秸秆纤维素降解菌的筛选及其腐熟剂的制备

论文摘要

秸秆是农业生产过程中产生的一种重要的可再生生物质资源。大量的秸秆资源被闲置、废弃或焚烧造成了资源浪费和环境污染。我国作为农业大国,秸秆资源产出量每年约为68亿吨,如能对这些秸秆资源高效利用,既能改善能源危机又能缓解环境问题。本文以从枯枝落叶、腐殖质丰富的土壤中筛选的纤维素降解菌为研究对象,通过菌株分类地位的鉴定、纤维素降解酶活性测定、产酶条件优化、秸秆降解复合菌筛选等,初步探索秸秆纤维素降解菌高效利用的途径。主要研究结果如下:1.以32份腐殖土样品为材料,通过滤纸培养基筛选、CMC-Na培养基培养、刚果红染色,初步筛选出24株水解圈直径与菌落直径得比值HC≥2.1的菌株。通过对24个菌株的CMC-Na和FPA酶活力测定,复筛到纤维素酶活力较高的12个菌株,其中MX1、MX4等菌株的CMC酶活力≥0.934U·mL-1,FPA酶活力≥9.86 U·mL-1。2.经ITS序列测定及分析,所筛选12个菌株中包括镰刀菌2株、青霉菌2株、绿僵菌1株、蓝状真菌1株、曲霉菌6株。经SSU、ITS及TUB多基因联合分析,初步将MX5菌株鉴定为蓝状真菌（Talaromyces purpureogenus）、DR9为多育曲霉（Aspergillus proliferans）、DR12为黑曲霉（Aspergillus niger）、TR31为巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）。3.为研究MX5、DR9、DR12、TR31 4株菌株分泌纤维素酶的能力,分别采用液体发酵和固体发酵测定了4株纤维素降解菌的CMC-Na酶、FPA酶、微晶纤维酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活力。研究结果表明:在液体发酵过程中,DR12菌株诱导分泌的CMC-Na酶活可达21.18U·mL-1;滤纸酶为19.54U·mL-1;微晶纤维酶活为20.03U·mL-1;β-葡萄糖甘酶活为26.69U·mL-1,均高于其它3株菌株;固体发酵诱导产酶中,MX5菌株诱导产出的CMC-Na酶活力最高,可达17.34U·mL-1;滤纸酶最高的为DR12菌株,酶活为17.35U·mL-1,微晶纤维酶最高的为DR12菌株,酶活力为16.355 U·mL-1。β-葡萄糖甘酶最高的为TR31菌株,酶活力为24.96 U·mL-1。4.以DR12菌株为代表,通过对碳源、氮源、培养温湿度、初始pH、接种量等条件的优化,确定了高效产酶最适条件为:最适碳源为谷子秸秆,最适产酶氮源为硫酸铵、最适培养温度为25℃、最适培养基湿度为40%,最适培养基初始pH7、最佳接种量为1.5mL/20g。5.通过辅助剂的筛选及优化,制备了DR12单菌腐熟剂和包含MX5、DR9、TR31的3种菌株的复合微生物腐熟剂,结果表明:所制备菌剂的单菌有效活菌数为7.5×108个·g-1,纤维素酶活为63.39U·g-1,含水量为27.26%,pH6.4。三元混合菌有效活菌数为4×108个·g-1,纤维素酶活为75.36 U·g-1,含水量为27.67%,pH6.24。四元混合菌有效活菌数为1.2×109个·g-1,纤维素酶活为72.46 U·g-1,含水量为22.01%,pH6.4,均达到国家行业标准要求。

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摘要

前言

1.1 秸秆资源的有效利用

1.1.1 我国秸秆资源现状

1.1.2 秸秆资源的利用技术

1.2 秸秆组成及生物降解

1.2.1 秸秆组成及其结构

1.3 秸秆降解微生物

1.3.1 纤维素降解真菌

1.3.2 纤维素降解细菌

1.3.3 木质素降解微生物

1.4 纤维素酶研究进展

1.4.1 纤维素降解菌的筛选及优化

1.4.2 纤维素降解菌群的构建

1.4.3 秸秆腐熟剂

1.5 研究目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 样品采集

2.1.2 试验药品

2.1.3 培养基及配方

2.1.4 试验主要溶液试剂配置方法

2.1.5 试验仪器

2.2 纤维素降解菌筛选

2.2.1 纤维素降解菌的富集、初筛

2.2.2 纤维素降解菌的复筛

2.2.3 纤维素降解菌的鉴定

2.3 纤维素降解菌液体发酵及酶活测定

2.3.1 粗酶液制备

2.3.2 酶活测定

2.4 纤维素降解菌固体发酵及酶活

2.4.1 固体发酵

2.4.2 酶活测定

2.5 纤维素降解菌菌群构建及酶活测定

2.5.1 纤维素降解菌共生性研究及共生性研究

2.5.2 纤维素降解菌复合菌系的构建

2.6 纤维素降解菌DR12 产酶及影响因素研究

2.6.1 最佳营养条件筛选

2.6.2 最佳培养条件筛选

2.7 菌剂的制备及活性测定

2.7.1 表面活性剂的筛选

2.7.2 菌剂添加剂的辅助剂的筛选

2.7.3 菌剂的制备

2.7.4 菌剂质量指标测定

3 结果与分析

3.1 纤维素降解菌初筛

3.2 纤维素降解菌复筛结果

3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

3.2.2 酶活测定

3.3 纤维素降解菌的鉴定

3.3.1 基因组DNA提取及PCR扩增结果

3.3.2 多基因联合建树

3.4 纤维素降解菌发酵及酶活测定

3.4.1 纤维素降解菌液体发酵及酶活测定

3.4.2 纤维素降解菌固体发酵酶活测定

3.5 复合菌系的筛选

3.5.1 目标菌株间的拮抗性试验

3.5.2 纤维素降解菌复合菌系的构建

3.6 纤维素降解解菌固体发酵培养基筛选及条件优化

3.6.1 固体培养基筛选

3.6.2 发酵条件筛选

3.6.3 发酵条件优化

3.6.4 微生物处理后谷子秸秆的电镜观察

3.7 菌剂制备及活性检测

3.7.1 添料添加量筛选

3.7.2 菌剂制备

3.7.3 菌剂活性检测

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.2.1 菌株筛选与酶活测定

4.2.2 纤维素降解菌液体、固体发酵酶活测定

4.2.3 发酵条件

4.2.4 菌剂制备

参考文献

Abstract

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王勇

导师: 张宝俊

关键词: 纤维素降解菌,菌株鉴定,纤维素酶活,发酵条件优化,菌剂制备

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西农业大学

基金: 山西省植物内生菌资源共享服务平台建设(201605D121024)

分类号: Q939.9

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000185

总页数: 70

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秸秆纤维素降解菌的筛选及其腐熟剂的制备

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