Nanodisc类膜体系中FGFR1c结构及活性的研究

论文摘要

成纤维细胞生长因子受体（FGFR）是成纤维细胞生长因子（FGF）家族蛋白的受体蛋白。作为受体酪氨酸家族中的一员,FGFR在调控细胞的增殖、分化、迁移及细胞存活等过程中发挥着重要功能,FGFR信号通路的异常将导致多种疾病或者发育综合征的出现。FGFR位于细胞膜表面,其胞外端通过辅因子（肝素或klothos）结合配体,形成同源二聚复合体,引起胞内激酶区不同酪氨酸磷酸化位点发生反式磷酸化反应,进而活化下游的信号通路。FGFR胞内激酶结构域包含7个酪氨酸磷酸化位点,其中位于活化环上的Y653和Y654具有酪氨酸激酶活性;其他酪氨酸位点的磷酸化可以作为下游信号分子的结合位点,从而活化特定的信号通路。FGFR是单次跨膜的酪氨酸受体,然而体外研究中膜环境模拟的挑战性,限制了针对全长膜蛋白结构和功能的研究,导致绝大多数体外研究仍以局部结构域作为研究对象。因此寻找合适的类膜环境,对深入探究全长FGFR的结构和功能至关重要。在已知的多种类膜体系中,Nanodiscs是一种较为理想的体外类膜体系模型。Nanodiscs不仅含有双层的磷脂结构,而且可以依据不同的研究目的,通过调控磷脂的比例及组成,精确地调控nanodiscs尺寸的大小;同时组装后的复合物可以利用多种技术手段进行表征及分析。该技术已被尝试应用于多个膜蛋白的结构及功能研究中。本论文选择与肿瘤发生密切相关的一种成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族成员FGFR1 c,结合体外nanodiscs体系对其进行了一系列的探究。研究内容主要包括两部分:第一部分重点探究FGFR1c体外nanodiscs组装的适宜条件,并对FGFR1c的结构进行初步表征和功能验证;第二部分利用peptide nanodiscs体系研究局部膜环境对FGFR1c胞内激酶结构域活性的调控作用。取得的主要研究结果如下:1.构建了 FGFR1c的昆虫细胞表达体系,表达并纯化了全长FGFR1c蛋白,利用MSPΔH5 nanodiscs体系实现了针对全长FGFR1c及其配体复合物（bFGF/heparin/FGFR）的组装,并对FGFR1c进行生物冷冻电镜的初步结构表征和功能验证。2.利用peptide nanodiscs体系,通过调控磷脂与小肽的比例,实现了对nanodiscs尺寸的精确调控,并通过引入一定比例的DGS-NTA（Ni）磷脂将FGFR胞内激酶结构域（FGFR1K）锚定在类膜体系的表面,在类膜体系环境下对FGFR1K的活性进行了系统研究。

论文目录

摘要

Abstract

第一章 FGFR结构与功能研究进展及类膜体系在膜蛋白研究中的应用

第一节成纤维细胞生长因子受体

1.1 FGF家族成员及分类

1.1.1 FGF1亚家族

1.1.2 FGF4亚家族

1.1.3 FGF7亚族

1.1.4 FGF8亚家族

1.1.5 FGF9亚家族

1.1.6 FGF15/19亚家族

1.1.7 FGF11亚家族

1.2 成纤维细胞生长因子受体

1.2.1 成纤维细胞生长因子受体的结构元件

1.2.2 成纤维细胞生长因子受体选择性剪切

1.2.3 成纤维细胞生长因子受体选择性剪切体在功能上的差异

1.3 成纤维细胞生长因子受体与配体的结合

1.3.1 成纤维细胞生长因子受体与配体的结合辅因子

1.3.2 FGF与FGFR胞外段结合的分子机制

1.4 成纤维细胞生长因子受体胞内激酶区活化

1.4.1 成纤维细胞生长因子受体胞内激酶区活化的结构基础

1.4.2 成纤维细胞生长因子受体胞内激酶区反式磷酸化的结构基础

1.5 成纤维细胞生长因子受体激活的信号通路

1.5.1 PLCγ信号通路

1.5.2 Ras-MAPK和PI3K-AKT信号通路

1.5.3 STAT信号通路

1.5.4 FGFR信号通路的负调控机制

1.6 成纤维细胞生长因子与癌症

1.6.1 FGF与癌症

1.6.2 FGFR与癌症

第二节 Nanodiscs类膜体系及其在体外膜蛋白研究中的应用

2.1 Liposomes类膜体系及其主要的应用

2.2 Bicelles类膜体系及其主要的应用

2.3 Nanodisc类膜体系及其主要的应用

2.4 Peptide disc类膜体系及其主要的应用

2.5 基于多聚物的类膜体系及其主要的应用

2.6 利用含有DGS-NTA（Ni）磷脂的类膜体系在受体激酶研究中的应用

第三节本研究的内容和意义

第二章实验材料和方法

2.1 表达载体的构建

2.1.1 质粒与菌株

2.1.2 目的基因的扩增

2.1.3 目的片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.1.4 目的片段及质粒的双酶切

2.1.5 连接及转化

2.1.6 菌落PCR进行阳性克隆的鉴定

2.2 重组杆粒的获得

2.2.1 重组杆粒的产生及鉴定

2.2.2 杆状病毒的扩增

2.3 P1-P3病毒液的收集及重组蛋白的表达

2.4 MSPΔH5及bFGF蛋白的表达

2.4.1 bFGF蛋白的表达

2.4.2 MSPΔH5蛋白的表达

2.5 重组蛋白纯化

2.5.1 FLAG标签纯化全长的FGFR1c

2.5.2 His6标签蛋白的纯化

2.6 磷脂母液的制备

2.7 全长FGFR1cNanodisc的组装

2.7.1 MSPΔH5 nanodiscs的制备及表征

2.7.2 FGFR1c nanodiscs的组装及表征

2.8 FGFR1K在NTA（Ni）-nanodiscs条件下的激酶实验

2.8.1 Peptide nanodiscs的制备及表征

2.8.2 FGFR1K与NTA（Ni）-nanodiscs的结合

2.8.3 FGFR1K NTA（Ni）-nanodiscs的激酶实验

2.8.3.1 Western blot测定激酶活性

2.8.3.2 Cross-linking实验

2.8.3.3 ADP-Glo定量激酶实验

第三章体外类膜体系对FGFR激酶区活性影响的研究

3.1 目的基因的克隆及目的蛋白的获得

3.1.1 基因的分子克隆

3.1.2 FGFR1K蛋白的表达及纯化

3.2 不同直径大小的NTA（Ni）-nanodiscs的组装

3.2.1 不同直径大小的NTA（Ni）-nanodiscs的组装条件

3.2.2 三种不同直径大小的nanodiscs DLS和TEM的表征

3.3 FGFR1K与NTA（Ni）-nanodiscs的结合

3.3.1 ITC测定FGFR1K及NTA（Ni）-nanodiscs结合常数

3.3.2 SEC测定FGFR1K及NTA （Ni）-nanodiscs结合后峰值的变化

3.4 不同直径大小的NTA（Ni）-nanodiscs对FGFR1K激酶活性的影响

3.4.1 FGFR1K结合到不同直径大小NTA（Ni）-nanodiscs时活性的变化

3.4.2 Cross-linking对FGFR1K在不同直径大小NTA（Ni）-nanodiscs上聚集状态的检测

3.5 FGFR1K在NTA（Ni）-nanodiscs类膜环境下活性的变化

3.5.1 FGFR1K在类膜环境下总酪氨酸磷酸化水平的变化

3.5.2 FGFR1K在类膜环境下活化环上的酪氨酸磷酸化水平的变化

本章小结

第四章 FGFR1c体外nanodiscs组装及其表征

4.1 目的基因的克隆及目的蛋白的获得

4.1.1 PCR产物的克隆及测序

4.1.2 FGFR1c,bFGF及MSPΔH5蛋白的表达及纯化

4.2 FGFR1c,bFGF及肝素复合物体外nandiscs组装

4.2.1 FGFR1c,bFGF及肝素复合物体外组装条件的优化

4.2.2 FGFR1c,bFGF及肝素组装复合物FLAG亲和层析纯化

4.3 FGFR1c,bFGF及肝素nanodiscs组装复合物体外活性鉴定

4.4 FGFR1c,bFGF及肝素nanodiscs组装复合物DLS及TEM表征

4.5 FGFR1c,bFGF及肝素nanodiscs组装复合物Cyro-EM成像

本章小结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及取得的其它成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘娟娟

导师: 王俊峰

关键词: 成纤维细胞生长因子受体,受体酪氨酸激酶,自磷酸化,类膜体系,纳米碟

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q78;R341

DOI: 10.27517/d.cnki.gzkju.2019.000033

总页数: 121

文件大小: 9345K

下载量: 60

Nanodisc类膜体系中FGFR1c结构及活性的研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢