陈建昌[1]2003年在《骨髓基质细胞移植改善心肌梗死后心功能的研究》文中指出目的：以兔为研究对象，探讨(1)兔骨髓基质细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为肌源细胞及其鉴定；(2)诱导分化后的MSCs心肌植入能否改善兔心肌梗死(MI)后的心功能；(3)诱导分化后的MSCs移植和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)雷米普利在改善MI后的心功能方面是否具有协同作用。 方法： (1)从兔股骨头处抽取骨髓，用Ficoll细胞分离液分离MSCs，体外培养，在细胞培养液中加入终浓度为8umol／L的5-氮杂胞苷(5-aza)，孵育24h，使MSCs向肌源细胞定向分化，继续培养4周后，作免疫组织化学、逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)和电镜检查，确定是否有向肌源细胞分化的性质。 (2)用免疫组织化学方法检测肌源细胞中肌节肌动蛋白(Actin)、肌钙蛋白I(Troponin I)、结蛋白(Desmin)和缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达；用RT-PCR检测肌球蛋白重链(MHC)的基因表达；用电镜观察肌源细胞的超微结构。 (3)在诱导分化后的MSCs移植对MI后心功能影响的研究中，结扎兔冠状动脉前降支致MI，MI后2周的兔随机分为叁组：诱导分化后MSCs移植组(5-aza-MSCs组)；培养MSCs移植组(MSCs组)；培养基注射组(培养基组)。另设单纯开胸组(安慰组)。5-aza-MSCs组和MSCs组在MI后2周，再次开胸，经二脒基苯吲哚(DAPI)标记的6×10~7诱导后或未诱导MSCs悬浮于200ul无血清RPMI 1640培养液中，经微量注射器注射于缺血区的心外膜下。培养基组注射无血清RPMI 1640 200ul，安慰组仅做开胸手术。 细胞移植后6周心脏超声多普勒检测心功能，包括左室射血分数(LVEF)、左室舒张和收缩末期内径(LVDd、LVDs)、左房内径(LAD)、骨髓基质细胞移植改善心肌梗死后心功能的研究中文提要舒张早期和晚期左心室充盈速度最大值E峰和A峰(E、A)以及多普勒组织成像(DTI)检测前壁、间隔和侧壁的收缩速度(Sa)。有创直接测量血压、左室收缩压和左室舒张末期压(LVEDP)。 实验结束，处死动物，取注射区的心肌组织行冰冻切片和I王E染色。 (4)在诱导分化的MSCS移植和ACEI对MI后心功能影响的对照研究中，经结扎前降支致Ml的兔分为四组，二组不予ACEI雷米普利，梗死后2周心肌内注射培养基或诱导分化后的MSCS，即培养基组和5一aza一MSCs组;另二组梗死后即予雷米普利lmg瓜g/d，持续8周，并在梗死后第2周心肌内分别注射培养基或诱导分化后的MSCS，即ACEI组和ACEI十5一aza一MSCS组。移植后6周分别检测心功能和血液动力学参数。 结果: (l)兔MSCS定向诱导分化的诱导剂5一aza的合适浓度为sumol几，经5一axa诱导后，细胞体积变大，有多核肌管形成，诱导后的MSCs中Aetin、肠oponinl、Desmin、eonnexin 43免疫组织化学染色呈阳性，RJ，一PCR检测有MHC基因的表达，透射电镜下可见明显的肌丝形成、糖原颗粒丰富、核居中。 (2)荧光标记物DAPI对活细胞无毒性，标记成功率100%。 (3)5一aza一MSCS组、MSCS组、培养基组的LVEF分别为38.1士4.8、25.8士4.1、22.7士5.5%;5一aza一MSCS组与MSCS组和培养基组相比显着增加，P<0.01。MSCS组虽比培养基组的LVEF有增加，但二者间无显着性差异。 (4)二尖瓣血流E/A、左室前壁和间隔收缩速度，5一aza一MSCs组与培养基组及MSCS组相比均有显着增加，P<0.05。 (5)血液动力学检测显示:5一aza一MSCS组与培养基组及MSCs组相比，LVEDP有显着的下降。 (6)病理组织学显示:移植细胞能在梗死心肌组织中生长和增)骨髓基质细胞移植改善心肌梗死后心功能的研究中文提要殖。 (7)ACEI+5一aza一MSCS组、ACEI组和5一aza一MSCS组与培养基组相比，LVEF均显着的增加，ACEI+5一aza一MSCS组与ACEI组和5一aza一MSCs组相比，LVEF增加更显着，后两者间无显着差异。ACEI+5一aza一MSCs组和5一aza一MSCs组前壁和间隔收缩速度加快，而ACEI组无显着变化。 (8)ACEI+5一aza一MSCS组、ACEI组和5一aza一MSCS组，叁组LVEDP均有显着下降。 结论: (一)MSCS在体外经5一aza(8 umol几)诱导后，能定向分化为肌源细胞。 (二)移植诱导分化后的MSCS能改善梗死区心肌的收缩速度，同时能改善兔Ml后的整体心脏的收缩和舒张功能。 (叁)诱导分化后的MSCS移植联合应用ACEI雷米普利对改善兔呱后的心功能具有协同作用。 (四)本文的研究是初步的，远未证明移植到梗死区的诱导分化MSCS是否参与了心肌的收缩和舒张、它的兴奋一收缩偶联是如何传布的。因此，诱导分化的MSCS如何改善心脏功能，还有待研究。
唐滔[2]2003年在《骨髓基质细胞心肌移植的初步研究》文中研究表明背景：心室重构是心梗后进行性心衰和死亡的重要原因。尽管心梗后作为对心肌缺血的适应性反应和心室重构过程之一，机体通过毛细血管增殖来促进冠状动脉侧枝循环的建立，然而在大多数情况下，此代偿过程是不完全的。促进冠状动脉侧枝循环的形成和开放，可改善心肌缺血，减轻心室重构。骨髓基质细胞是多能干细胞，具有潜在诱导缺血区组织血管再生的功能。由此我们将骨髓基质细胞移植入大鼠心梗区中，探讨其对大鼠心梗后血管新生和细胞因子VEGF、TGF的作用。 方法：采用近交系大鼠模拟自体移植。取大鼠骨髓基质细胞进行体外培养、增殖和标记，同时以液氮冷冻左室游离壁建立心梗模型。4周后分别将2×10~6个细胞悬液或冷D-Hanks液注入心梗区数个不同部位。于移植后1周、2周和4周依次获取心梗区标本，进行细胞形态学观察，毛细血管密度测定和RT-PCR检测细胞因子VEGF、TGF-βmRNA的表达。 结果：共建立近交系大鼠心梗模型30只。采用贴壁分离法获取骨髓基质细胞，成功体外培养、传代、扩增至2-5×10~6个／瓶。BrdU标记细胞，体外证实标记效率为80％。免疫组化检查发现骨髓基质细胞于移植后1周、2周和4周后均可存活并具有分化成熟倾向。Ⅷ因子多克隆抗体毛细血管染色显示移植后第1、2及4周心梗区单位面积(0.1mm~2)毛细血管数实验组(67.600±7.162、43.200±1.087、32.800±2.168)较对照组(22.800±1.924、20.800±2.280、18.800±2.108)均明显增加(P＜0.01)，但毛细血管数有随时间推移而逐步减少的趋势(P＜0.01)。RT-PCR检测发现VEGFmRNA术后第1、2及4周的表达水平实验组(3.426±0.043、1.536±0.024、0.729±0.010)与对照组(2.689±0.045、1.245±0.016、0.463±0.007)相比均增加(P＜0.01)，且随着时间的推移其表达量两组均呈迅速降低的趋势(P＜0.01)。TGF-βmRNA在术后第1、2及4周的表达水平实验组(0.445±0.014、1.034±0.015、0.393±0.018)与对照组(2.000±0.023、1.502±0.035、1.351±0.173)博士学位论文 摘要相L均降低（P＜0刀1）。 结论： l、骨髓基质细胞易于培养和增殖。 2、骨髓基质细胞心梗区移植后可较长期存活并有分化成熟倾向。 3、骨髓基质细胞心肌移植可促进心梗区血管新生。 4、骨髓基质细胞心梗区移植后可促进VEGF生成，抑制TGF．p合成。从而有利于血管新生和减轻。O室重构。
胡成俊, 卓儒红, 郑勇, 吴艳[3]2009年在《转染胰岛素样生长因子-1的骨髓基质细胞对心肌梗死后心功能的影响》文中研究指明目的:移植转染胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的骨髓基质细胞(MSC)到心肌梗死大鼠模型中,观察心肌细胞的凋亡和心功能的变化。方法:采用结扎法制作心肌梗死大鼠模型,用含pBabe-puro/IGF-1的病毒液感染MSC,移植MSC进入梗死心肌边缘。将实验分为心肌梗死组(MI)、心梗单纯移植细胞组(MI+MSC)、心梗移植感染空质粒细胞组(MI+MSC-pBabe-puro)、心梗移植感染IGF-1质粒的细胞组(MI+MSC-pBabe-puro/hIGF-1)。免疫组化检测炎性反应的时间,决定细胞移植的时间点。术后4周,通过TUNEL法检测心肌的细胞凋亡,超声心动图检测心功能的变化。结果:免疫组化结果显示梗死后第7天的ED1细胞的阳性数比第2天明显降低(P<0.05);转染IGF-1的MSC移植到心梗的心肌中,和转染空质粒的MSC以及未作转染的MSC组比较,明显减少心肌的细胞凋亡(P<0.05);且射血分数、左室壁厚度、左室短轴缩短率明显提高(P<0.05)。结论:转染IGF-1的MSC移植到心梗大鼠心肌内,可能是通过减少心肌的细胞凋亡来改善心功能。
徐红新[4]2004年在《骨髓单个核细胞移植对心肌梗死后心功能影响的实验研究》文中提出急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是影响人类健康的最主要疾病之一。一旦发生，将产生严重后果：缺血区心肌发生不可逆性坏死，导致具有收缩功能的心肌细胞数目减少；残余心肌细胞代偿性肥大、凋亡；成纤维细胞分泌大量的胶原组织在局部沉积，形成瘢痕组织替代坏死心肌，从而导致梗死心肌结构的重建，心肌弹性下降，心室壁扩张变薄，心功能降低，最终死亡或极大的影响患者的生活质量。 几十年来，为了治疗心肌梗死(myocardial infarction,MI)和由之引起的心力衰竭，人们想了很多办法，包括药物治疗、介入治疗、外科手术搭桥、心脏移植、机械辅助甚至全人工心脏等。然而，对于大面积、弥漫性的冠心病患者来说，以上方法很难遏制、逆转病情的发展，患者的获益是有限的。因此，作为一种很有希望的MI和／或心力衰竭的治疗手段，细胞移植在过去的10年中逐渐引起了人们的注意。目前已经有很多细胞被研究用来作为缺血心肌内细胞移植的供体，包括心肌细胞、平滑肌细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)、骨骼肌成肌细胞、肝脏干细胞等。其中BMSCs是目前最有前景的一类心肌内细胞移植供体。首先，BMSCs具有极强的分化潜能，能够分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞；其次，BMSCs分化的心肌细胞能与受体心肌细胞形成有效的电-机械耦联，从而达到同步收缩，改善心功能的目的，这是骨骼肌成肌细胞移植所不具备的；第叁，BMSCs可以分泌促细胞和血管生长因子；第四，BMSCs容易从自体采集，移植前可在体外培养增殖，或通过细胞因子动员BMSCs移行至外周血，直接参与心肌损伤的修复。避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理学纠纷；第五，自体BMSCs移植不存在免疫排斥反应。因此，不论基础研究，还是临床应用，多数研究者们青睐于BMSCs。 BMSCs的分化特性是人们最感兴趣的地方。1995年，Wakitani等人首先发现，经5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)和两性霉素或单独两性霉素处理后，骨髓基质细胞(BMSCs组成之一)在体外可以分化为肌细胞。不久前Makino等人在体外利用3μmol／L的5-aza诱导骨髓基质细胞，发现部分克隆可以分化为具有自主收缩功能的心肌样细胞。其诱导BMSCs分化为心肌样细胞的确切机制尚不清楚。Konieczny等在研究小鼠胚胎细胞系向肌源性分化的过程中指出，这些细胞包含有一个甲基化状态的肌原决定区基因座，因此处于转录失活状态。而5一aza可使其去甲基化，激活转录，从而促使其向肌性细胞分化。 此外，治疗性血管新生也在改善缺血性心脏病患者心功能及生活质量方面表现出了满意的效果。目前人们已经将多种血管生长因子用于临床I期实验，初步结果表明，促血管生长作用满意。其中血管内皮生长因子(vascular endothehalgrowth factor，VEGF)是一种强大的促血管生长因子，在缺血心肌内具有良好的促血管生长作用。 由此可见，通过5一aza诱导的细胞移植修复缺血坏死心肌组织，或通过血管生长因子的持续、稳定、有效表达促进缺血心肌局部血管新生，将是很有希望的两种治疗手段。因此，为寻找一种更加有效的治疗缺血性心脏病的新疗法，我们假想l)富含骨髓各种干细胞的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuelear eells，BM一MNCs)经5一aza诱导后，被赋予了更多的收缩蛋白和结构蛋白，将其移植于缺血心肌后，也许能进一步改善心功能;2)表达VEGF基因的BM一MNCs移植于缺血心肌后，除了能通过移植细胞修复受损心肌以外，还能通过血管新生改善局部血供、挽救自体受损心肌，并为移植细胞提供一个良好的生存环境，有可能在更大程度上改善心功能，从而达到协同治疗效果。本研究的主要内容包括叁个部分。 1 .BM一MNCs的体外分离培养和向心肌样细胞的诱导分化。利用Ficon密度梯度离心法体外分离BM~MNCs，培养于含有20%胎牛血清的DME树F12培养基内，观察其细胞组成、形态学变化、及生长增殖情况。应用5一aza诱导BM一MNCs中的基质细胞等向心肌样细胞分化，并从形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学两方面予以证实。 2.5一aza诱导的BM一MNCs移植于缺血心肌的实验研究。选取日本大耳白兔犯只，体重2.0一2.SKg。通过胸骨左缘开胸，结扎左冠状动脉前降支，建立AMI模型。随机分为如下4组:组I(BM一MNCs+5一aza组):注射5一aza诱导的BM一MNCs100林l，n二8;组11(BM一MNCs组):注射未经5一aza诱导的BM一MNes 100卜l，n=8;组111(AMI对照组):注射无血清DMEM/F，2培养基10郎l，n二10:组W(假手术组):只开胸，不结扎，不注射。细胞移植前均经5一澳脱氧尿普(BrdU)标记。所有动物于细胞移植后4周采用超声心动图评价心功能。实验结束时，行左心导管通过血流动力学情况评价心功能。然后取组织，采用、乞n Gieson染色和免疫荧光技术检测，主要观察组织重构和细胞存活分化、血管新生等情况。 3.转染恤VEGF，65的BM一MNCs移植于缺血心肌的实验研究。phvEGF，65是含hVEGF165eDNA的peR3表达载体。移植前经脂质体包裹phvEoF165转移至培养的BM一MNCs，孵育24h。并通过免疫荧光技术检测hVEGF165在细胞内的表达情况。然后进行细
牛丽丽[5]2003年在《骨髓间充质干细胞移植和基因转染治疗心肌梗死的实验研究》文中提出研究背景： 急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床缺乏针对病变冠脉、梗死心肌的再造和再生的根本性治疗方法，虽然发病4-6小时内及时溶栓、介入治疗使梗塞相关血管早期持续开通可挽救濒临死亡的心肌细胞，但绝大多数患者就诊时缺血心肌已有坏死，此时再灌注治疗只能防止梗死范围的扩大，而对于已坏死的心肌无效。由于成人心肌组织无分化再生能力，其坏死心肌细胞只能由成纤维细胞取代而形成无收缩功能的瘢痕组织，终致心衰，甚至猝死，严重影响患者生活质量和寿命。细胞移植修复坏死心肌展示出良好的前景。目前研究多集中在胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓干细胞移植等等，但由于供体胎儿心肌获取困难，且同胚胎干细胞一样存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，难以用于临床；骨骼肌细胞同心肌细胞均是横纹肌细胞，通过骨骼肌干细胞移植的方法修复损伤坏死心肌取得了一些进展，但是骨骼肌干细胞数量极少，约占骨骼肌细胞总数的4％-8％，而且与年龄的增长呈负相关，同时，骨骼肌干细胞定位比较分散，不容易分离获得，要想达到移植所需要的细胞数量非常困难。最近研究表明，骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能，在适宜的刺激条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞及成心肌细胞等，此外，MSCs容易获得，易分离培养，体外扩增能力强，并且不表达共刺激抗原B7等。这些特性使得MSCs倍受心血管医学界的关注，有望成为心肌梗死后心肌再生的理想治疗手段。 研究目的： ①优化MSCs的分离、纯化、扩增的方法；②观察成人MSCs在体外能否分化为成心肌细胞；③观察大鼠MSCs在正常模型和梗死模型心脏组织中的迁移分化状况；④了解MSCs进行同种异体移植对大鼠心肌梗死的治疗作第叁军医大学博士学位论文用;⑤观察成人MSCs进行异种异体移植对大鼠心肌梗死的治疗效果;⑥探讨成人MSCs分化的成肌细胞移植联合转染VEGF基因对大鼠心肌梗死的治疗意义。期望最终能为心肌梗死治疗提供新的思路、新的途径和新的措施，为干细胞的临床应用奠定基础。方法与结果: 第一部分:探讨了人MSCS的体外分离、纯化、扩增和向心肌细胞的定向诱导分化条件。首先采用密度为1.0739/mL的Percon分离液分离成人骨髓中的单个核细胞，进而获得MSCs，用DMEM一F12+l0%胎牛血清作为基本培养基，通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养，平均每2一3天在细胞达70~80%融合时，传代一次。5.0x 105个原代细胞体外扩增12代后可获得2.3 x 109个细胞，扩增约4.6x 103倍，细胞形态仍保持均一的长梭形。流式细胞仪检测扩增后MSCs表面抗原特性，结果表明MSCs强表达干细胞标记CD29，而不表达造血干细胞特异抗原CD34和淋巴细胞表面抗原CDlla，属非造血干细胞的另一群干细胞。第2、6、11代hMSCs经诱导后7天，相差显微镜下见细胞呈长梭形、多核，10天可见肌管样结构;免疫组化检测发现:第2、6、11代hMSCs诱导后均表达肌钙蛋白I(Tnl)和结蛋白(desmin);RT一PCR显示:诱导后细胞心肌特异因子基因p一肌浆蛋白重链(p一MHC)为阳性表达，其中第6代MSCs的p一MHC表达较第2、11代高。原代培养72h细胞(细胞数量少，密度低)，经诱导后无阳性结果。 结果提示:①及时传代可避免MSCs自身分化，也是纯化MSCs的重要因素之一;②人源MSCs在bFGF辅助下、经5一aza诱导可定向分化为成心肌细胞;③MSCs的数量，及其高纯度、高扩增能力是定向诱导分化为心肌细胞的基本条件。 结论:成功优化人MSCs培养、纯化及扩增条件，证明hMSCs能分化为成心肌细胞。 第二部分:采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗塞模型，体外分离Wistar大鼠骨髓MSCs，扩增及纯化后进行同种异体移植。35只大鼠随机分为四组:①正常心脏+r MSCs移植组(n=10):正常大鼠接受同种异体rMsCs移植治疗(5 x 106 MsCs八00 ul，分4点注入);②急性心肌梗死对照组(n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基;③心肌梗死+r MSCs移植组(n== 10):大鼠心肌梗死后l一3h接受同种异体:Mses移植治疗(5 x xo6 Mses/1 OOul，分4点注入)。④单个核细胞治疗组(n=5):大鼠心肌梗死后1一3h第叁军医大学博士学位论文接受同种异体单个核细胞移植治疗(sxl06MSCs八OOul，分4点注入)。干细胞移植后10周经荧光显微镜观察移植细胞的存活、迁移分布，免疫组化鉴定移植细胞的心肌分化，HE染色观察血管新生。结果:口移植细胞在心肌缺血、梗塞区分布广泛，其细胞核呈椭圆形类似心肌细胞核，并与宿主心肌纤维排列方向一致;口免疫组化鉴定，供体细胞胞浆心肌特异蛋白染色阳性;口HE染色观察，梗死边缘区心肌面毛细血管数目明显增加(5.37土o.svs1·24士0.3，p<O，01);口在正常心脏微环境中，供体MSCs呈小岛屿状分布，没有迁移现象，与宿主心肌纤维排列方向无关，免座且化检测胞浆心肌特异蛋白染色阴性;⑤移植DAPI标记的同种异体单核细胞，10w后在梗死大鼠心脏未见存活供体细胞。 结果提示:①及时传代可避免
王祺[6]2011年在《独参汤联合骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死大鼠的相关研究》文中指出第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定背景:干细胞是一门新兴的技术,其在体外具有自我更新及多向分化的潜能,采用细胞移植的方法干细胞可以用于治疗多种难治性疾病。骨髓间充质干细胞是目前研究最多的干细胞,但它在骨髓中的含量极低,约每100,000个单核细胞中仅含有2-5个,这使科学研究受到极大限制,要想为实验研究提供所需数量及纯度的骨髓间充质干细胞,就需要对其进行有效的体外扩增。因此,使用有效的分离、纯化、培养的方法尤显重要。目的:目前对骨髓间充质干细胞分离、纯化、扩增比较常用的方法有以下几种:贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分离法、特制培养板筛选法和渗透压筛选法,且各有其优缺点。依据各方法之特点,结合研究需要,通过实验探索并验证行之有效的体外细胞分离、纯化、培养的方法。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。1.每次取Wistar雄性大鼠1只,断颈处死,浸于体积分数为75%乙醇中10分钟,无菌条件下取出大鼠的股骨及胫骨,剔除骨表面附着组织,用无菌PBS将表面冲洗干净。除去骨的两端,使骨髓腔暴露,再将骨关节面祛除后用注射器(60mL)抽取无菌的PBS将骨髓腔多次反复冲洗干净。2.将收集到的骨髓液加入预先加入50mL DMEM培养基的无菌离心管中,用注射器反复抽吸,将组织打散成为细胞悬液。在淋巴细胞分离液(1.077 Ficoll)上轻轻迭加刚得到的细胞悬液,离心20分钟(转速:2000r/min),将单个细胞层吸取出来。用DMEM培养基将细胞漂洗两次,离心5分钟(转速:1000r/min),弃去上清,留取细胞沉淀。然后向细胞沉淀中加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞密度调整约为1×10~6/mL,接种于25cm~2细胞培养瓶中,在恒温细胞培养箱(温度37℃,饱和湿度CO_2体积分数为5%)中培养48小时后,更换培养基,除掉未贴壁细胞,之后每隔3天照此法换液1次。3.在80%左右的原代细胞融合时予以传代,弃掉旧的培养基,用无菌的PBS漂洗3次后加入0.25%胰酶,室温下进行消化约5分钟,待细胞形态变圆时将其加到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中终止消化。用吸管轻轻吹打,再将消化液转入到15mL的无菌离心管中,离心10分钟(转速:1000r/min)。除去上清取出细胞沉淀,将其加入到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中,按照1:2的比例进行传代。鉴定:用流式细胞学对传代后骨髓间充质干细胞表面标志CD44、CD90、CD34、CD45进行检测。结果:1.骨髓间充质干细胞形态观察:新分离接种的细胞镜下观察呈圆形,数量较多,大小不一; 48小时后见多数细胞贴壁生长,呈圆形或椭圆形,体积增大,大多数细胞为单核细胞,此后梭形细胞逐渐出现;7天后细胞多呈梭形,可见明显集落形成,并随集落的不断扩大,融合呈漩涡状或放射状;原代细胞10天左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。2.间充质干细胞流式检测: CD44阳性细胞占92.4%,CD90阳性细胞占88.9%,CD34阴性细胞占96.6%,CD45阴性细胞占95.6%。结论:运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。第二部分:独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠心功能的影响背景:急性心肌梗死后心功能的改善程度直接关系到其预后,如何更好的改善心梗后心功能是目前热点话题。有研究发现,中药与骨髓间充质干细胞移植相结合可以起到协同增效、优势互补的作用,但选用何种中药对骨髓间充质干细胞进行干预能够对心功能起到更好的改善作用尚在探索之中。目的:观察独参汤联合骨髓间充质干细胞对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响。方法:选择雌性清洁级Wistar大鼠40只,采用Olivette方法结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。将造模后的大鼠随机分为4组:①急性心肌梗死对照组( n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基;②干细胞组(n=10):急性心肌梗死大鼠接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×10~6 BMSCs /100μL,分4点注入);③独参汤组(n=10):大鼠急性心肌梗死后2小时开始灌服独参汤,每日二次,共用一周;④干细胞组+独参汤组(n=10):大鼠急性心肌梗死后接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×10~6 BMSCs /100μL,分4点注入),2小时后开始灌服独参汤,每日二次,共用一周。分别于造模前及骨髓间充质干细胞移植后4周,对各组大鼠行心脏超声检查(左心室射血分数、每分钟心排出量);于心脏超声检查后对各组大鼠心肌组织行HE染色。结果:1.超声心动图检查结果(1)左心室射血分数检测结果显示:①对照组、独参汤组、干细胞组、独参汤+干细胞组4组与术前比较均有明显降低(P<0.05);②干细胞组、独参汤组和干细胞+独参汤组3组与对照组比较均有升高;其中干细胞+独参汤组升高最为明显;③干细胞组与对照组比较有明显差异(P<0.05 );④干细胞+独参汤组与对照组比较有显着差异(P<0.01);与干细胞组比较有明显差异(P<0.05);与独参汤组比较有显着差异(P<0.01)。(2)每分钟心脏排出量检测结果显示:①对照组、独参汤组、干细胞组、独参汤+干细胞组4组与术前比较均明显降低;②干细胞组、独参汤组和干细胞+独参汤组3组与对照组比较均有升高;其中干细胞+独参汤组升高最为明显;③干细胞+独参汤组与独参汤组比较有显着性差异(P<0.01 );④干细胞组和干细胞+独参汤组与对照组比较均具有显着性差异(P<0.01 ),且干细胞+独参汤组优于干细胞组。2.心肌组织病理学结果(1)对照组大鼠心脏标本HE染色可见广泛心肌纤维化,心肌组织排列紊乱,伴有邻近心肌纤维萎缩(或)肥大,心肌组织之间夹杂有大量疤痕组织,并可见轻度的淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,脂肪样改变;(2)骨髓间充质干细胞移植组心脏标本HE染色示心肌组织间也有结缔组织增生,但没有发现血管瘤,小血管数量较为丰富。结论:1.独参汤对骨髓间充质干细胞在改善大鼠心梗后心功能方面有明显的促进作用。2.独参汤与骨髓间充质干细胞在改善大鼠心梗后心功能方面具有良好的协同增效作用。第叁部分:独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响背景:前期实验提示独参汤联合骨髓间充质干细胞能够显着改善大鼠心肌梗死心功能,考虑心功能的改善可能与以下两方面因素有关:一是独参汤促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。二是通过改善血管内皮功能,促进微血管再生,改善梗死区及缺血区的血供使心功能得到改善。但仅以增加心肌细胞数量来改善心功能则需要大量心肌细胞,加上干细胞在移植区存活率较低,所以推测心功能的改善可能以血管内皮功能的改善为主。目的:通过对大鼠VEGF、ICAM-1和VCAM-1的检测,观察独参汤联合骨髓间充质干细胞是否对大鼠急性心肌梗死后血管内皮功能的改善有促进作用,以及独参汤与骨髓间充质干细胞在促进血管内皮功能改善方面是否有协同增效的作用。方法:在各组实验大鼠开胸取心脏标本前,开腹经腹主动脉取动脉血,将获得的动脉血经过离心后在-20℃冻存,用于血清VEGF、ICAM-1和VCAM-1的检测(具体操作步骤严格按试剂盒进行操作);并对VEGF进行Western-Blot检测。结果:1. VEGF血清检测结果与Western-Blot检测结果一致如下:①独参汤组、干细胞组和独参汤+干细胞组各值均较对照组有升高。②干细胞组和干细胞+独参汤组与对照组比较有显着升高(P<0.01)。③干细胞+独参汤组较干细胞组升高显着(P<0.05)。2.血清ICAM-1和VCAM-1的检测结果:①独参汤组、干细胞组和独参汤+干细胞组各值均较对照组有降低。②干细胞组与对照组比较明显降低(P<0.05)。③干细胞+独参汤组与对照组比较降低显着(P<0.01)。结论:1.独参汤联合骨髓间充质干细胞可明显改善大鼠心肌梗死后血管内皮功能,提示心梗后心功能的改善可能与血管内皮功能的改善有密切关系。2.独参汤对骨髓间充质干细胞在改善大鼠心肌梗死后血管内皮功能方面有促进作用,且两者存在协同增效的作用。
王晔玲[7]2007年在《老龄兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养及移植治疗心肌梗死的研究》文中研究指明缺血性心脏病因心肌供氧和需氧之间不平衡而导致心肌细胞减少、坏死、凋亡,心肌纤维化和心肌瘢痕形成是影响心脏功能的主要因素,也是导致顽固心力衰竭乃至死亡的病理基础。近年来,随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展以及对骨髓间充质干细胞(MSCs)研究认识的深入,通过移植技术将MSCs移入受损的心肌组织中生存增殖,替代坏死心肌,改善心脏功能,将为缺血性心脏病提供一种全新的治疗策略。干细胞移植治疗心肌梗死研究尚处于起步阶段,人们对MSCs可塑性的研究深入,以及对其应用于临床治疗心脏缺血病人的初步探索,为MSCs临床应用的潜能提供了实验和应用参考,但在大规模临床应用MSCs前,仍存在一系列基础和应用的问题亟待阐明。本实验第一部分选择新西兰大耳白兔月龄为12-46个月。抽取兔骨髓血,Percoll分离rMSCs,用含10%胎牛血清的L-DMEM重悬分离后的细胞。然后观察1、供体自然情况对MSCs生长的影响;2、不同接种密度对对原代rMSCs生长的影响;3、相同接种密度不同换液时间对rMSCs生长的影响;4、不同比例传代对rMSCs生长的影响;5、不同血清浓度对rMSCs生长的影响。第二部分:选择新西兰大耳白兔,月龄大于或等于36个月,首先结扎兔冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,然后观察:1、相同细胞剂量、心肌梗死不同时间的细胞移植对心功能的影响;2、相同心肌梗死时间、不同细胞剂量的移植对心功能的影响。结果:第一部分:1、供体年龄>36个月和≤36个月,其P1day有明显差别,说明年龄因素影响rMSCs的生长速度;但从不同年龄阶段供体获取的第3代hMSCs细胞数均在106数量级以上,完全能够满足自体修复需要。2、低密度接种P1day明显长于中密度组与高密度组,高密度接种细胞生长最快,适合实验和临床应用要求;3、2天后首次换液贴壁细胞数量明显少于3天、4天;4、1:2比例rMSCs传代P2-P3天数最短,1:4比例rMSCs传代P2-P3天数最长。5、8%-10%FCS血清浓度与20%FCS对传代rMSCs生长的影响两组区别无显着性,20%FCS未见加速其生长;第二部分:1、除4周组各项心脏功能指标无明显改善外,其他各组均有所改善;1周组、2周组、3周组优于1天组;1周组、2周组、3周组之间无明显差别。2、在不同移植细胞剂量、相同心肌梗死时间进行细胞移植时,高剂量组(移植4×10~6个)心功能改善更明显。本实验通过建立体外老龄兔MSCs培养体系,了解老龄兔MSCs的生物学特性,并观察老龄兔心肌梗死不同时期、不同细胞数量进行骨髓骨髓间充质干细胞(MSCs)的的移植及其植入心肌后的增殖、对心脏功能改善情况,探讨心肌梗死后细胞移植的最佳时间窗。在人口老龄化日益严重,缺血性心脏疾病严重威胁人类健康的今天,为细胞移植治疗心肌细胞坏死性相关疾病提供前期的实验依据。
徐亚丽[8]2009年在《诊断超声联合微泡促进MSCs归巢缺血心肌及改善心功能的实验研究》文中指出研究背景心肌梗死(Myocardial infarction, MI)是由于冠状动脉循环改变引起冠状血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,是临床上一种严重的缺血性心脏病(Ischemic heart disease, IHD)。目前,治疗冠心病的常用方法诸如药物、经皮冠状动脉腔内成形术及冠状动脉旁路移植等虽然能改善心肌缺血,却不能使梗死区的血管再生。新近国内外兴起的一些干细胞移植实验治疗缺血性心脏病,通过再生血管,为治疗这类疾病提供了新思路。干细胞移植治疗心肌梗死在大量动物实验及临床中的应用已取得了令人鼓舞的疗效,越来越多的证据表明,骨髓来源的干细胞能够参与血管新生,改善心肌梗死后血流灌注及心脏功能。被用于移植的细胞种类很多,其中骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)目前被公认最适合用于细胞移植治疗,其易于分离提取,具有高度的扩增潜能,有良好的基因稳定性、组织相容性好、不涉及伦理道德问题等优点,成为研究的热点。但干细胞移植治疗心肌缺血目前还存在一些问题,包括干细胞移植途径的有创性、细胞移植效率低下及干细胞的定向归巢能力欠佳等。如何寻找一种无创、移植效率更高及定向能力好的移植途径与方法呢?研究显示,脉冲式治疗超声联合白蛋白微泡Optison能有效将经静脉移植的骨髓单个核细胞靶向运送至心肌病动物模型,心肌毛细血管密度、缺血心肌的血流灌注,VCAM-1,ICAM-1等黏附分子表达均得到了显着提高,心脏功能也得到明显改善,表明超声介导的微泡破坏能提高干细胞的靶向归巢能力进而更有效地实现干细胞移植治疗心脏病的效果。研究目的1.探讨诊断超声联合微泡促进静脉移植骨髓MSCs归巢兔缺血心肌的可行性及其机制;2.探讨诊断超声联合微泡静脉移植MSCs改善梗死后心肌血流灌注和心功能的有效性;3.初步探讨诊断超声联合微泡作用下无创移植MSCs改善心肌梗死后心功能的可能机制。研究方法采用密度梯度离心联合贴壁培养法进行兔骨髓MSCs的分离、纯化及培养,检测其生物学特性。流式细胞仪检测细胞表面标记分子,成脂、成骨诱导分化进行细胞鉴定。冠状动脉左前降支结扎法建立兔心肌梗死模型,采用血清学、影像学及病理学方法评价模型的建立。以荧光标记物DAPI标记MSCs,移植48h观察标记MSCs在静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组心肌、肺等脏器的荧光分布并进行阳性细胞计数和统计学比较。MSCs移植后4周透射电镜观察各组(PBS组、超声+微泡组、静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组)心肌缺血区血管超微结构。免疫组织化学检测心肌缺血区VCAM-1、SDF-1表达并行定量分析。MSCs移植后4周HE染色检测心肌缺血区的血管密度(Capillary density,CD)、免疫组织化学检测CD34表达、western blot检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平,心肌声学造影(Myocardial contrast echocardiography, MCE)评价心肌血流灌注。Masson染色检测心肌胶原纤维形成,并计算各组胶原面积。免疫组织化学检测各组心肌梗死区Bax蛋白的表达情况。通过M型超声与双平面Simpson法检测左室收缩功能。结果培养的MSCs贴壁生长,呈梭形为主;细胞表面高表达CD44,几乎不表达CD45,不表达CD34。成脂诱导培养后油红O染色胞浆脂滴形成,成骨诱导后碱性磷酸酶染色见钙颗粒,茜素红S染色钙结节形成。冠状动脉结扎法建立MI模型后,MCE显示左室前壁、前间隔呈灌注缺损,Masson染色左室前壁梗死区呈蓝色染色。心肌梗死后兔左室收缩功能明显降低。荧光显微镜下计数并比较静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组心肌梗死及周围区DAPI阳性细胞数,分别为(147±19)个,(213±27)个,差异有统计学意义(P<0.01)。在正常供血区心肌内未见阳性细胞。透射电镜显示超声+微泡+MSCs组与超声+微泡组心肌缺血区血管一侧内皮细胞间隔增大,血管通透性增加。免疫组织化学检测SDF-1在各组中的心肌细胞胞膜与胞浆均有棕黄色阳性表达,超声+微泡+MSCs组的灰度(188.45±2.83)与静脉移植MSCs组(183.94±7.29)间差异无统计学意义(P>0.05),高于超声+微泡组(175.46±8.13)和PBS组(170.52±6.04)(两者P<0.05)。超声+微泡+MSCs组的VCAM-1阳性细胞数量(77±44)个显着高于静脉移植MSCs组(34±18)个,超声+微泡组(12±3)个及PBS组(8±5)个(叁者P<0.01)。HE染色检测超声+微泡+MSCs组平均CD为(44±23)个,高于PBS组(19±10)个、超声+微泡组(22±5)个及MSCs组(26±7)(叁者P<0.01)。Masson染色检测心肌胶原面积分别为PBS组(16.88±5.84)%、超声+微泡组(14.77±2.95)%、MSCs组(12.05±4.83)%和超声+微泡+MSCs组(8.97±3.5)%,超声+微泡+MSCs组与前叁组比较,胶原面积分别缩小约25.6%、40.1%及46.8%。免疫组织化学检测超声+微泡+MSCs组CD34阳性血管最多,分布密集,MSCs组较丰富,超声+微泡组次之,PBS组的阳性血管最少。Bax蛋白阳性表达在PBS组最高,超声+微泡组次之,MSCs组进一步减少,超声+微泡+MSCs组最少。M型超声检测超声+微泡+MSCs组的FS(%)测值显着高于PBS组和超声+微泡组比较, P<0.01,高于静脉移植MSCs组,P<0.05。EF(%)比较,超声+微泡+MSCs组较PBS组及超声+微泡组显着增高(P<0.01),与静脉移植MSCs组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。双平面Simpson法EF值超声+微泡+MSCs组高于PBS组(P<0.01)、超声+微泡组(P<0.01)及静脉移植MSCs组(P<0.05)。结论1.成功实现兔骨髓源性MSCs的分离、纯化及培养,密度梯度离心联合贴壁培养法是获取、纯化、扩增MSCs简便、易行的方法。细胞生长曲线、细胞周期、透射电镜检测提示培养的MSCs呈低分化状态,有较强的自我更新能力。流式细胞仪检测培养细胞高表达CD44,CD45呈阴性表达,免疫细胞化学检测CD34阴性,体外成脂、成骨诱导分化成功,判定所获细胞为MSCs。2.冠状动脉左前降支结扎法可建立稳定的兔MI模型,血清学、影像学及病理学检测可有效评价模型是否成功建立。3. DAPI作为一种荧光剂,可有效示踪MSCs在体内各脏器、各部位的分布,其方法简单、操作简便,可应用于干细胞的标记。4.诊断超声联合脂膜微泡通过声孔效应可增加心肌梗死兔心肌血管通透性,为经静脉移植的MSCs归巢到达缺血心肌提供了更多的通道与机会。微泡介导的超声空化效应可刺激超声辐照心肌缺血区小血管破裂及炎症发生,促进局部VCAM-1等黏附分子的表达,进而增强移植的MSCs向心肌缺血区聚集与归巢;同时,诊断超声介导的微泡破坏效应通过促进VEGF生成与表达、刺激心肌缺血区血管生成等途径能更加有效改善心肌梗死后血流灌注。5. MSCs移植后通过旁分泌效应促进血管生成因子VEGF、归巢相关因子SDF-1、黏附分子VCAM-1的表达及抑制凋亡相关因子Bax表达,进而有效增强MSCs的趋化、黏附、聚集及归巢能力,通过促进血管新生及抑制凋亡等机制来改善心肌梗死后心功能。6.静脉移植MSCs在超声联合微泡介导下通过抑制心肌梗死后胶原纤维形成,抑制心脏重构来改善心功能。7.本研究方法以无创、有效促进MSCs定向归巢及改善心肌梗死后心功能在干细胞治疗心肌梗死中显示出较好的应用前景,有望为干细胞移植治疗冠心病提供一种新方法。
李树仁[9]2007年在《经冠脉自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死后心室重构影响的研究》文中研究指明背景:急性心肌梗死(AMI)后心室重构(ventricular remodeling)指心肌梗死后心室的大小、结构以及心脏功能的变化过程,主要包括心肌梗死区膨出,非梗死区心肌肥大、室壁增厚、心肌间质纤维化,最终导致整个心室进行性扩张、心脏收缩功能减低,它已成为心肌梗死患者晚期死亡的主要原因。骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,但其机制尚不完全清楚,可能与以下途径有关:抑制心肌重构,阻止心肌细胞肥大和重构;抑制基质重构,减少胶原沉积和纤维化;促进血管重构,促进毛细血管新生和原有血管系统增殖,减少心肌细胞凋亡。目前,成体干细胞成为心脏细胞移植的主要细胞源,常用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓BM-MNC(BM-MNC)、骨髓MSCs(BMSCs)和内皮祖细胞(EPCs)等。目的:对比研究自体BM-MNC、MSCs对AMI后心室重构的影响,探讨不同干细胞移植对心室重构影响的机理。评价经冠状动脉BM-MNC和MSCs移植治疗AMI的效果及其安全性,为临床防治AMI后心室重构、治疗心力衰竭提供安全、有效的方法。方法:本研究以小型猪为研究对象,随机分为对照组(假手术组)、单纯AMI模型组、BM-MNC移植组、MSCs移植组。1.通过穿刺股动脉或颈总动脉,用球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法,建立小型猪急性心肌梗死动物模型。2.采用密度梯度离心法分离BM-MNC,采用贴壁法分离、培养MSCs,利用胶体金进行细胞标记。3.在急性心肌梗死90min时,进行经冠状动脉腔内自体BM-MNC和MSCs移植。4.心功能评价:分别于术前、术后即刻、干细胞移植后28天进行超声心动图检查,观察心功能情况。5.光、电镜病理学及免疫组化检查:单纯AMI组及BM-MNC和MSCs组,分别于造模后及干细胞移植后28天,进行心肌微血管计数、光镜、透射电镜检查、心肌组织核因子кB、心肌细胞凋亡检测、心肌增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen PCNA)免疫组化检测。6.采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,于AMI后28天检测心肌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA表达。结果:1.小型猪急性心肌梗死后心力衰竭模型的建立:36只猪均完成了PTCA球囊封堵术,28天后有31只成活。其中对照组存活6只、心肌梗死模型组及MSCs组各存活8只、BM-MNC组存活9只。球囊堵闭LAD2h ST段抬高的幅度为(0.43士0.35mv)。用球囊堵闭LAD后24h对照组、模型组、单个核组、间充质组CK水平分别为(112.50±70.23;1190.50±734.05;1162.55±837.23;1142.00±308.90 F=4.80,P=0.008);CK-MB水平分别为(15.33±5.85;121.62±74.11;101.77±79.65;105.25±42.42 F=3.93,P=0.019);cTnI水平分别为(2.48±1.13;49.66±44.73;55.05±47.42;45.61±26.73 F=2.78,P= 0.06)。单纯AMI模型组、单个核组、间充质组比对照组血清心肌损伤标志物cTnI和CK、CK-MB水平均升高,差别有显着性意义。单纯AMI模型组、BM-MNC和MSCs之间心肌损伤标志物水平无显着差异。通过心脏超声检查发现术前各组的左室收缩末内径(ESD)、左室舒张末内径(EDD)、左室射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)均无显着性差异。术后2h时,正常对照组、AMI模型组、BM-MNC和MSCs组EF分别为(61.70士3.91%;46.2士23.62%;45.13士33.02;47.25士5.41 F=23.88 P=0.0001),AMI模型组、BM-MNC和MSCs组的EF值比正常对照组降低,差别有显着性意义。AMI模型组、单个核组、间充质组的组间EF值差异无统计学意义。术后28天光镜检查发现,模型组的梗死区可见大片纤维化区,梗死区及边缘区可见大量炎性细胞浸润,干细胞移植组的梗死纤维化区及梗死边缘区可见大量血管增生、炎细胞浸润。电镜下梗死模型组、BM-MNC和MSCs组的心肌梗死区可见大量纤维母细胞增生。2.骨髓BM-MNC和MSCs体外分离、培养、诱导分化和鉴定。骨髓细胞经密度梯度离心后,可清楚观察到介于分离液和血浆间的BM-MNC层。通过贴壁法获得MSCs,72h可见细胞分散贴壁生长,2-4天后细胞开始快速增殖,集落逐渐增大,9-11天细胞集落间出现相互融合,大部分呈长梭形,胞核较大,可见处于分裂期的核仁,胞体肥大,胞质丰富。集落达到80%-90%融合时进行消化传代,每瓶单层汇合的MSCs用胰蛋白酶消化后平均获得5.5×105个MSCs,将这些细胞再传代培养7天左右开始汇合,继续传代扩增。第10代以后的细胞增长速度明显减慢。3.经冠脉移植自体BM-MNC和MSCs对急性心肌梗死后心室重构的影响。心脏功能的变化:术后28天,正常对照组、BM-MNC组、MSCs组EDD均明显低于模型组(F=5.30,P=0.005),EF及FS均明显高于模型组(F=10.67,P=0.0001;F=6.64,P=0.0017)。正常对照组、BM-MNC组、MSCs组组间相比上述指标无显着性差异。正常对照组、模型组、BM-MNC组、间充质干胞组室壁运动异常指数依次为(1;3.25±1.03;2.44±0.72;2.25±0.46 F=11.95,P=0.001),模型组与BM-MNC和MSCs组相比有显着性差异。BM-MNC和MSCs组运动异常指数相比无显着性差异。28天时处死动物,光镜下可见BM-MNC移植组:在梗死纤维化区及梗死边缘区可见大量血管增生,梗死边缘区可见有大量炎细胞浸润。电镜下BM-MNC组,可见较多的毛细血管“芽生”现象。MSCs移植组在梗死边缘区可见不成熟的心肌细胞,胞核较小,可见胶体金颗粒。梗死模型组、BM-MNC组、MSCs移植组,在心肌梗死区、梗死边缘区及正常区均可见心肌细胞凋亡。血管数的变化:梗死区及梗死边缘区的血管数:梗死组、BM-MNC组、MSCs组比正常组的血管数增加,有非常显着性差异;BM-MNC移植组血管数比梗死组及MSCs组增加,有非常显着性差异(梗死区F=34.87 P=0.0001,边缘区F=29.56 P=0.0001);无梗死的正常心肌区:梗死组、BM-MNC组及MSCs组比正常组的血管数增加,有非常显着性差异;BM-MNC移植组及间充质组血管数比梗死组增加,有非常显着性差异(F=14.74 P=0.0001)。心肌组织核因子кB阳性率的变化:正常对照组与模型组、BM-MNC组、MSCs组的心肌梗死区的NF-кB阳性率无显着差异(F=1.02,P=0.397);与正常组相比模型组、BM-MNC组、MSCs组的心肌梗死边缘区的NF-кB阳性率均显着增加(F=19.05,P=0.001);BM-MNC组及MSCs组NF-кB阳性率比单纯AMI模型组显着降低;BM-MNC组、MSCs组间NF-кB阳性率无显着性差别;模型组、BM-MNC组、MSCs组的正常区NF-кB阳性率比正常组NF-кB阳性率显着升高(F=8.67,P=0.003);模型组、BM-MNC组、MSCs组之间的正常区NF-кB阳性率差异无显着性意义。心肌细胞凋亡检测结果:梗死区心肌细胞凋亡:模型组、BM-MNC组、MSCs组的梗死区心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显着性意义(F=14.31,P=0.0001),模型组、BM-MNC组、MSCs组间心肌细胞凋亡率差别无显着性意义。梗死边缘区心肌细胞凋亡情况:模型组、BM-MNC组、MSCs组心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显着性意义(F=35.34,P=0.0001);模型组比BM-MNC组及MSCs组心肌细胞凋亡率增加,差别有非常显着性意义,BM-MNC组及MSCs组之间心肌细胞凋亡率差别无显着性意义。正常区心肌细胞凋亡情况:模型组、BM-MNC组心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显着性意义(F=5.33,P=0.0052);MSCs组与正常组相比细胞凋亡率差别无显着性意义。心肌组织肌钙蛋白I及核增殖抗原(PCNA)免疫组织化学检测结果:心肌梗死区肌钙蛋白I表达减少,BM-MNC组以及MSCs组在梗死区及梗死边缘区,肌钙蛋白I表达增加。在梗死区冠状动脉周围可见肌钙蛋白I阳性表达。BM-MNC组以及MSCs组在梗死区及梗死边缘区可见大量PCNA阳性细胞生长。VEGF基因相对表达量:梗死模型组、BM-MNC组以及MSCs组的梗死区及梗死边缘区的VEGF基因表达量与正常对照组的相比增加,差异有非常显着性意义(梗死区F=20.11,P=0.0001;梗死边缘区F=49.41,P=0.0001); BM-MNC组梗死边缘区VEGF基因表达量比梗死模型组及MSCs组的升高有显着性意义;MSCs组与梗死模型组相比VEGF基因表达无显着差异。梗死模型组、BM-MNC移植组以及MSCs移植组的正常区的VEGF基因表达量与正常对照组的相比提高,差异有显着性意义(F=9.37,P=0.0002)。bFGF基因相对表达量:BM-MNC及MSCs移植组,心肌梗死区的bFGF基因表达量比梗死模型组及正常对照组均显着增加,差别有非常显着性意义(F=23.69,P=0.0001);BM-MNC及MSCs移植组之间,梗死模型组及正常对照组间bFGF无显着差异。MSCs移植组,心肌梗死边缘区的bFGF基因表达量比梗死模型组、BM-MNC组及正常对照组的均显着增加,差别有非常显着性意义(F=4.71,P=0.0091)。BM-MNC及MSCs移植组,正常区的bFGF基因表达量比正常对照组增加,差别有非常显着性意义(F=7.02,P=0.0013);梗死模型组与正常对照组相比,差别无显着性意义;MSCs移植组与梗死模型组相比差别有显着性意义。心功能与心肌细胞凋亡、心肌组织NF-кB、心肌血管数及VEGF、bFGF的相关性:AMI 28天时,LVEF与心肌细胞凋亡呈负相关(r=-0.4411,P=0.0273),与心肌NF-кB负相关(r=-0.5796,P=0.0006)。BM-MNC移植后28天,LVEF与梗死区、边缘区血管数正相关(r=0.775 , P=0.0003);与VEGF表达正相关(r=0.5651,P=0.0181);与bFGF表达正相关(r=0.5735, P=0.0161)。MSCs移植后,LVEF与心肌血管数正相关,(r=0.5437 , P=0.0295);与bFGF表达正相关(r=0.5857, P=0.0171);心肌细胞凋亡与心肌组织NF-кB呈正相关(r=0.7027,P=0.0001),。结论:1.采用球囊封堵的方法成功建立了心肌梗死后心力衰竭的动物模型。2.采用密度梯度离心法及贴壁法成功获得骨髓BM-MNC及MSCs,采用胶体金标记,减少了标记物对细胞的毒性作用。3.经冠脉自体BM-MNC及MSCs移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,改善急性心肌梗死后心功能,可显着降低心肌梗死边缘区NF-кB表达,减轻梗死边缘区及正常区心肌细胞凋亡。BM-MNC及MSCs移植可显着增加梗死区、梗死边缘区及正常区血管数量;增加梗死区及梗死边缘区VEGF及bFGF表达。BM-MNC及MSCs移植后,移植细胞可在梗死部位心肌内存活。4.心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量、增加心肌VEGF及bFGF表达、减少心肌细胞凋亡以及减少心肌组织NF-кB水平有关。5. BM-MNC移植组促心肌血管增生作用优于MSCs组,BM-MNC移植组梗死边缘区心肌VEGF的表达优于MSCs组。MSCs移植后bFGF基因表达量比BM-MNC组显着增加。MSCs移植组胶体金标记细胞术BM-MNC组。
段红艳[10]2003年在《骨髓细胞移植对心肌梗死后心功能影响的研究进展》文中研究说明传统认为 :在成熟个体中 ,心肌属终末分化组织 ,一旦损伤只能由疤痕组织代替。目前对心肌梗死的治疗主要包括药物、介入和手术治疗 ,上述方法能改善心肌缺血和心衰症状 ,使闭塞的血管再通 ,却不能替代坏死心肌。残留心肌代偿性肥厚使心室重构最终发展为心力衰竭。
参考文献：
[1]. 骨髓基质细胞移植改善心肌梗死后心功能的研究[D]. 陈建昌. 苏州大学. 2003
[2]. 骨髓基质细胞心肌移植的初步研究[D]. 唐滔. 中南大学. 2003
[3]. 转染胰岛素样生长因子-1的骨髓基质细胞对心肌梗死后心功能的影响[J]. 胡成俊, 卓儒红, 郑勇, 吴艳. 武汉大学学报(医学版). 2009
[4]. 骨髓单个核细胞移植对心肌梗死后心功能影响的实验研究[D]. 徐红新. 武汉大学. 2004
[5]. 骨髓间充质干细胞移植和基因转染治疗心肌梗死的实验研究[D]. 牛丽丽. 第叁军医大学. 2003
[6]. 独参汤联合骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死大鼠的相关研究[D]. 王祺. 辽宁中医药大学. 2011
[7]. 老龄兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养及移植治疗心肌梗死的研究[D]. 王晔玲. 吉林大学. 2007
[8]. 诊断超声联合微泡促进MSCs归巢缺血心肌及改善心功能的实验研究[D]. 徐亚丽. 第叁军医大学. 2009
[9]. 经冠脉自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死后心室重构影响的研究[D]. 李树仁. 河北医科大学. 2007
[10]. 骨髓细胞移植对心肌梗死后心功能影响的研究进展[J]. 段红艳. 实用诊断与治疗杂志. 2003
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