃，随机将动物分为四组，假手术组（1组入仅分离血管，不留置线栓；脑缺血组（皿组厂缺血前吸人纯氧30分钟行线栓阻闭，阻闭120分钟后将线栓抽出恢复再灌注；0．8 MAC异氟醚组（皿组）和 l．3 MAC异氟醚组（W组卜分别在缺血前吸人0．SMAC和1．3MAC异氟醚30min。 1．2观察指标 评估脑缺血再灌注后3h上2h＊0h神经功能损害程度；分别记录缺血前后及再灌注不同时间内定量脑电图（qUantitative electroen－cephalograln，qEEG）和脑温变化情况；用 hC法测定脑缺血 Zh再灌注 22h和70h后梗死体积及光、电镜变化；分别在脑缺血前，脑缺血后30为0。120ndn，再灌注后 60ndn取额顶部皮质和海马组织，用高效液相色谱ui吵－Pe咖rmance li叩d chromatograPhy，HPLC）测定兴奋性氨基酸（excitory a－ndno acid，EAA）和抑制性氨基酸Onhibitory amino acid，IAA）含量；在再灌注后22h经左心室升主动脉快速灌注0．9％生理盐水和4％多聚甲醛，将视交叉后脑组织置4℃相同固定液固定24－48h，用15％和30％蔗糖脱水，冰冻连续冠状切片，片厚32pm，用ABC法进行Bcl－2／Bax免疫组织化学染色。 2离体海马脑片实验 L且海马脑片缺氧无糖损伤（DOG）模型 选用雄性SD大白鼠，体重50－609，在撇麻醉下迅速断头取脑，置于 0－4t经 95％O。／5％CO。混合气体饱和的人工脑脊液（ACSF）中，剥离海马，用振动切片机沿矢状面切片，厚度 400pm。将海马脑片置于 32．0。0．5℃的 ACSF中孵育 Zh，并不断通人 95％O。／5％CO。混合气体。缺氧无糖时脑片置于无糖 ACSF中持续通人95％N。／5％CO。混合气体。 2．2海马脑片孵育液氨基酸测定 取6张孵育Zh后脑片，放于装有3毫升无氧uaO。d0mmHg）无糖 ACSF的玻璃杯中，随机分四组，二组：对照i，持续于含糖 ACSF中gA 95％O。／5％CO。混合气体；见组：37t缺氧无糖组，缺氧无糖 30min复氧供糖 lh；皿组／％异氟醚缺氧组，缺氧无糖同时吸人 1％异氟醚＊组：2％异氟醚缺氧组，缺氧无糖同时吸人 2％异氟醚。在缺氧无糖结束即时（A入复氧供糖30ndn门）和60ndn（）留取ACSF毫升，用HPLC测定氨基酸含量。 2．3海马脑片电生理 孵育 Zh后脑片浸于 37 to．st恒温灌流槽内，双极刺激电极置于海马CAI区的Schaffer侧支路径上，刺激强度为0．2－0． ·2·SInA，玻璃微电极（内充4moUL NaCI溶液，阻抗2－10 Mfl）置于 CAI区锥体细胞层，记录电刺激诱发的OPSc；门）随机将海马脑片分四组，互组：对照组，具体又分对照A组、对照B组和对照C组，分别观察不缺氧1．5小时。吸人 1％和 2％异氟醚 28分钟后 111时 OPS幅度的变化；11组：缺氧无糖组，缺氧无糖 14min复氧供糖；皿组和＊组分别在缺氧无糖前14分钟给予 ltyo或2％异氟醚预先饱和的ACSF，一直保持到缺氧无糖结束，而后恢复供氧供糖。观察缺氧复氧期间顺向群锋电位k populahon spike，OPS）和缺氧损伤电位（hyPoalc inj吧 Potential，HIP）变化。（2）谷氨酸（咖ta－mate，Gin）阳性对照组用含ZnunliL Gin的 ACSF灌流脑片，14分钟后去除GI几2％异氟醚组在使用Gin前14分钟至去除Gi后14分钟持续吸人2％异氟醚，观察去除0U后OPS的恢复情况。 3统计学处理所有实验数据以均数土标准差口扔）表示，用SS统计软件分析资料，HIP出现率与OPS恢复率用Fisher确切概率法，其余的用单因素方差分析和两样本均数比较的 t?
参考文献：
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[10]. 异氟醚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 王志萍. 中国医科大学. 2003
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