一、人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析（论文文献综述）
张强[1]（2020）在《梅花鹿PDGFA基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达》文中认为血小板衍生生长因子A（PDGFA）为血小板衍生生长因子之一,可由多种细胞产生。其可与细胞膜表面高度特异受体PDGFRA结合,从而激活PDGF/PDGFR通路,发挥相应的生物学效应。现有研究表明PDGFA蛋白在多种癌细胞的增殖和迁移过程中起重要作用。鹿茸的快速生长和再生是自然界绝无仅有的,也因此成为理想的再生生物学研究对象。对它快速增殖的研究也可能成为临床治疗肿瘤的新切入点。本研究根据Genbank中牛的基因序列,设计了梅花鹿PDGFA基因的同源引物,并在引物两端分别加入酶切位点（HindⅢ、BamH Ⅰ）。采用RT-PCR技术获得了梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA序列,通过对测序结果分析发现,获得的PDGFA基因cDNA序列长663bp,编码196个氨基酸。经对比发现梅花鹿PDGFA蛋白与白尾鹿、家牛、山羊同源性较高,分别为98%、97%、96%,证明成功克隆了梅花鹿的PDGFA基因。本试验构建pEGFP-C1-PDGFA重组质粒,用pEGFP-C1-PDGFA真核表达载和pEGFP-C1空载体分别瞬时转染293T细胞,并在荧光显微镜下观察,可见大量绿色荧光,转染效率为60%-70%。对转染空载体和pEGFP-C1-PDGFA的细胞提取RNA后反转录,使用荧光定量PCR检测,发现转染pEGFP-C1-PDGFA组PDGFA基因表达量是转染pEGFP-C1空载体组的约280倍。经荧光定量PCR检测发现,当PDGFA基因在293T细胞中过表达时,SPHK2,STAT5A,STAT5B的表达水平有显着上升（P<0.01）。
黄益智[2]（2020）在《灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因的全长cDNA克隆及定量表达分析》文中研究表明灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand-Mazz）作为重要的药用植物,在我国普遍种植,其有效成分绿原酸（chlorogenicacid,CGA）是植物重要的次生代谢产物,具有清热解毒、抗菌、抗病毒等重要的药用价值。而目前有关灰毡毛忍冬绿原酸合成的分子机制以及关键酶基因的研究还不够深入,因此,本论文从基因克隆、绿原酸测定、表达模式分析、原核表达、以及载体构建等方面入手,对灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因进行全长cDNA克隆及定量表达分析,以期为研究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成的分子机制奠定理论基础。本论文的主要研究内容如下:（1）采用RACE方法,克隆了灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT的全长cDNA序列,结果显示Lm4CL基因全长1960 bp（GenBank:MN103349）,CDS 全长 1617bp,编码 539 个氨基酸,LmHCT基因得到部分片段 840 bp,LmCCoAOMT基因全长 1096 bp（GenBank:MN103348）,CDS全长735 bp,编码245个氨基酸。通过聚类分析发现,灰毡毛忍冬Lm4CL基因亲缘关系最近的是金银花,亲缘关系最远的是铁杉。LmCCoAOMT基因亲缘关系最近的是牵牛花和烟草,亲缘关系最远的是梅和枇杷。该结果表明目的基因在木本植物和草本植物之间的亲缘关系比较远,这也充分反映了木本植物与草本植物之间的差异。氨基酸序列分析表明,Lm4CL和LmCCoAOMT都为疏水性氨基酸,不具有跨膜结构,其蛋白质三级结构都以α-螺旋和β-折叠的形式存在。（2）利用RT-qPCR对这三个基因表达模式进行分析,RT-qPCR结果表明,Lm4CL基因在花中期表达量最低,在茎末期表达量最高。LmHCT基因在花早期表达量最低,在茎末期表达量最高。LmCCoAOMT基因在花中期表达量最低,在茎中期表达量最高。灰毡毛忍冬的茎、叶组织中基因表达量在生长过程中有明显增加,这也体现了这几个基因不仅是灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因,且可能在木质素的合成上共同发挥重要作用。（3）利用HPLC测定了花不同时期的绿原酸含量,同时比较了灰毡毛忍冬和金银花绿原酸的含量,结果表明,灰毡毛忍冬花早期绿原酸含量为2.88%,中期为2.56%,末期为2.81%。金银花花早期绿原酸含量为2.59%,中期为2.22%,末期为1.37%,灰毡毛忍冬不同时期绿原酸含量都高于金银花绿原酸的含量。利用矩阵分析了基因表达量和绿原酸含量的相关性,结果表明,Lm4CL基因表达量与绿原酸含量显着正相关,Lj4CL基因的表达量与绿原酸的含量呈现极弱的负相关性。LmHCT基因的表达量与绿原酸的含量呈显着负相关性,LjHCT基因的表达量与绿原酸的含量呈较强正相关性。LmCCoAOMT基因的表达量与花期绿原酸的含量呈较弱正相关性,LjCCoAOMT基因的表达量与绿原酸的含量呈较强正相关性。（4）构建 了 Lm4CL-pCold-TF、LmCCoAOMT-pCold-TF原核表达载体,在体外表达蛋白,分析了 0.0、0.4、0.6、0.8mmol/L不同浓度的IPTG对蛋白表达的影响。结果表明,两种蛋白主要以包涵体的形式存在,Lm4CL蛋白与pCold-TF空载相比,100 kD-150 kD处有大量的蛋白富集,在0.6 mmoI/L浓度下的IPTG诱导效果最好。LmCCoAOMT蛋白与pCold-TF空载相比,在大约70kD-100kD处有大量的蛋白富集,在0.8 mmol/L浓度下的IPTG诱导效果最好。除此之外对以上蛋白进行了纯化,获得了良好的纯化效果。（5）构建了 Lm4CL-pCAMBIA 1301、LmCCoAOMT-pCAMBIA1301 真核表达载体,为探究绿原酸合成分子机制、进一步提高绿原酸含量奠定理论基础。
康泽钜[3]（2020）在《五个疫霉菌α1性激素诱导差异表达基因的cDNA克隆与CRISPR-cas9编辑载体构建》文中认为疫霉菌是一类毁灭性的植物致病菌,波及范围极其广泛,会造成非常严重的经济损失,其有性生殖对于物种的延续及演化十分重要,但目前分子机理尚不明确。课题组前期工作以致病疫霉菌株P7723（A2交配型）为材料,利用蛋白质组学方法,检测了α1性激素处理后菌株的蛋白表达差异,得到了一批性激素诱导下的差异表达蛋白。本研究选择PITG-03644、PITG-04663、PITG-06415、PITG-13014、PITG-17706基因作为研究对象,对致病疫霉这5个基因的cDNA蛋白编码区进行了克隆及序列分析,并构建了其CRISPR-cas9基因编辑载体,为进一步研究这5个基因的功能以及CRISPR-Cas9基因编辑技术在致病疫霉研究中的应用奠定了基础。实验结果表明,致病疫霉菌株P7723 PITG-03644 cDNA蛋白编码区序列为609bp长,编码的氨基酸为202个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-04663 cDNA蛋白编码区序列为1760bp长,编码的氨基酸为587个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-06415 cDNA蛋白编码区序列为2121bp长,编码的氨基酸为706个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-13014 cDNA蛋白编码区序列为1182bp长,编码的氨基酸为393个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-17706 cDNA蛋白编码区序列为2337bp长,编码的氨基酸为778个,与NCBI公布的核苷酸、氨基酸序列相似性分别为99.57%和99.61%。与公布的核苷酸序列相比较,本实验克隆的序列在878-886bp处有9个碱基TTCGTCAGC的插入突变,造成其编码的氨基酸序列在第292个氨基酸处多了 3个氨基酸SAS;另外,与公布的核苷酸序列相比较,本实验克隆的序列在29bp处的C突变为T,但该突变并未引起氨基酸的改变。根据该序列预测的蛋白质三维结构与NCBI序列预测的结构完全一致,故推测二者功能没有差异。生物信息学分析显示,PITG-03644所编码的蛋白为核蛋白,可能是一个疏水性蛋白,带有典型的Rab家族和P-loopNTPase超家族结构域。PITG-04663所编码的蛋白为核蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的bZIP结构域、SRPBCC超家族结构域和Med15结构域。PITG-06415所编码的蛋白为胞质蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的PTZ00272结构域。PITG-13014所编码的蛋白为胞质蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的APPMetAP家族结构域。PITG-17706所编码的蛋白为核蛋白,为亲水性蛋白,带有典型的bZIP结构域。这些蛋白均不含有明显的跨膜区域。针对每个基因的蛋白编码区,分别设计了 2个sgRNA靶位点,并且成功将其克隆到载体pYF515中,成功构建了 5个基因的总共10个CRISPR-Cas9基因编辑载体。
陈继乾[4]（2020）在《梅花鹿S100A16基因cDNA克隆及功能初探》文中研究说明恶性肿瘤发病率正逐年增加,已成为目前人类的首要致死原因,肿瘤的治疗愈加受到关注。S100A16基因为S100基因家族的特殊成员,与恶性肿瘤密切相关。早期研究表明该基因在肿瘤细胞中过表达,但后期研究发现其在不同肿瘤细胞中发挥不同作用,预示着S100A16基因在肿瘤中有特殊表达机制与功能作用。生长期梅花鹿鹿茸因其快速生长速度而成为恶性肿瘤研究的重要模型。该基因在鹿科动物基因的研究中鲜见报道,因此对梅花鹿S100A16基因研究具有重要意义。本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物,以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术和分子克隆技术获得S100A16基因的cDNA序列;通过Q-PCR技术对梅花鹿鹿茸生长前、中和后期间充质组织中S100A16基因表达量的差异进行分析;构建pEGFP-C1-S100A16真核表达载体并转染293T细胞,通过Q-PCR技术分析过表达的S100A16基因对293T细胞中NOTCH1、ZEB1、ZEB2、NANOG、CDKN1A、PSMD9和TP53基因表达量的影响。研究结果表明:（1）梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp,编码103个氨基酸;蛋白含有11个磷酸化位点,有跨膜结构域,无信号肽,为在细胞内发挥作用的稳定蛋白;蛋白在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域,Ca2+结合环由12个氨基酸组成,其N端EF螺旋结构域Ca2+结合环由15个氨基酸组成;蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点;蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;三级结构显示该蛋白有两个离子结合位点。梅花鹿S100A16蛋白与人蛋白功能结构和细胞定位相似。（2）梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高,为100%,其次为绵羊与牛,均为98%。利用S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树,分析表明S100A16蛋白在进化上比较保守,符合功能蛋白的特点。（3）梅花鹿鹿茸生长中期间充质组织的S100A16基因表达量低于前期和后期,该基因在鹿茸生长过程中发挥重要作用。（4）梅花鹿源pEGFP-C1-S100A16真核表达载体构建成功,293T细胞转染率达70%-80%,并成功表达。（5）转染pEGFP-Cl-S100A16真核表达载体与转染pEGFP-C1空载体的293T细胞相比,ZEB1和ZEB2基因表达量极显着下调（P<0.01）,MOTCH1、NAMOG、PSMD9和CDKN1A基因表达量显着下调（P<0.05）,TP53基因表达量不变（P>0.05）。293T细胞中梅花鹿S100A16基因过表达可下调某些促癌基因的表达。
杨文平[5]（2017）在《梭鱼脂代谢相关基因的克隆及饲料营养水平对其脂肪蓄积和代谢的影响研究》文中进行了进一步梳理梭鱼是我国沿海地区低盐度滩塘和海水池塘养殖的重要经济鱼类,也是江苏沿海正在开发的海、淡水养殖新兴品种之一。目前梭鱼的营养需要研究还很有限,配合饲料的配制主要借鉴其他杂食性鱼类的营养需要,在养殖中常发现梭鱼体（尤其是腹部）脂肪过量蓄积的现象。作为配合饲料的重要营养成分:脂肪、蛋白质和糖类的不平衡均会导致脂代谢紊乱和脂肪的过量蓄积,其发生、发展过程和脂代谢关键因子有着重要的联系。本文借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得梭鱼脂代谢关键因子过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR）α 和γ、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）基因全长cDNA和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase）基因cDNA片段,测定了梭鱼上述基因在不同组织中的表达模式;研究了饲料脂肪、蛋白水平对梭鱼体组织脂肪蓄积和脂代谢基因表达的影响。研究结果可以为梭鱼配合饲料的开发及梭鱼脂质代谢的调控提供必要的参考。1.饲料脂肪水平对梭鱼生长、血液生化和肝脏抗氧化性能的影响采用单因子浓度梯度法,以鱼油为脂肪源,制成脂肪含量分别为2.04%、4.83%、7.47%、9.79%、12.01%、14.59%的六组等氮等能（蛋白含量为 30.70 土0.12%;总能22.32±0.13 MJ/kg）的饲料。健康的梭鱼鱼种（均重9.5±0.3 g）,随机分为6组,每组3个重复,每个水族箱30尾鱼,分别投喂以上6种不同脂肪水平的饲料,饲养60d。试验结束后,饥饿24h,采样,测定。结果显示:7.47%和9.79%脂肪水平组增重率、饵料系数均差异不显着（P>0.05）,增重率显着高于其他各组（P<0.05）,饵料系数显着低于其他各组（P<0.05）;9.79%脂肪水平组蛋白质效率显着高于其它各组（P<0.05）,和7.47%组差异不显着（P>0.05）;采用二次多项式回归模型分析梭鱼增重率与饲料脂肪水平之间的关系（二次性,P<0.001）,确定了梭鱼适宜的脂肪水平,脂肪水平作为自变量（X）,增重率作为因变量（Y）,得到回归方程:Y=-0.8238 X2+14.949 X+162.51（R2=0.7750）,当X=9.1%时,梭鱼幼鱼的增重率最高。血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平随脂肪水平的增加显着升高（线性,P<0.05）;脂肪水平对甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇四种血脂指标影响不显着（P>0.05）。过氧化氢酶活性随脂肪水平的升高呈先升高后降低的趋势（二次性,P<0.001）,总超氧化物歧化酶活性表现出相同的变化趋势（二次性,P<0.001）,总抗氧化能力随脂肪水平的升高而下降（线性,P=0.014）,与此相反,丙二醛含量随脂肪水平的升高而升高（线性,P<0.001）。鉴于脂肪水平为7.47%和9.79%时,鱼体均获得了较好的生产性能和肝脏生化指标,因此梭鱼幼鱼饲料中脂肪水平以7.5%～10%为宜。2.饲料脂肪水平对梭鱼形体指标、体脂蓄积和脂肪酸组成的影响饲养方案同1。结果表明:肝体指数和脏体指数均随脂肪水平的升高呈先降低后升高的趋势（二次性,P<0.05）,脂肪水平为4.83%、7.47%、9.79%、12.01%的四组间,差异均不显着（P>0.05）。肌肉和全鱼中脂肪含量和饲料脂肪水平呈正相关（线性,P<0.05）,肌肉、肝脏和肠系膜脂肪三种组织脂肪蓄积量占鱼体总脂的比例分别为 20.30%～24.31%、2.43%～2.95%、11.33%～12.47%;各脂肪水平组间差异均不显着（P>0.05）。随着饲料脂肪水平（鱼油）的增加,三种组织和全鱼油脂中多不饱和脂肪酸的含量均有所增加,n-3/n-6多不饱和脂肪酸的比例也显着提高（P<0.05）。研究还发现,各试验组内,三种组织和全鱼油脂中22:6n-3含量都高于20:5n-3。3.梭鱼脂肪代谢相关基因的克隆及组织表达分析采用反转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增法技术克隆了梭鱼PPARα、PPARγ、LPL基因全长cDNA序列和FAS基因部分cDNA序列;并采用实时荧光定量PCR技术研究了梭鱼上述4种基因在不同组织中的表达情况,结果如下:（1）PPARα基因全长cDNA序列克隆及组织表达分析克隆了梭鱼PPARα基因全长cDNA序列（GenBank:KJ848472.1）,包含2409个碱基,编码478个氨基酸。序列比对分析表明,PPARa基因具有4个功能区域,分别为保守性差的N端区域、DNA结合区、可变的铰链区、C端配体结合区;梭鱼PPARα和其他物种的相似性很高,一些重要的功能位点在进化过程中高度保守。PPARα基因在所有被检测组织中均有表达,其中,在肝脏组织表达量最高,其次是脑、胃、皮肤、脾、腹腔肠系膜脂肪、鳃、肾、肠、心脏,肌肉中表达量最低。（2）PPARy基因全长cDNA克隆及组织表达分析克隆了梭鱼PPARγ基因全长cDNA序列（GenBank:KJ848473.1）,包含2985个碱基,其中5’端非编码区为200bp,3’端非编码区为1183 bp,开放阅读框1602 bp,编码533个氨基酸。PPARγ基因和PPARα基因类似,也具有4个功能区域:保守性差的N端区域、DNA结合区、可变的铰链区、C端配体结合区;序列比对分析表明,梭鱼和脊椎动物的序列相似性很高,该基因在进化过程中保守。PPARγ基因在被检测的11种组织中均有表达,腹腔肠系膜脂肪中表达量最高,其次是肠、鳃、肾、肝脏、皮肤、脑、脾、胃,心脏和肌肉中表达水平很低。（3）LLPL基因全长cDNA克隆及组织表达分析克隆的梭鱼LPL全长cDNA序列（GenBank:KJ825894.1）包含2395个碱基,5’端非编码区为168 bp,3’端非编码区为676 bp,开放阅读框为1551 bp,编码516个氨基酸。序列比对分析表明,LPL基因可以划分为N末端（24-362位氨基酸残基）和C末端（363-516位氨基酸残基）两个结构区域,一些重要的功能位点如脂肪结合域、催化三联体（Ser-Asp-His）等在进化过程中高度保守。LPLmRNA在所有被检测组织中均有表达,腹腔肠系膜脂肪中表达量最高,其次是肝脏、胃、肾、鳃、肠、脑、心脏、脾脏,在肌肉中表达量较低。（4）FAS基因cDNA部分序列的克隆及组织表达分析克隆的梭鱼FAS基因cDNA部分序列（GenBank:KJ848474.1）长920 bp,编码303个氨基酸。序列分析表明,梭鱼FAS基因和其他物种的该基因相似性为74%～95%。FAS基因mRNA在梭鱼被检测组织中表达丰度差异显着（P<0.05）,脑中含量最高,其次是肝脏和腹腔肠系膜脂肪组织,肌肉中表达量最低,其余7种组织中的表达量均显着低于脑和肝脏（P<0.05）。4.饲料脂肪水平对梭鱼脂代谢相关基因表达和酶活性的影响饲养方案同1。结果表明:肝脏中PPARα基因mRNA的丰度随脂肪水平的升高而升高（P<0.05）,腹腔肠系膜脂肪和肌肉中PPARα基因mRNA表达量随脂肪水平的升高无显着变化（P>0.05）。肌肉、肝脏、肠系膜脂肪组织中PPARγ基因mRNA表达丰度在脂肪水平增加时有升高趋势,但三种组织中各组间均差异不显着（P>0.05）。腹腔肠系膜脂肪和肌肉中LPLmRNA、FAS mRNA表达量各组之间差异均不显着（P>0.05）。肝脏中LPL mRNA的丰度随脂肪水平的升高显着升高（P<0.05）,12.01%和14.59%两组表达水平显着高于2.04%、4.83%和7.47%三组（P<0.05）;肝脏中LPL酶活性也随脂肪水平的升高表现出相同的变化趋势,14.59%组酶活性显着高于2.04%和4.83%组（P<0.05）。随着饲料脂肪水平的升高,肝脏中FAS mRNA的表达丰度显着下降（P<0.05）,12.01%和14.59%两组均显着低于2.04%组（P<0.05）,其余三组之间差异不显着（P>0.05）;肝脏中FAS酶活性随脂肪水平的升高也显着下降,14.59%组显着低于2.04%和4.83%组（P<0.05）。5.饲料蛋白水平对梭鱼体脂蓄积、肝脏抗氧化性能、脂代谢相关基因表达和酶活性的影响配制蛋白含量分别为26%、28%、30%、32%的四组等能等脂（总能12.48 土0.10 MJ/kg;脂肪水平5.13±0.12%）饲料,配方中采用玉米淀粉补充蛋白浓度降低导致的能值缺失。均重92.20±4.23 g的梭鱼随机分到工业化养殖池中,随机分为4组,每组3个重复,每个水池2300kg（约25000尾鱼）,分别投喂以上4种不同蛋白水平的饲料,养殖周期60 d,试验结束后饥饿24h,取样,测定。结果显示:肌肉、肝脏和肠系膜脂肪组织脂肪蓄积量占鱼体总脂的比例分别为23.29%～24.98%、3.30%～4.27%、7.11%～12.75%,各蛋白水平组间差异不显着（P>0.05）,三种组织中均以26%蛋白水平组脂肪蓄积比例最高。肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（二次性,P=0.012）和总超氧化物歧化酶（二次性,P=0.014）活性随饲料蛋白水平的升高先增加后下降;26%蛋白组丙二醛含量显着高于其余三组（P<0.05）;各组间总抗氧化能力、过氧化氢酶活性差异不显着（P>0.05）。随蛋白水平的增加,肌肉中PPARα基因mRNA表达水平先降低后升高,肠系膜脂肪中变化趋势和肌肉中相似,均以30%蛋白组表达水平最低（P<0.05）;肝脏组织中各组间差异不显着（P>0.05）。三种组织中PPARγ基因mRNA表达水平均以26%组表达量最高,除肌肉组织中32%蛋白水平组外,各组织中26%组显着高于其它各蛋白水平组。三种组织中FAS mRNA表达水平和酶活性变化趋势一致,随饲料蛋白水平的升高均先降低后升高,各组织中均以26%组FAS mRNA表达水平和酶活性最高,28%和30%组间差异均不显着（P>0.05）,然后在32%组又均有所提高。三种组织中LPL mRNA的丰度无显着差异（P>0.05）,肠系膜脂肪组织中各组间LPL酶活性差异不显着（P>0.05）,肌肉和肝脏中LPL酶活性随蛋白水平的升高呈升高趋势。综上所述,得出如下结论:（1）适宜的脂肪水平可以促进梭鱼的生长,提高生产性能,过高的脂肪水平（12.01%和14.59%）会抑制鱼体生长,降低肝脏的抗氧化能力,还会导致体组织（肌肉、肝脏）及全鱼蓄积较多的脂肪,因此饲料中应避免添加过多的脂肪;随鱼油添加水平的提高,组织中多不饱和脂肪酸尤其是n-3系列有显着提高,和EPA相比,梭鱼幼鱼体组织选择性沉积更多的DHA;梭鱼幼鱼三种脂肪蓄积位点的脂蓄积量占鱼体总脂的比例由高到低依次为肌肉、腹腔肠系膜脂肪组织、肝脏。（2）梭鱼PPARα、PPARγ、LPL、FAS四种基因编码序列保守性良好,在所有被测组织中均有表达,四种基因在不同组织中表达量差异显着。PPARα mRNA在肝脏中高表达,PAPARγ、LPL mRNA在腹腔肠系膜脂肪组织表达量最高,而FAS mRNA在脑、肝脏、腹腔肠系膜脂肪组织中高水平表达。（3）随脂肪水平的升高,脂肪分解基因PPARα和LPL mRNA在肝脏中的表达水平显着提高,LPL的酶活性也显着增加,而脂肪生成基因FAS mRNA表达和酶活性均显着下降。（4）在等能等脂条件下,低蛋白组（26%）和高蛋白组（32%）,尤其是前者,上调了组织（肌肉、肝脏、腹腔肠系膜脂肪）生脂基因PPARγ和FAS的mRNA表达及后者的酶活性,也增强了组织脂肪的沉积,两种蛋白水平下,组织中PPARαmRNA表达水平均有提高,而高蛋白水平（32%）较低蛋白水平（26%）显着提高了 LPL的酶活性。蛋白水平试验中梭鱼幼鱼三种脂肪蓄积位点的脂肪蓄积模式和脂肪水平试验相同。
潘滢[6]（2018）在《海蜇转录组文库分析及Wnt3、Frizzled5/8和β-catenin基因的克隆和表达》文中研究表明本研究基于构建的海蜇（Rhopilema esculentum）转录组文库,通过生物信息学方法分析和深入挖掘,解析了海蜇Wnt信号通路3个关键基因Wnt3、Frizzled5/8和β-catenin的cDNA和基因组结构,通过荧光实时定量PCR和整体原位杂交技术分析,进一步阐明了这些基因在海蜇无性繁殖过程的表达规律,进而为了解海蜇无性繁殖的分子调控机制提供参考和依据,以下为获得的主要研究结果:1.海蜇转录组文库的构建及生物信息学分析以454 GS FLX技术对半板海蜇转录组文库进行测序,获得了 58万多条序列,其中总长度约240 Mb,平均长度409.2 bp。去除引物和低质量的序列（<100bp）,共获得49万条高质量的ESTs序列。组装了 37628条功能基因,并将其归类于海蜇的细胞定位,分子功能和生物过程等功能,其中参与细胞定位,分子功能和生物过程的功能基因分别占库容的30.88%,31.45%和37.67%。比较转录组学方法分析发现海蜇含有己发现的大部分Wnt信号通路的关键基因,除Wntl0外,海蜇拥有12个Wnt家族基因的ESTs序列、5个Frizzed ESTs序列和两个β-catenin ESTs序列。2.海蜇Wnt3基因的克隆、基因组结构与表达首次克隆到的海蜇Wnt3（ReWnt3）基因的cDNA全长为2074 bp,其中开放阅读框为1080 bp,编码长度为360个氨基酸的多肽,内含有23个高度保守的半胱氨酸。ReWnt3基因组全长为4704bp,由5个外显子和4个内含子组成,其结构与水螅Wnt3基本相似。多序列比对显示,ReWnt3与其他刺胞动物门的氨基酸序列具有较高的一致性,其中与半球美螅水母C.hemisphaerica同源性达到32.8%。系统进化分析显示,脊椎动物的Wnt3和Wnt3a家族分别形成两个姊妹群,然后与半索动物囊舌虫刺胞聚为一支,最后与刺胞动物门的Wnt3聚成一个类群,形成了从低等到高等动物,从简单到复杂的Wnt3逐级进化模式。荧光实时定量PCR分析发现ReWnt3广泛表达于海蜇无性繁殖四个不同过程,并随着发育过程的不同其表达量而有所差异,其中横裂体的mRNA表达量最高。3.海蜇Frizzled 5/8基因的克隆、基因组结构与表达首次克隆到的海蜇Frizzled 5/8基因（ReFzd 5/8）的cDNA全长为2166 bp,其中开放阅读框长1701 bp,编码567个氨基酸组成的多肽。SMART分析表明,ReFzd 5/8基因符合Frizzled家族的结构特点,即包含一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域（CRD）、一个七个跨膜片段的跨膜结构域、以及一个信号肽（21个氨基酸）。ReFzd5/8基因组无内含子。BLAST分析结果表明,ReFzd 5/8的氨基酸序列与来自刺胞动物门的半球美螅水母Clytia heanisphaeric 和大乳头水螅Hydra,magnipapillata的Frrizled具有很高的同源性。系统进化分析表明,ReFzd5/8首先和来自刺胞动物门的海葵Fzd聚类在一起,然后与来自不同物种的Fzd5和8基因聚类在一起。实时荧光定量PCR结果显示,在海蜇无性繁殖的4个不同发育阶段均发现了 ReFzd 5/8基因的表达,其表达量随着发育阶段的不同有明显差异。其中横裂体的相对表达水平最高,其表达量分别是螅状体、稚水母和碟状体的6.90、4.35和1.74倍。整体原位杂交技术发现螅状体的触手和基座存在ReFzd 5/8基因的表达。4.海蜇β-catenin基因的克隆与表达首次克隆到的海蜇β-catenin（ReBcn）基因的全长cDNA为3035 bp,其中编码区为2451bp,编码了由816个氨基酸组成的多肽。SMART分析表明,ReBcn基因含有一个卷曲螺旋的结构域,但不存在信号肽。BLAST分析表明,ReBcn与来自刺胞动物门的半球美螅水母Clytia hemisphaerica、大乳头水螅Hydra magnipapillata、Podocoryna carnea、海洋水螅 Hydractinia echinata 和普通水螅Hydra vulgris具有很高的同源性,其氨基酸序列一致性都在74%以上。利用N-J法构建β-catenin系统树显示,ReBcn与刺胞动物门的ββ-catenin聚类在一起,形成了刺胞动物门ββ-catenin的独立分支。通过RT-PCR技术发现,在海蜇无性繁殖的四个不同阶段均存在着ReBcn的表达,相比其他不同发育阶段,碟状体的表达量最多。
钟雅婷[7]（2014）在《广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建》文中认为使用猪源器官进行异种移植被认为是解决当前人源供体器官短缺,治疗终末期器官疾病的有效方法之一。而广西巴马小型猪是采用闭锁纯繁近交方式选育的广西地方特有的小型猪品种,是一种遗传稳定,性状优良的实验动物,可作为异种移植的理想器官供体。但是,由于广西巴马小型猪体内普遍存在猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovirus, PERV）,能够以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中,并随细胞染色体复制而复制。PERV在体外可以感染多种人源细胞的发现,引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。因此,有必要开展广西巴马小型猪PERV的基础研究,了解其感染机制,以评估PERV的病原安全性。本研究采用PCR技术,扩增获得4条覆盖广西巴马小型猪PERV全基因的重叠片段,经拼接获得1条完整的广西巴马小型猪PERV （PERV-BM）全基因序列,大小为8774bp。遗传进化分析表明PERV-BM属于PERV A亚型；序列分析发现,PERV-BM的5’UTR的启动子和增强子区域分别位于400-467bp与313-432bp位置；对推导氨基酸序列分析则发现病毒的env蛋白中含有15个可能的抗原表位,其跨膜区位于600-622aa位置,含有Ser、 Thr和Tyr磷酸化位点的数量分别为20、7和9个,并含有10个可能的糖基化位点。利用分子钟假说对PERV-BM的3’LTR及本实验扩增的另外8条PERV-BM的3’LTRs进行分析,结果表明PERV-BM大约进化于7.1×106年前。在完成全基因测序的基础上,本研究进一步构建了PERV-BM全基因cDNA克隆。将4个覆盖全基因组的重叠基因片段通过pMD18-T中间载体依次连接并克隆到pBluescript Ⅱ SK （-）载体上,构建cDNA克隆。将该cDNA克隆与GenBank登录所有PERV全序列进行比对分析,发现存在15个保守碱基的突变。为消除这些突变位点在下一步病毒拯救中造成的潜在影响,通过定点突变和化学合成的方法成功恢复15个突变碱基。将突变后的PERV-BM全长序列上传GenBank,登录号为HM159246。同时为便于鉴定,本研究还在所构建cDNA克隆上引入突变,将BM-PERV全长cDNA克隆第8408位碱基由A突变为C,引入新的单一酶切位点Aat Ⅱ,获得了cDNA克隆的突变株。经Not Ⅰ/Nhe Ⅰ、Nhe Ⅰ/Cal Ⅰ、Not Ⅰ/Cal Ⅰ酶切及全长测序鉴定,证实所构建的cDNA克隆为PERV-BM全基因的cDNA克隆,命名为pBluescript Ⅱ SK-PERV-BM。接着通过反向遗传的方法构建了PERV-BM感染性cDNA克隆并对其进行了初步鉴定,为从DNA水平上探索PERV的感染机制以及感染人源细胞后的复制、转录等过程打下坚实基础。
胡飞[8]（2012）在《桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究》文中进行了进一步梳理桔小实蝇Bactrocera dorsalis （Hendel）隶属双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,果实蝇属Bactrocera Macquar,是一种重要的危险性果蔬害虫。鉴于桔小实蝇在生产上的经济重要性,近年来有关桔小实蝇种群遗传结构、引诱剂研发、化学防治等方面的研究日益增多。然而,长期持续、不合理的使用化学杀虫剂导致其产生了严重的抗药性。目前,桔小实蝇抗性机理方面的研究主要集中于靶标酶-乙酰胆碱酯酶的生化及分子生物学特性,而对于解毒酶系与桔小实蝇抗性发展的关系知之甚少。谷胱甘肽S-转移酶（gluthione S-transferase, GSTs, EC2.5.1.18）是一类多功能超基因家族酶。GSTs作为重要的解毒代谢酶,主要功能是催化一些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合,增加其疏水性使其易于排出体外,从而达到解毒的目的。目前已知昆虫特有的GSTs Delta和Epsilon家族成员参与了昆虫对有机磷类、有机氯类和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的形成。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,瞄准昆虫适应逆境胁迫的机理这一研究热点,系统开展了桔小实蝇GSTs生化毒理学特性、GSTs基因的全长序列克隆、转录表达模式及异源表达研究。研究结果将有助于阐明桔小实蝇对杀虫剂抗性产生和发展的分子毒理学机理,从而在实践中建立基于GSTs的自然种群抗性的分子诊断技术。旨在为桔小实蝇的可持续治理提供理论依据,同时丰富和发展昆虫抗性机理研究的科学理论和技术体系。通过近三年的研究,取得的主要研究结果如下：1桔小实蝇GSTs的纯化及生化毒理学特性1.1桔小实蝇不同种群GSTs的纯化及生化毒理学特性采用Glutathione Sepharose4B亲和层析法对桔小实蝇4个地理种群（东莞、广州、海南和云南）的GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明,桔小实蝇4个种群GSTs纯化后的比活力相似,但广州种群的GSTs纯化回收率最低（31.54%）。聚丙酰胺凝胶电泳显示4个种群GSTs均只有一条大小为23kDa的条带。以CDNB为底物时,东莞和海南种群GSTs的Km值显着地高于广州和云南种群；海南种群GSTs的Vmax值在4个种群间最高。4个种群的GSTs最适反应温度均是37℃,最适pH值为7.5。离体抑制作用测定结果表明,利尿酸、四溴磺酚钠、马来酸二乙酯、双硫仑、姜黄素和高效氯氰菊酯均对桔小实蝇GSTs有很高的抑制率,而马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇4个种群GSTs的抑制率均未到达50%。结果暗示GSTs可能介导桔小实蝇对高效氯氰菊酯的代谢抗性。1.2桔小实蝇不同发育阶段GSTs的纯化及生化毒理学特性采用Glutathione Sepharose4B亲和层析法对桔小实蝇不同发育阶段（三龄幼虫、蛹、成虫）GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明,洗脱得到的桔小实蝇GSTs活性主要集中在洗脱收集到的3-5管。桔小实蝇成虫GSTs的总活性和比活力分别是370.76nmo1.min-1和16.91nmo1.min-1.μg-1,且显着高于三龄幼虫和蛹期。SDS-PAGE结果显示,桔小实蝇3个发育阶段的GSTs纯化后均获得单一条带,且分子量大小均为23kDa。无论以CDNB或GSH为底物时,桔小实蝇幼虫期GSTs的Km值均显着低于蛹和成虫期,而3个发育阶段间GSTs的Vmax无显着性差异。桔小实蝇3个发育阶段的GSTs最适反应温度均是37℃,最适pH值为7.5。利尿酸（1.15μM）和马来酸二乙酯（0.60μM）对桔小实蝇成虫期GSTs的I50。显着地低于其余两个发育阶段；四溴磺酚钠对桔小实蝇不同发育阶段GSTs的I50无显着差异；双硫仑对蛹和成虫期GSTs的I50均显着地高于三龄幼虫,而蛹和成虫间无显着差异；姜黄素对桔小实蝇成虫GSTs的I50（101.78μM）显着地高于三龄幼虫和蛹期；高效氯氰菊酯对蛹和成虫期GSTs的I50（0.90和0.78mM）显着地高于幼虫阶段；但马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇3个发育阶段的GSTs的抑制率均未到达50%。结果暗示桔小实蝇幼虫期对杀虫剂高效氯氰菊酯相对更为敏感。2桔小实蝇GSTs基因的克隆与序列分析基于桔小实蝇转录组数据,利用RACE技术,从桔小实蝇体内分离克隆了18个GSTs基因的cDNA全长序列。通过序列分析,确定了这18个GSTs基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质。依据其在细胞中的定位,将这18个GSTs基因分为胞质型和微粒体型两大类,分别包含17个和1个基因。根据黑腹果蝇、冈比亚按蚊、埃及伊蚊GSTs基因构建系统发育树,将其中的4个基因归类于Delta家族,8个基因归类于Epsilon家族,2个基因归类于Omega家族,另分别有1个基因归类于Theta和Zeta家族,而余下的1个基因则不能划分在已知的类型中,暂将其归为未分类家族Unclassified。这些胞质GSTs基因根据命名法则命名并在GenBank上登录,其名称和登录号分别为：BdGSTdl （JQ690090）、BdGSTd2（JN003593）、BdGSTd5（JN792452）、BdGSTd6（JN792453）、BdGSTe1（JN003588）、 BdGSTe2（JN003589）、BdGSTe3（JQ690091）、BdGSTe4（JN003590）、BdGSTe5（JN003591）、BdGSTe6（JQ690092）、BdGSTe7（JN003592）、BdGSTe9（JQ690093）、 BdGSTol （JQ690094）、BdGSTo2（JQ690095）、BdGSTt1（JQ690096）、BdGSTz2（JQ690097）和BdGSTu1（JN003587）。其中,Delta家族基因间的氨基酸同源性介于47.6-57.9%,Epsilon家族基因间的氨基酸的同源性范围为31.8-54.9%,Omega家族基因的氨基酸同源性高达85.4%,而在任意的非同一家族之间,氨基酸序列同源性仅在12.4-30%之间,但BdGSTu1与BdGSTe9的氨基酸特异性为35.9%。此外对这些GSTs基因进行分子特性分析,明确了酶促结合位点和维持酶活性构象的关键氨基酸残基。通过克隆并验证获得桔小实蝇微粒体GSTs基因1个,命名为BdGSTml, GenBank登录号JQ690098。BdGSTm1基因与黑腹果蝇DmGSTm-NP524696的氨基酸序列一致性高达91%。桔小实蝇和其它双翅目昆虫微粒体GSTs的多重比对分析发现,桔小实蝇微粒体GSTs基因中含有昆虫微粒体GSTs中特有的结构域D-P-X-V-E-R-V-R-R-A-H-X-N-D-X-E-N-I-L-P,且昆虫微粒体GSTs的氨基酸序列较短,通常在150个氨基酸左右。3桔小实蝇GSTs基因的表达模式解析3.1桔小实蝇GSTs基因在不同发育阶段的表达模式在成功建立了桔小实蝇18个GSTs基因的qPCR反应体系的基础上,以桔小实蝇a-Tubulin基因作为内参基因,对这18个GSTs基因在不同发育阶段（卵、龄、二龄、三龄幼虫、蛹和成虫）mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果发现,桔小实蝇卵期仅BdGSTel基因过量表达,暗示该基因可能与保幼激素和蜕皮激素的调控存在关联；桔小实蝇6个GSTs基因（BdGSTd2、BdGSTd5、BdGSTe5、 BdGSTe9、BdGSTt1和BdGSTz2）在幼虫期的相对表达量高于成虫期,暗示参与了幼虫期的代谢活动；桔小实蝇BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTe4和BdGSTe6基因随着桔小实蝇的生长发育,表达量增加上调,这表明在桔小实蝇个体发育过程中解毒代谢能力也随之增强。3.2桔小实蝇GSTs基因在不同组织部位的表达模式以a-Tubulin基因为内参基因,对18个GSTs基因在桔小实蝇中肠、脂肪体和马氏管3个组织中的mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果表明,桔小实蝇BdGSTd5、BdGSTe3和BdGSTe9基因在中肠中的表达量最高,而且这3个GSTs基因都归属于昆虫特有的家族,暗示这些基因可能在外源化合物解毒代谢过程中起着重要的功能作用。其它GSTs基因在中肠不表达,可能在其他组织中起着类似的功能作用。桔小实蝇BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe6和BdGSTz2基因在脂肪体中相对表达量最高,表明这些基因可能参与解毒代谢外源化合物或保护机体免受氧化应激。桔小实蝇BdGSTd1、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe7和BdGSTul基因在马氏管中有较高的表达量。GSTs基因在桔小实蝇马氏管中的具体作用还不清楚,推测可能和参与增强马氏管的排泄作用有关。3.3桔小实蝇GSTs基因在3种杀虫剂诱导后的表达模式利用有机磷类杀虫剂马拉硫磷、生物源杀虫剂阿维菌素及拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氰菊酯对桔小实蝇进行不同时间和剂量诱导,进而应用qPCR技术解析桔小实蝇18个GSTs基因在药剂诱导后的表达模式。结果表明,马拉硫磷对桔小实蝇诱导的时间效应中,5个GSTs基因（BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6和BdGSTm1）诱导12h后相对表达量最高,2个GSTs基因（BdGSTd2和BdGSTo1）诱导24h后相对表达量达最高峰,而另外8个GSTs基因（BdGSTd1、BdGSTe1、 BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTo2、BdGSTtl、BdGSTz2和BdGSTul）相对表达量的最高峰延迟到诱导后48h,说明这些GSTs基因可能均参与马拉硫磷在桔小实蝇体内的代谢过程。马拉硫磷亚致死剂量（LD10）处理桔小实蝇24h后,10个GSTs基因（BdGSTd1、BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe2、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6、 BdGSTo2、BdGSTt1和BdGSTul）相对表达量最高,表明这些基因可能介导桔小实蝇对马拉硫磷的代谢抗性。阿维菌素对桔小实蝇诱导的时间效应中,2个GSTs基因（BdGSTe6和BdGSTm1）诱导12h后相对表达量最高,6个GSTs基因（BdGSTd1、BdGSTd2、 BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe4和BdGSTe9）诱导24h后相对表达量达最高峰,阿维菌素致死中剂量（LD50）诱导桔小实蝇24h后,7个GSTs基因（BdGSTd1、 BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6和BdGSTml）相对表达量达到最高峰,暗示这些GSTs基因可能均参与阿维菌素在桔小实蝇体内的解毒代谢作用。高效氯氰菊酯对桔小实蝇诱导的时间效应中,3个GSTs基因（BdGSTe2、 BdGSTe5和BdGSTe6）诱导12h后相对表达量最高,而另外6个GSTs基因（BdGSTe4、BdGSTe9、BdGSTo2、BdGSTt1、BdGSTu1和BdGSTml）相对表达量的最高峰延迟到诱导后36h,说明这些GSTs基因可能均参与高效氯氰菊酯在桔小实蝇体内的代谢过程。而高效氯氰菊酯亚致死剂量（LD10）诱导桔小实蝇后,BdGSTd1、BdGSTe4、BdGSTe7和BdGSTtl基因表达上调,暗示桔小实蝇GSTs基因可能参与高效氯氰菊酯的解毒代谢过程。3.4桔小实蝇GSTs基因在不同品系中的表达模式采用定量PCR技术,以a-Tubulin基因为内参基因,解析克隆获得的桔小实蝇18个GSTs基因在实验室选育并保存的桔小实蝇马拉硫磷和高效氯氰菊酯抗性品系及敏感品系中的表达模式。结果表明,在马拉硫磷抗性品系中,BdGSTd5、 BdGSTe9和BdGSTz2基因的相对表达量显着高于敏感品系,而BdGSTe1、BdGSTe2和BdGSTtl在抗性品系中的相对表达量显着低于敏感品系。暗示这些GSTs基因可能介导了桔小实蝇对马拉硫磷抗性的形成。桔小实蝇高效氯氰菊酯抗性品系中,8个GSTs基因（BdGSTd6、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe6、BdGSTe7、 BdGSTtl和BdGSTm1）在抗性品系中的相对表达量显着高于敏感品系,暗示这些基因可能参与了桔小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢作用。4桔小实蝇BdGSTe5基因的原核表达采用NdeI和HindⅢ双酶切位点及DNA重组技术构建了桔小实蝇BdGSTe5基因基于BdGSTe5-pET28a （+）的原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳发现含有重组质粒BdGSTe5-pET28a（+）的细菌中在27kDa下方有一条特异性的蛋白质条带。根据蛋白质分子量估算,表达的融合蛋白质分子量大约为26kDa,由于6×His-tag标签及其侧翼序列片段大约占1kDa,因此该特异性条带分子量与预期表达的融合蛋白大小相一致。采用Ni柱和DEAE柱依次对BdGSTe5-pET28a（+）重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE验证,在分子量为27kDa处获得单一条带。综上所述,通过亲和层析法分离纯化GSTs并比较研究纯化产物的动力学和毒理学特性；应用高通量测序及RACE技术克隆桔小实蝇GSTs基因的全长序列,结合qPCR技术解析其mRNA在桔小实蝇不同发育阶段、不同组织部位和不同品系中的表达模式,鉴定了参与该虫抗性的GSTs基因。研究结果将促进对桔小实蝇GSTs基因生理功能的认识,为桔小实蝇抗性相关GSTs基因的鉴定提供理论依据,并对阐释GSTs介导桔小实蝇代谢抗性的分子生物学机制具有重要的理论意义。
王芳[9]（2011）在《鹅脂肪性状相关基因的克隆表达及LEPR在脂肪细胞中的功能研究》文中进行了进一步梳理leptin receptor （LEPR）基因在调节机体能量平衡、脂肪贮存中发挥重要功能,Adipose triglyceride lipase （ATGL）和Lipoprotein lipase （LPL）是机体脂质代谢的关键酶,参与脂肪细胞的分化过程,Toll-like receptor 4 （TLR4）和Interleukin-6（IL-6）是机体免疫炎症反应相关蛋白因子,在由肥胖所引起的炎症反应中发挥重要作用。本研究在克隆鹅LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6基因的cDNA序列的基础上,利用实时荧光定量PCR方法研究了各基因在鹅脂肪组织中的表达分布、以及在填肥后的表达差异情况,用RNA干扰（RNAi）技术研究了LEPR基因对鹅脂肪细胞中分化、代谢、免疫反应相关基因的表达调控作用,进一步研究了罗格列酮（Rosiglitazone）和GW-9662对脂肪细胞中基因表达的影响,分析LEPR对脂肪细胞基因的表达调控与Peroxisome proliferators-activated receptor gamma （PPARy）通路间的可能关系。主要研究结果如下：1. LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6基因cDNA序列的获得与分析利用RT-PCR方法和RACE技术,克隆得到鹅LEPR基因全长cDNA序列,以及鹅ATGL, LPL, TLR4和IL-6基因的全长编码区（coding sequence, CDS）序列。结果表明,鹅LEPR基因全长cDNA序列4,370bp （GenBank登录号为HQ699480）,其中包括628bp的5’UTR （untranslated region, UTR）、3,468bp的编码区（coding region, CDS）和239bp的3’UTR。翻译编码1,156个氨基酸,与鸭的同源性达到90%以上,与鸡、火鸡的同源性达到75%以上,与人等哺乳动物的同源性少于50%。本实验所获得的鹅ATGL基因cDNA序列有1,462bp （GenBank登录号为HQ914789）,其中包括14bp的5’UTR、1,446bp的编码区。翻译编码482个氨基酸,与鸭的同源性达到90%,与鸡的同源性达到86%,与其他鸟类的同源性均达到85%以上。本实验中获得的鹅LPL基因cDNA序列有1,765bp （GenBank登录号为JF343526）,其中包括1,482bp的编码区和283bp的3’UTR。翻译编码494个氨基酸,与鸭的同源性达到97%,与鸡的同源性达到94%,与麻雀的同源性达到92%。本实验中获得的鹅TLR4基因cDNA序列有2,641bp （GenBank登录号为HQ436371）,其中包括79bp的5’UTR,2,532bp的编码区和30bp的3’UTR。翻译编码843个氨基酸,与鸡和麻雀的同源性达到70%以上,与人等哺乳动物的同源性小于50%。本实验中获得的鹅IL-6基因cDNA序列有802bp （GenBank登录号为JF437643）,其中包括70bp的5’UTR,705bp的编码区和27bp的3’UTR。翻译编码234个氨基酸,与鸡的同源性达到74%,与人的同源性只有39%。2.鹅LEPR, ATGL, LPL, TLR4, IL-6基因表达的组织特异性研究利用实时荧光定量PCR法研究了LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6基因在鹅体内表达的组织特异性,以及各基因在填肥鹅和对照鹅间的表达差异。组织表达特异性结果表明,鹅LEPR较高表达于脑、肝、骨骼肌、肺和腹脂中,在小肠中的表达量最低；ATGL基因在皮下脂肪的表达量较高,在胃和肺中的表达量较低；LPL基因在心脏、腹脂、骨骼肌中表达量较高,在脾脏中的表达量较低；TLR4基因较高表达于肝脏中,在皮下脂肪和肺中表达量较低；IL-6基因在肝脏中的表达量显着高于其他组织,在脑和小肠中表达量较低。填肥鹅与对照鹅间差异表达结果显示,经填肥后,LEPR基因在皮下脂肪、肾脏和小肠中的表达量显着升高：ATGL基因在皮下脂肪中的表达量显着下降,在腹脂和肺中的表达量升高；LPL基因在腹脂、肝脏和小肠中的表达量显着升高,而在心脏中的表达量显着下降：TLR4基因在皮下脂肪和小肠中的表达量显着升高,在心脏中的表达量显着降低；IL-6基因在皮下脂肪、胃、小肠和脑中的表达量显着升高。各基因在填肥后的表达变化揭示其在鹅的脂肪代谢过程中可能发挥重要作用。3.鹅LEPR对脂肪细胞分化、代谢相关功能基因的表达调控研究通过鹅前体脂肪细胞体外培养,利用RNAi技术研究了LEPR基因对脂肪代谢相关基因的表达影响。研究结果表明：鹅脂肪细胞分化过程,各基因（LEPR, ATGL、LPL、TLR4和]L-6）的mRNA表达水平随着细胞分化而逐渐升高,鹅ATGL基因在第6天表达量较高,后期表达量逐渐下降,LEPR、LPL和TLR4基因均在第8天表达量最高,到第10天表达量下降,而IL-6基因在第4天表达量较高,第6天时下降,到第10天表达量达到最高；油酸可以促进鹅前体脂肪细胞的分化,500μM的作用效果最明显,其作用不同时间对LEPR、LPL、FAS （fatty acid synthase）、PPARy （peroxisome proliferators-activated receptor）、Adiponectin基因的表达水平起到不同程度的促进作用,但抑制了ATGL基因的表达；筛选出了LEPR基因有效的siRNA （LS1）,经干扰条件优化后,干扰效果可达到60%以上;转染LEPR-siRNA干扰LEPR基因表达后,显着降低了FAS、PPARy、ATGL基因的表达水平,而Adiponectin基因的表达显着升高；LEPR基因被干扰后,各基因对油酸的敏感性都不同程度地降低。上述结果显示,油酸可以促进鹅脂肪细胞的分化,而LEPR基因在这一过程中可能发挥了重要的功能。4.鹅LEPR对脂肪细胞中免疫相关基因TLR4和IL-6的表达调控研究通过鹅前体脂肪细胞体外培养,利用RNAi技术研究了LEPR基因对脂肪中免疫相关基因的表达影响。研究结果表明：不同浓度的油酸和E. coli脂多糖（LPS）对鹅脂肪细胞中TLR4和IL-6基因的表达有调控作用,用500gM的油酸和20ng/ml的LPS处理鹅脂肪细胞,均可提高TLR4基因和IL-6基因的表达水平；转染LEPR-siRNA干扰LEPR基因表达后,对TLR4和IL-6基因的表达影响不显着；LEPR基因被干扰后,各基因对油酸和LPS的敏感性都不同程度地降低。上述结果显示,油酸和LPS可以促进鹅脂肪细胞TLR4和IL-6基因的表达,LEPR对TLR4和IL-6基因的表达调控作用不明显,但其可能在油酸/LPS诱发的免疫信号通路中发挥了重要作用。5.罗格列酮（ROS）和GW-9662对鹅脂肪细胞中基因的表达调控研究通过鹅前体脂肪细胞体外培养,研究PPARy激动剂罗格列酮和抑制剂GW-9662对脂肪细胞中基因表达的影响。结果表明用不同浓度的罗格列酮处理脂肪细胞后,不同程度地促进了LEPR、LPL、ATGL、PPARy、FAS和Adiponectin基因的表达,对TLR4和IL-6基因的表达起到了不同程度的抑制作用；用不同浓度的GW-9662处理鹅脂肪细胞后,对本实验所研究的8个基因的表达均起到了不同程度的抑制作用；与对照组脂肪细胞相比,LEPR基因干扰组的细胞用ROS处理显着降低了PPARy、ATGL、FAS和LPL基因的表达量,Adiponectin的表达水平显着提高,TLR4和IL-6基因的表达变化不显着；与对照组脂肪细胞相比,LEPR基因干扰组的细胞用GW-9662处理显着降低了PPARy、FAS基因的表达水平,显着提高了LPL、Adiponectin和IL-6基因的表达水平,对ATGL和TLR4基因的表达影响不显着。揭示罗格列酮和GW-9662可以调控鹅脂肪细胞中基因的表达,LEPR基因在这个调控过程中可能发挥一定作用。
刘巧[10]（2010）在《油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析》文中研究说明可逆性蛋白磷酸化的发现是人类研究细胞信号转导工作中的里程碑。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是催化可逆性蛋白磷酸化和脱磷酸的2种关键酶类。由蛋白磷酸酶所催化的脱磷酸化作用可以改变信号通路中许多关键蛋白质的生理生化特性,如酶催化活性以及蛋白质亚细胞定位等,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡以及个体生长和发育。本论文主要研究结果如下：1)油茶蛋白磷酸酶基因的分离与鉴定。在本实验室已构建的油茶cDNA文库中,鉴定出四条PPase基因,其中1条为MPP基因,长度1436bp；1条为PTP基因,长1067bp；2条为PP2C基因,分别长823bp和1501bp；除最后一条PP2C基因外,它们均含有poly（A）。将此四条cDNA序列经过经过在线翻译并同其它物种的同类蛋白质序列进行比对发现,MPP基因第194-982bp属于编码区,对应其他物种的同种蛋白质的首位至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶MPP基因全长,命名为CoMPP1基因；PTP基因第9-878bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第16或第45个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PTP基因的部分序列,其5’端缺失了编码约16～45个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为CoPTPl基因；长度为823bp的PP2C基因第1-518bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第240个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约240个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为COPP2C1;另一条PP2C基因第2～1162bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第12个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约12个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,3’端缺失了部分非编码区cDNA序列,命名为CoPP2C2。2)油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆。以优良无性系湘林1号种子为材料提取RNA,将其反转录的cDNA作为模板,根据实验室已构建的EST文库核苷酸序列片段以及从油茶近成熟种子cDNA文库中分离鉴定出的三条不完整的PPase基因片段进行拼接,用专业软件Primer Premier 5.0设计RACE特异引物,通过RACE技术扩增出蛋白磷酸酶CoPTP1基因和CoPP2C1基因的完整5’端,克隆产物经过插入pMD18-T载体,以及转化大肠杆菌DH5α菌株等一系列操作之后送至生物公司测序,克隆片断测序结果通过Vector NTI 9.0等生物信息学软件的分析,相互之间有序的拼接,获得了1170bp的CoPTP1基因和1453bp的CoPP2C1基因的全长cDNA序列。3)油茶蛋白磷酸酶的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI 9.0对测序结果进行分析：CoMPP1基因cDNA长度1436bp,含有一个786bp的ORF,编码262个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别为193bp、454bp; CoPTPl基因cDNA长度1170bp,含有一个927bp的ORF,编码309个氨基酸,5端、3端非编码区分别长51bp、189bp; CoPP2C1基因cDNA序列长1453bp,含有一个1113bp的ORF,编码371个氨基酸,5’端、3端非编码区分别为48bp和289bp。在GenBank序列BLAST比对获知三条蛋白磷酸酶CoMPP1、CoPTP1和CoPP2C1与其它物种的同种蛋白序列相似性分别达到84%、71%、79%。根据三条蛋白磷酸酶基因的cDNA序列推导出蛋白质的氨基酸序列,应用一系列生物信息学软件对理化性质、高级结构等进行预测分析,结果显示：CoMPP1蛋白等电点5.17,分子量29.7kDa,不稳定系数32.82,脂肪系数77.75；CoPTPl蛋白等电点7.56,分子量34.7kDa,不稳定系数45.99,脂肪系数103.73；CoPP2C1蛋白等电点5.33,分子量40.2kDa,不稳定系数53.73,脂肪系数80.35；三个磷酸酶均无跨膜结构区域,无信号肽位点,是非分泌蛋白。
二、人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）梅花鹿PDGFA基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 梅花鹿 |
| 1.2 鹿茸生长与再生机制 |
| 1.3 PDGF研究现状 |
| 1.3.1 PDGFA的结构与功能 |
| 1.3.2 PDGFA与肿瘤的相关性 |
| 1.3.3 PDGFA受体及信号通路 |
| 1.3.4 鹿科动物PDGFA基因研究现状 |
| 1.4 试验目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 网络数据及分析处理软件 |
| 2.1.6 试验所用载体 |
| 2.1.7 试验引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及纯化 |
| 2.2.2 反转录合成cDNA |
| 2.2.3 PDGFA基因的克隆 |
| 2.2.4 真核表达载体构建 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞瞬时转染 |
| 2.2.7 细胞总RNA提取及反转录 |
| 2.2.8 Real-time PCR检测PDGFA基因和部分相关基因的表达情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 梅花鹿鹿茸组织总RNA提取结果 |
| 3.2 梅花鹿PDGFA基因克隆及酶切鉴定 |
| 3.2.1 PDGFA基因扩增与克隆 |
| 3.3 PDGFA基因的测序及序列分析 |
| 3.4 真核表达载体构建 |
| 3.4.1 重组质粒pEGFP-C1-PDGFA的菌液PCR鉴定 |
| 3.4.2 重组质粒pEGFP-C1-PDGFA双酶切鉴定 |
| 3.4.3 pEGFP-C1-PDGFA重组质粒测序 |
| 3.5 细胞瞬时转染后的观察 |
| 3.6 转染后细胞总RNA提取 |
| 3.7 荧光定量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PDGFA基因cDNA克隆 |
| 4.2 PDGFA真核表达载体的构建 |
| 4.3 PDGFA真核表达载体在293T细胞中的表达 |
| 4.4 PDGFA互作基因的荧光定量结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因的全长cDNA克隆及定量表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 药用植物的研究进展 |
| 1.2 植物绿原酸生物合成的研究进展 |
| 1.3 国内外研究现状及发展动态 |
| 1.4 植物绿原酸合成关键酶基因研究现状 |
| 1.4.1 4CL基因的研究进展 |
| 1.4.2 HCT基因的研究进展 |
| 1.4.3 CCoAOMT基因的研究进展 |
| 1.5 本文研究的工作设想 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容与技术路线 |
| 第2章 灰毡毛忍冬Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 材料的采集与处理 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因中间片段引物设 |
| 2.2.5 RACE技术的实验原理以及目的基因全长cDNA的克隆 |
| 2.2.6 PCR扩增产物的胶回收 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.8 目的基因与载体的连接 |
| 2.2.9 连接产物的转化 |
| 2.2.10 PCR反应体系及程序 |
| 2.2.11 Lm4CL、LmCCoAOMT的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Lm4CL基因的全长cDNA克隆 |
| 2.3.2 LmHCT基因的全长cDNA克隆 |
| 2.3.3 LmCCoAOMT基因的全长cDNA克隆 |
| 2.3.4 Lm4CL基因序列分析 |
| 2.3.5 LmCCoAOMT基因序列分析 |
| 2.3.6 Lm4CL、LmCCoAOMT生理生化性质分析 |
| 2.3.7 Lm4CL、LmCCoAOMT二级结构及三级结构的预测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 灰毡毛忍冬关键酶基因表达模式分析 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Lm4CL、LmHCT和LmCCoAOMT引物设计 |
| 3.2.2 RNA的提取及逆转录 |
| 3.2.3 定量PCR分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Lm4CL基因的表达模式分析 |
| 3.3.2 LmHCT基因的表达模式分析 |
| 3.3.3 LmCCoAOMT基因的表达模式分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4 关键酶基因表达量与绿原酸含量相关性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绿原酸含量的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 4CL基因表达量与绿原酸含量相关性分析 |
| 4.3.2 HCT基因表达量与绿原酸含量相关性分析 |
| 4.3.3 CCoAOMT基因表达量与绿原酸含量相关性分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 灰毡毛忍冬绿原酸合成关键基因的原核表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 酶切与酶连 |
| 5.2.2 大肠杆菌BL21(star)感受态的制备 |
| 5.2.3 大肠杆菌BL2l(star)转化 |
| 5.2.4 Lm4CL和LmCCoA OMT基因的原核表达 |
| 5.2.5 目的蛋白的纯化 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Lm4CL基因的原核表达 |
| 5.3.2 LmCCoAOMT基因的原核表达 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 Lm4CL、LmCCoAOMT基因过表达载体的构建 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 农杆菌感受态的制备 |
| 6.2.2 农杆菌感受态的转化 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 Lm4CL-1301过表达载体的构建 |
| 6.3.2 LmCCoAOMT-1301过表达载体的构建 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附录B 参与项目课题 |
| 附录C 基因登录号 |
| 致谢 |
（3）五个疫霉菌α1性激素诱导差异表达基因的cDNA克隆与CRISPR-cas9编辑载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 疫霉菌概述 |
| 1.1.1 疫霉菌的主要菌种 |
| 1.1.2 疫霉菌的生长发育 |
| 1.1.2.1 致病疫霉的无性生殖 |
| 1.1.2.2 致病疫霉的有性生殖 |
| 1.2 基因功能的研究方法 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9技术 |
| 1.2.2 其他基因功能研究方法 |
| 1.2.2.1 实时定量PCR技术 |
| 1.2.2.2 亚细胞定位技术及荧光标签 |
| 1.2.3 致病疫霉转化方法 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 1.4 实验流程图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验载体 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验药品与试剂盒 |
| 2.1.5 实验溶液 |
| 2.1.5.1 母液 |
| 2.1.5.2 溶液 |
| 2.1.5.3 抗生素溶液 |
| 2.1.6 实验培养基 |
| 2.1.7 实验所用引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 致病疫霉目的基因cDNA克隆 |
| 2.2.1.1 致病疫霉菌丝体收集 |
| 2.2.1.2 总RNA的提取 |
| 2.2.1.3 反转录 |
| 2.2.1.4 致病疫霉目的基因cDNA编码区的PCR扩增 |
| 2.2.1.5 扩增片段的纯化 |
| 2.2.1.6 目的片段与pEASY-T1的连接 |
| 2.2.1.7 制备DH5α感受态细胞 |
| 2.2.1.8 重组质粒的转化 |
| 2.2.1.9 阳性克隆鉴定 |
| 2.2.1.10 重组质粒的提取 |
| 2.2.1.11 质粒PCR鉴定 |
| 2.2.1.12 测序及序列分析 |
| 2.2.2 致病疫霉目的基因CRISPR基因编辑载体的构建 |
| 2.2.2.1 sgRNA设计 |
| 2.2.2.2 CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建 |
| 2.2.2.3 退火合成sgRNA片段 |
| 2.2.2.4 酶切携带sgRNA表达盒的质粒pYF515 |
| 2.2.2.5 sgRNA片段与质粒载体连接 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 |
| 2.2.2.7 菌落PCR验证sgRNA的插入 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 致病疫霉总RNA提取及反转录 |
| 3.2 PITG-03644 cDNA克隆、序列分析及基因编辑载体构建 |
| 3.2.1 PITG-03644 cDNA克隆 |
| 3.2.2 PITG-03644蛋白氨基酸生物信息学分析 |
| 3.2.3 PITG-03644 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 3.3 PITG-04663cDNA克隆、序列分析及基因编辑载体构建 |
| 3.3.1 PITG-04663cDNA克隆 |
| 3.3.2 PITG-04663蛋白氨基酸序列生物信息学分析 |
| 3.3.3 PITG-04663 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 3.4 PITG-06415 cDNA克隆、序列分析及基因编辑载体构建 |
| 3.4.1 PITG-06415 cDNA克隆 |
| 3.4.2 PITG-06415蛋白氨基酸序列生物信息学分析 |
| 3.4.3 PITG-06415 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 3.5 PITG-13014 cDNA克隆、序列分析及基因编辑载体构建 |
| 3.5.1 PITG-13014 cDNA克隆 |
| 3.5.2 PITG-13014蛋白氨基酸序列生物信息学分析 |
| 3.5.3 PITG-13014 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 3.6 PITG-17706 cDNA克隆、序列分析及基因编辑载体构建 |
| 3.6.1 PITG-17706 cDNA克隆 |
| 3.6.2 PITG-17706蛋白氨基酸序列生物信息学分析 |
| 3.6.3 PITG-17706 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 致病疫霉PITG-03644、PITG-04663、PITG-06415、PITG-13014、PITG-17706 cDNA克隆 |
| 4.1.2 致病疫霉A2交配型菌株P7723的PITG-03644、PITG-04663、PITG-06415、PITG-13014、PITG-17706基因sgRNA设计及CRISPR基因编辑载体的构建 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）梅花鹿S100A16基因cDNA克隆及功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 梅花鹿功能基因的研究概况 |
| 1.1.1 功能基因的早期研究概况 |
| 1.1.2 骨化相关基因的研究概况 |
| 1.1.3 肿瘤相关基因的研究概况 |
| 1.1.4 再生相关基因的研究概况 |
| 1.1.5 转录组的研究概况 |
| 1.2 S100A16基因的研究现状 |
| 1.2.1 S100基因家族概述 |
| 1.2.2 S100A16基因及其蛋白结构特性的研究 |
| 1.2.3 S100A16基因与肿瘤相关性的研究 |
| 1.2.4 S100A16基因与肥胖相关性的研究 |
| 1.3 目的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 RNA的提取、纯化及反转录 |
| 2.3 S100A16基因的T-A克隆 |
| 2.4 S100A16蛋白的生物信息分析 |
| 2.5 S100A16蛋白进化树的构建 |
| 2.6 S100A16基因的Q-PCR分析 |
| 2.7 pEGFP-C1-S100A16载体的构建 |
| 2.7.1 酶切位点的加入及T-A克隆 |
| 2.7.2 克隆载体的扩增及提取 |
| 2.7.3 真核载体的构建、提取及鉴定 |
| 2.8 细胞培养 |
| 2.8.1 细胞复苏 |
| 2.8.2 细胞换液 |
| 2.8.3 细胞传代 |
| 2.9 真核载体转染293T细胞 |
| 2.10 转染方法的优化 |
| 2.11 细胞RNA的提取及反转录 |
| 2.12 293T细胞中基因表达水平研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 S100A16基因的T-A克隆 |
| 3.2 S100A16蛋白的生物信息分析 |
| 3.2.1 蛋白的基本理化性质 |
| 3.2.2 蛋白的磷酸化位点及跨膜结构 |
| 3.2.3 蛋白的信号肽区域及亚细胞定位 |
| 3.2.4 蛋白的功能结构域 |
| 3.2.5 蛋白的二级结构 |
| 3.2.6 蛋白的三级结构 |
| 3.3 S100A16蛋白进化树的构建结果 |
| 3.4 S100A16基因的Q-PCR分析结果 |
| 3.5 真核载体构建结果 |
| 3.6 荧光观察结果 |
| 3.7 293T细胞中基因表达水平研究的结果 |
| 3.7.1 S100A16基因表达水平研究的结果 |
| 3.7.2 互作基因表达水平研究的结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 S100A16基因克隆及生物信息分析 |
| 4.2 S100A16蛋白氨基酸序列同源性分析 |
| 4.3 S100A16基因的Q-PCR结果分析 |
| 4.4 真核载体构建结果分析 |
| 4.5 真核载体转染结果分析 |
| 4.6 293T细胞中基因表达差异的分析 |
| 4.6.1 NOTCH1、ZEB1和ZEB2基因表达差异的分析 |
| 4.6.2 NANOG和TP53基因表达差异的分析 |
| 4.6.3 CDKN1A和PSMD9基因表达差异的分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）梭鱼脂代谢相关基因的克隆及饲料营养水平对其脂肪蓄积和代谢的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类脂肪过量蓄积的诱因 |
| 1.1 饲料营养素 |
| 1.2 抗脂肪肝物质 |
| 1.3 其他 |
| 2 脂肪蓄积和脂质代谢关键因子 |
| 2.1 过氧化物酶体增殖物激活受体α |
| 2.2 过氧化物酶体增殖物激活受体γ |
| 2.3 脂蛋白脂肪酶 |
| 2.4 脂肪酸合成酶 |
| 3 鱼类脂肪的蓄积和调控 |
| 3.1 脂肪的合成 |
| 3.2 脂肪分解和转运 |
| 3.3 鱼类脂肪蓄积和代谢的调控 |
| 4 本文研究目的和意义 |
| 第二章 饲料脂肪水平对梭鱼生长、血液生化和肝脏抗氧化性能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验鱼 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验主要仪器和试剂 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定方法 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饲料脂肪水平对梭鱼生产性能的影响 |
| 2.2 饲料脂肪水平对梭鱼血浆生化指标的影响 |
| 2.3 饲料脂肪水平对梭鱼肝脏抗氧化指标的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 饲料脂肪水平对梭鱼形体指标、体脂蓄积和脂肪酸组成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验鱼 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验主要仪器和试剂 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定指标 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饲料脂肪水平对梭鱼形体指标的影响 |
| 2.2 饲料脂肪水平对梭鱼组织脂肪蓄积量的影响 |
| 2.3 饲料脂肪水平对梭鱼组织脂肪酸组成的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 梭鱼部分脂代谢相关基因的克隆和表达分析 |
| 第一节 PPARα基因全长cDNA克隆及组织表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验用鱼 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 序列分析 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 梭鱼PPARα基因全长cDNA克隆与序列分析 |
| 2.2 梭鱼PPARα基因mRNA组织表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 第二节 PPARγ基因全长cDNA克隆及组织表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验用鱼 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 序列分析 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梭鱼PPARγ基因全长cDNA克隆与序列分析 |
| 2.2 梭鱼PPARγ基因mRNA组织表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 第三节 LPL基因全长cDNA克隆及组织表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验用鱼 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 序列分析 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梭鱼LPL基因全长cDNA克隆与序列分析 |
| 2.2 梭鱼LPL基因mRNA组织表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 第四节 FAS基因部分cDNA克隆及组织表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验用鱼 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 序列分析 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 梭鱼FAS基因的克隆与序列分析 |
| 2.2 梭鱼FAS基因mRNA组织表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 第五章 饲料脂肪水平对梭鱼脂代谢相关基因表达和酶活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验鱼 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饲料脂肪水平对梭鱼PPARα基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.2 饲料脂肪水平对梭鱼PPARγ基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.3 饲料脂肪水平对梭鱼LPL基因mRNA表达水平和酶活性的影响 |
| 2.4 饲料脂肪水平对梭鱼FAS基因mRNA表达水平和酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 饲料蛋白水平对梭鱼体脂蓄积、肝脏抗氧化性能、脂代谢基因表达和酶活的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验鱼 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验主要仪器和试剂 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定方法 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饲料蛋白水平对梭鱼组织脂肪蓄积的影响 |
| 2.2 饲料蛋白水平对梭鱼肝脏抗氧化指标的影响 |
| 2.3 饲料蛋白水平对梭鱼组织基因表达和酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点及有待进一步研究的问题 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文情况 |
（6）海蜇转录组文库分析及Wnt3、Frizzled5/8和β-catenin基因的克隆和表达（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海蜇的研究现状 |
| 1.2 Wnt信号转导通路及功能 |
| 1.2.1 Wnt蛋白家族 |
| 1.2.2 Wnt信号通路组成 |
| 1.2.3 经典Wnt信号通路 |
| 1.2.4 非经典Wnt信号转导途径 |
| 1.2.5 Wnt信号通路与生物发育 |
| 1.3 Frizzled基因分子生物学特征及功能 |
| 1.3.1 Frizzled基因分子生物学特征 |
| 1.3.2 Frizzled基因的生物学功能 |
| 1.4 β-catenin基因分子生物学特征及功能 |
| 1.4.1 β-catenin基因分子生物学特征 |
| 1.4.2 β-catenin基因的生物学功能 |
| 1.5 本文研究目的与意义 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 第二章 海蜇转录组文库的构建及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 海蜇总RNA的提取及质量鉴定 |
| 2.2.2 海蜇转录组数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 海蜇总RNA的质量 |
| 2.3.2 海蜇转录组文库测序结果分析 |
| 2.3.3 海蜇EST数据的GO分类 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 海蜇总RNA提取 |
| 2.4.2 454测序技术优势 |
| 2.4.3 刺胞动物门其他动物的转录组 |
| 2.4.4 海蜇转录组的Wnt信号通路基因 |
| 第三章 海蜇Wnt3基因: cDNA克隆、基因组结构与表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 组织样品 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂和工具酶 |
| 3.1.4 引物合成 |
| 3.1.5 质粒与菌种 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 海蜇Wnt3 cDNA的克隆 |
| 3.2.2 海蜇Wnt3基因组克隆 |
| 3.2.3 序列分析及进化树的构建 |
| 3.2.4 海蜇Wnt3基因的表达分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 海蜇Wnt3基因结构分析 |
| 3.3.2 海蜇Wnt3基因进化分析 |
| 3.3.3 海蜇Wnt3 mRNA表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 海蜇Frizzled 5/8基因: cDNA克隆与表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 组织样品 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂和工具酶 |
| 4.1.4 引物合成 |
| 4.1.5 质粒与菌种 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 海蜇Frizzled 5/8 cDNA的克隆 |
| 4.2.2 海蜇Frizzled 5/8基因组克隆 |
| 4.2.3 序列分析及进化树的构建 |
| 4.2.4 海蜇Frizzled 5/8基因的定量表达分析 |
| 4.2.5 海蜇Frizzled 5/8的原位表达分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 海蜇Frizzled 5/8基因结构分析 |
| 4.3.2 海蜇Frizzled 5/8的同源性以及进化分析 |
| 4.3.3 海蜇Frizzled 5/8 mRNA的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 海蜇β-catenin基因: cDNA克隆与表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 组织样品 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂和工具酶 |
| 5.1.4 引物合成 |
| 5.1.5 质粒与菌种 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 海蜇β-catenin cDNA的克隆 |
| 5.2.2 海蜇β-catenin基因序列分析及进化树的构建 |
| 5.2.3 海蜇β-catenin基因的表达分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 海蜇β-catenin基因结构分析 |
| 5.3.2 海蜇β-catenin的同源性以及进化分析 |
| 5.3.3 海蜇β-catenin基因的表达分析 |
| 5.4 讨论 |
| 主要创新点和展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪源性器官在再生医学的重要地位 |
| 1.2 猪源性器官研究的阶段性成果和面临的困境 |
| 1.3 PERV与人类健康 |
| 2 PERV概述和结构特征 |
| 3 PERV编码基因特征和蛋白质功能 |
| 4 PERV的生物学特性 |
| 5 PERV的感染性研究 |
| 6 PERV的防制策略 |
| 7 我国小型猪PERV的存在情况 |
| 7.1 小型猪试验的适用性和可行性 |
| 7.2 我国特有小型猪品种PERV感染情况调查 |
| 7.3 广西巴马小型猪PERV感染情况调查 |
| 8 广西巴马小型猪PERV进化基因组学研究 |
| 9 反向遗传学技术在PERV研究中的应用 |
| 10 本研究的目的和意义 |
| 10.1 研究目的 |
| 10.2 研究意义 |
| 第一章 广西巴马小型猪内源性逆转录病毒全序列测定与分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.1.1 样品采集 |
| 1.1.1.2 质粒和菌株 |
| 1.1.1.3 工具酶和试剂 |
| 1.1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.1.1.5 主要溶液配制 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.1.2.2 广西巴马小型猪外周血淋巴细胞(PBL)的分离 |
| 1.1.2.3 PBL总RNA的制备 |
| 1.1.2.4 cDNA第一链的合成 |
| 1.1.2.5 PCR扩增 |
| 1.1.2.6 目的片段的纯化和回收 |
| 1.1.2.7 PCR扩增产物的克隆与鉴定 |
| 1.1.2.7.1 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 |
| 1.1.2.7.2 目的片段的克隆与鉴定 |
| 1.1.2.7.3 大肠杆菌质粒DNA小量抽提纯化 |
| 1.1.2.7.4 克隆质粒的酶切鉴定、序列测定与拼接 |
| 1.1.2.8 全基因序列分析 |
| 1.1.2.9 非编码区结构与功能分析 |
| 1.1.2.10 env蛋白的结构与功能分析 |
| 1.1.2.11 进化年代分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 广西巴马小型猪PERV 4个基因片段的PCR扩增 |
| 1.2.2 广西巴马小型猪PERV 4个基因片段克隆与鉴定 |
| 1.2.3 序列的拼接 |
| 1.2.4 PERV-BM全基因序列分析 |
| 1.2.5 PERV-BM非编码区分析 |
| 1.2.5.1 PERV-BM 5'UTR的分析结果 |
| 1.2.5.2 PERV-BM 3'UTR的分析结果 |
| 1.2.6 PERV-BM env基因结构与功能分析结果 |
| 1.2.6.1 基于env基因的遗传进化分析 |
| 1.2.6.2 PERV-BM env蛋白一级结构分析 |
| 1.2.6.3 PERV-BM env蛋白跨膜结构分析 |
| 1.2.6.4 PERV-BM env蛋白抗原表位预测结果 |
| 1.2.6.4.1 PERV-BM env蛋白二级结构预测结果 |
| 1.2.6.4.2 PERV-BM env蛋白亲水性分析结果 |
| 1.2.6.4.3 PERV-BM env蛋白抗原指数预测结果 |
| 1.2.6.4.4 PERV-BM env蛋白表面可及性预测结果 |
| 1.2.6.5 PERV-BM env蛋白磷酸化位点预测结果 |
| 1.2.6.6 PERV-BM env蛋白糖基化位点预测 |
| 1.2.7 广西巴马小型猪PERV的进化年代分析 |
| 1.2.7.1 PERV分子钟行为分析 |
| 1.2.7.2 LTRs和env替换饱和度分析 |
| 1.2.7.3 分子钟行为分析 |
| 1.2.7.4 广西巴马小型猪PERV的进化年代分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 PCR反应条件与基因的扩增 |
| 1.3.2 PERV-BM基因组序列分析 |
| 1.3.3 PERV-BM非编码区结构与功能分析 |
| 1.3.3.1 5'UTR的结构与功能分析 |
| 1.3.3.2 3'UTR的结构与功能分析 |
| 1.3.4 PERV-BM env基因的分析 |
| 1.3.5 广西巴马小型猪PERV的进化年代分析 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 广西巴马小型猪PERV全基因cDNA克隆的构建与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 质粒 |
| 2.1.1.2 载体 |
| 2.1.1.3 细胞 |
| 2.1.1.4 工具酶和试剂 |
| 2.1.1.5 主要实验仪器 |
| 2.1.1.6 主要溶液配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 PERV-BM全基因组cDNA克隆的构建策略 |
| 2.1.2.2 PERV核酸扩增阳性对照的准备 |
| 2.1.2.3 cDNA克隆部分核苷酸的恢复突变与新酶切位点引入 |
| 2.1.2.4 PERV全基因组cDNA克隆的PCR鉴定 |
| 2.1.2.5 PERV全基因组cDNA克隆的酶切鉴定 |
| 2.1.2.6 PERV全基因组cDNA克隆突变株测序鉴定 |
| 2.1.3 广西巴马小型猪PERV感染性克隆的筛选 |
| 2.1.3.1 PERV全基因组cDNA克隆质粒的抽提 |
| 2.1.3.2 PERV全基因组cDNA克隆质粒的线性化 |
| 2.1.3.3 体外转录及RNA纯化 |
| 2.1.3.4 细胞转染 |
| 2.1.3.5 RT-PCR鉴定 |
| 2.1.3.6 酶切鉴定 |
| 2.1.3.7 透射电子显微镜观察病毒粒子 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PERV-BM全基因cDNA克隆的构建 |
| 2.2.2 PERV-BM全基因cDNA克隆的定点突变 |
| 2.2.3 PERV-BM全基因cDNA克隆的鉴定 |
| 2.2.3.1 PCR鉴定 |
| 2.2.3.2 酶切鉴定 |
| 2.2.3.3 测序鉴定 |
| 2.2.4 PERV-BM感染性克隆的初步鉴定结果 |
| 2.2.4.1 RT-PCR鉴定 |
| 2.2.4.2 酶切鉴定 |
| 2.2.4.3 透射电子显微镜观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 第一章 文献综述 |
| 1 谷胱甘肽S-转移酶的分类及一般特性 |
| 1.1 谷胱甘肽S-转移酶的分类 |
| 1.2 谷胱甘肽S-转移酶结构 |
| 1.3 谷胱甘肽S-转移酶的功能 |
| 2 谷胱甘肽S-转移酶的生化特性 |
| 2.1 谷胱甘肽S-转移酶的分离纯化 |
| 2.2 谷胱甘肽S-转移酶的分布特征 |
| 2.3 谷胱甘肽S-转移酶的诱导性 |
| 3 昆虫谷胱甘肽S-转移酶与抗药性的关系 |
| 3.1 谷胱甘肽S-转移酶与有机氯类杀虫剂抗性 |
| 3.2 谷胱甘肽S-转移酶与有机磷类杀虫剂抗性 |
| 3.3 谷胱甘肽S-转移酶与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性 |
| 3.4 昆虫谷胱甘肽S-转移酶比较基因组学 前言 第二章 桔小实蝇GSTs的纯化及生化毒理学特性解析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 第三章 基于转录组数据的桔小实蝇GSTs基因cDNA克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 第四章 桔小实蝇GSTs基因的表达模式 |
| 第一节 桔小实蝇GSTs基因在不同发育阶段的表达模式 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇GSTs基因在不同组织部位的表达模式 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇GSTs基因在药剂诱导后的表达模式 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 桔小实蝇GSTs基因在不同品系中的表达模式 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 第五章 桔小实蝇BdGSTe5基因的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 第六章 主要结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 参考文献 在读期间发表论文目录及参研课题情况 附录：桔小实蝇GSTs基因的全长cDNA序列及推导的氨基酸 致谢 |
（9）鹅脂肪性状相关基因的克隆表达及LEPR在脂肪细胞中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 动物脂肪性状相关基因的研究进展 |
| 1.1 Leptin Receptor(LEPR)基因 |
| 1.2 Adipose triglyceride lipase(ATGL)基因 |
| 1.3 Lipoprotein lipase(LPL)基因 |
| 1.4 Toll-like receptor4(TLR4)基因 |
| 1.5 Interleukin-6(IL-6)基因 |
| 第二节 动物脂肪细胞培养的研究进展 |
| 2.1 人和鼠的脂肪细胞培养 |
| 2.2 家养动物脂肪细胞培养 |
| 2.3 前体脂肪细胞培养 |
| 2.4 小结与展望 |
| 第三节 RNA干扰技术的研究与应用进展 |
| 3.1 RNA干扰技术原理 |
| 3.2 RNA干扰技术应用 |
| 3.3 前景与展望 |
| 第四节 本研究的目的与意义 |
| 4.1 本研究的目的与意义 |
| 4.2 主要研究内容 |
| 第二章 鹅LEPR,ATGL,LPL,TLR4,IL-6基因的CDNA克隆及序列分析 |
| 第一节 鹅LEPR基因全长CDNA克隆及序列分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 鹅ATGL基因全长CDS序列的克隆及分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三节 鹅LPL基因全长CDS序列的克隆与分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四节 鹅TLR4基因全长CDS序列的克隆与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五节 鹅IL-6基因全长CDS序列的克隆与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第三章 鹅LEPR,ATGL,LPL,TLR4,IL-6基因表达的组织特异性研究 |
| 第一节 鹅LEPR,ATGL,LPL,TLR4,IL-6基因表达的组织特异性研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 鹅LEPR,ATGL,LPL,TLR4,IL-6基因在填肥鹅和对照鹅间的表达差异研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 鹅LEPR对脂肪细胞分化和代谢相关功能基因的表达调控研究 |
| 第一节 鹅前体脂肪细胞的分离、培养及诱导 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 鹅LEPR特异性SIRNA(LEPR-SIRNA)的设计、筛选及干扰优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三节 LEPR对鹅脂肪细胞分化和代谢相关功能基因的表达调控研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第五章 鹅LEPR对脂肪细胞免疫相关基因TLR4和IL-6的表达调控研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 罗格列酮和GW-9662对鹅脂肪细胞中基因表达调控的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 小结,创新点与研究展望 |
| 7.1 小结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及其在学期间所取得的科研成果 |
（10）油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 绪言 |
| 1.1 蛋白磷酸酶的分类、结构和功能 |
| 1.1.1 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的分类 |
| 1.1.2 酪氨酸蛋白磷酸酶的分类 |
| 1.1.3 蛋白磷酸酶的结构 |
| 1.1.4 蛋白磷酸酶的生物学功能 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 1.4 本研究的主要内容和技术路线 |
| 2 油茶蛋白磷酸酶MPP基因全长CDNA克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组子PCR检测电泳结果 |
| 2.2.2 油茶MPP基因全长cDNA的获得 |
| 2.2.3 CoMPP1核酸序列分析 |
| 2.2.4 CoMPP1蛋白质序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 油茶蛋白磷酸酶PTP基因全长CDNA克隆 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和用品 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 PTP基因全长cDNA克隆与分析 |
| 3.2.1 油茶种子胚乳总RNA提取 |
| 3.2.2 电泳检测 |
| 3.2.3 mRNA反转录获得cDNA |
| 3.2.4 PTP基因的5'RACE PCR |
| 3.2.5 目的片段回收 |
| 3.2.6 感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 T载体重组子的制备 |
| 3.2.8 重组子转化 |
| 3.2.9 PCR鉴定重组子 |
| 3.2.10 PCR产物测序 |
| 3.3 PTP基因克隆结果电泳检测 |
| 3.3.1 油茶种子总RNA的提取质量 |
| 3.3.2 PTP基因5'RACE产物龟泳检测 |
| 3.4 油茶CoPTP1基因的生物信息学分析 |
| 3.4.1 CoPTP1核苷酸序列分析 |
| 3.4.2 CoPTP1蛋白质序列分析 |
| 3.5 讨论 |
| 4 油茶蛋白磷酸酶PP2C基因全长CDNA克隆 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和用品 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 PP2C基因全长cDNA克隆与分析 |
| 4.2.1 油茶胚乳总RNA提取、电泳检测、mRNA反转录 |
| 4.2.2 PP2C的文库片段菌液PCR |
| 4.2.3 CoPP2C1基因的5'RACE |
| 4.3 CoPP2C1基因克隆结果电泳检测 |
| 4.4 PP2C的生物信息学分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 核苷酸序列分析 |
| 4.5.2 氨基酸序列分析 |
| 5 结论与创新 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新 |
| 参考文献 |
| 附录A 实验药品 |
| 附录B 主要仪器设备 |
| 附录C 硕士研究生阶段发表的论文 |
| 致谢 |
| 课题来源 |
四、人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]梅花鹿PDGFA基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达[D]. 张强. 东北林业大学, 2020(02)
- [2]灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因的全长cDNA克隆及定量表达分析[D]. 黄益智. 中南林业科技大学, 2020(02)
- [3]五个疫霉菌α1性激素诱导差异表达基因的cDNA克隆与CRISPR-cas9编辑载体构建[D]. 康泽钜. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [4]梅花鹿S100A16基因cDNA克隆及功能初探[D]. 陈继乾. 东北林业大学, 2020(01)
- [5]梭鱼脂代谢相关基因的克隆及饲料营养水平对其脂肪蓄积和代谢的影响研究[D]. 杨文平. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]海蜇转录组文库分析及Wnt3、Frizzled5/8和β-catenin基因的克隆和表达[D]. 潘滢. 厦门大学, 2018(06)
- [7]广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建[D]. 钟雅婷. 广西大学, 2014(01)
- [8]桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究[D]. 胡飞. 西南大学, 2012(11)
- [9]鹅脂肪性状相关基因的克隆表达及LEPR在脂肪细胞中的功能研究[D]. 王芳. 浙江大学, 2011(07)
- [10]油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析[D]. 刘巧. 中南林业科技大学, 2010(03)