导读:本文包含了东方巴贝斯虫论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:东方巴贝斯虫,TRAP2,蛋白表达,相互作用
东方巴贝斯虫论文文献综述
何军伟[1]（2017）在《东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆表达及其部分功能研究》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是1984年新发现并证实的巴贝斯虫新种,临床研究表明其仅仅对水牛有较严重的致病性,并由镰形扇头蜱经卵传递,主要分布在我国长江以南的区域。患病动物临床表现为贫血、高热、黄疸和血红蛋白尿等症状,严重时会导致死亡,对我国南方农业生产和水牛养殖业造成严重威胁。当前,水牛巴贝斯虫病的防治还是传统的用药物涂抹防治,治疗效果很不理想,而临床用于防控治疗东方巴贝斯虫病疫苗鲜有报道,对虫体侵染宿主相关的关键分子研究也不系统。基于此,本研究选取已经在顶复门类原虫中确定的关键入侵分子TRAP蛋白为研究对象,从现有的东方巴贝斯虫基因库里钓取了东方巴贝斯虫凝血酶敏感素相关无名蛋白 2 (Babesia orientalis Thrombospondin-related anonymous protein2, BoTRAP2)基因信息并进行克隆与分析,并探索了 BoTRAP2蛋白与水牛红细胞膜蛋白的互作,BoTRAP2蛋白及其结构域在与肝素的结合时的功能特点,最后对BoTRAP2蛋白晶体的形成也进行了尝试。(1)东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆、表达和生物信息学分析通过序列比对在东方巴贝斯虫全基因库中查找到了一段和牛巴贝斯虫TRAP2基因序列(XM_001609762.1)同源性极高的序列。设计特异性的引物在东方巴贝斯虫全基因库中扩增到一条2817bp的片段,对该核苷酸序列进行生物信息学分析,发现其含有2段vWFA结构域、2段TSP结构域、1段MIADS结构性域、1段横跨膜结构域,与典型的TRAP样家族核苷酸结构非常吻合,表明该基因序列为东方巴贝斯虫TRAP2基因。同源性分析表明该氨基酸序列与牛巴贝斯虫TRAP2氨基酸序列的同源性高达94%,生物信息学软件分析表明该蛋白具有很好的抗原性。(2)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白和红细胞膜蛋白的相互作用选取TRAP2蛋白的关键结构域(含有vWFA、TSP、MIADS关键序列区域)进行截短表达,设计含有合适酶切位点特异性的引物克隆TRAP2-vWFA-TSP,构建含单一 His标签的原核表达质粒pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP,转入BL21表达菌株中。经过探索,在18℃、100rpm、IPTG浓度1.0mM、培养15h能得到高效表达在上清液的蛋白,通过镍柱纯化能获得高纯度的目的蛋白。Far-western验证重组TRAP2-vWFA-TSP蛋白与红细胞膜蛋白的互作,结果显示在红细胞膜蛋白上有一条疑似目的条带,表明东方巴贝斯虫TRAP2蛋白与红细胞膜表面的某一蛋白有一定的结合作用。(3)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白及其结构域和肝素的粘附结合分别构建 pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP、pET-28a- TRAP2-vWFA、pET-28a-TRAP2-TSP原核表达质粒,转入BL21表达菌株中,经过探索,获得了大量高纯度的重组 TRAP2-vWFA-TSP、TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP 蛋白,通过 ELISA 验证TRAP2蛋白及其结构域与肝素的相互作用。结果显示TRAP2蛋白及其结构域与肝素都有很好的结合,并且TRAP2-vWFA-TSP蛋白与肝素的结合亲和力强于单独的TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白与肝素结合的亲和力之和,这也表明了在TRAP2蛋白与肝素结合时其单个结构域可能起着协同作用。(4)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白晶体的初筛将纯化后的截短pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白用型号为GE Superdx200pg分子筛纯化柱再次纯化,依据分子筛的运行图得知pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白以二聚体复合物的形式存在,经过分子筛纯化浓缩后能得到蛋白浓度为9mg/mL、纯度>90%的目的蛋白,经过商业化结晶板进行初筛得到疑似蛋白晶体的小晶块,通过改变Buffer缓冲液中的盐离子、沉淀剂的浓度来进行优化,实验未得到理想的结果,需要进一步摸索条件。本课题成功克隆了东方巴贝斯虫的TRAP2基因并进行了生物信息学分析,利用原核表达系统表达了 BoTRAP2基因的关键结构域,验证了 BoTRAP2蛋白抗原性及BoTRAP2蛋白与红细胞膜蛋白的互作,证实了 TRAP2蛋白及其结构域蛋白与肝素存在的特异性结合。上述实验结果,对深入探讨巴贝斯虫入侵宿主的分子机制及对巴贝斯虫病的免疫预防研究具有重要意义。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
黄源[2]（2016）在《东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是牛的巴贝斯虫病中比较特殊的一个血液原虫虫种,其仅感染水牛的红细胞,由镰形扇头蜱经卵传播。在我国长江以南多省份均有流行,患病动物常出现黄疸、高热、贫血和血红蛋白尿等症状,严重时甚至死亡,对我国的水牛养殖业造成巨大的经济损失。现阶段对于东方巴贝斯虫的基因组信息所知有限,入侵相关机制的研究也鲜有报道。基于此,本研究一方面克隆并注释了东方巴贝斯虫的顶质体基因组DNA序列,并对其总体的结构特征进行了详细的比对分析;另一方面,钓取了东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因信息,对RON2与AMA1的相互作用进行了初步研究。(1)B.orientalis顶质体基因组的测序分析对于顶质体基因组,根据基因组测序的高通量测序序列和cDNA文库钓取的部分顶质体DNA序列,结合NCBI公布的顶复门血液原虫顶质体DNA序列,选择其保守区设计引物,克隆东方巴贝斯虫顶质体DNA全长。测序结果用软件进行拼接,Artemis做注释。结果表明,东方巴贝斯虫顶质体基因组全长33200bp的环状分子,AT含量在78.9%,包含1个核糖体大亚基(LSU)、1个核糖体小亚基(SSU),38个编码蛋白的开放读码框以及24个转运RNA(tRNA)。其中38个ORF包括4个DNA依赖的RNA合成酶小亚基(rpoB、rpoC1、rpoC2a、rpoC2b)、17个核糖体蛋白、1个翻译延长因子(tufA)、2个Clp分子伴侣基因以及14个大小功能未知的假定蛋白。进一步对所获得的东方巴贝斯虫顶质体基因组DNA与NCBI上有报道的相关顶复门寄生虫作了详细的比对分析,综合的结果表明东方巴贝斯虫顶质体基因组从基因组大小,基因种类,基因结构,基因排列顺序,基因进化分析等一系列特征上都与牛巴贝斯虫的顶质体最为接近。(2)棒状体颈部蛋白RON2和AMA1基因的相互作用根据NCBI上公布的顶复门寄生虫的RON2序列及部分假定蛋白序列和东方巴贝斯虫基因组测序获得的部分序列,设计引物克隆东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因,获得的测序结果全长为4035bp,本研究选取了RON2与AMA1有相互作用的功能域进行截短表达,分别设计特异性引物克隆BoRON2-2、BoRON2-5,构建GST标签原核表达质粒pGEX-KG-RON2-2、pGEX-KG-RON2-5,高效表达。用纯化后的RON2-2、RON2-5重组蛋白进行Far-western实验,以及和AMA1蛋白的粘附ELISA实验。结果表明,重组表达的RON2-2及RON2-5与东方巴贝斯虫全虫抗原中的AMA1之间存在相互作用,并且二者之间的相互作用以一定的比例进行粘附。(本文来源于《华中农业大学》期刊2016-06-01）
范丽哲[3]（2014）在《东方巴贝斯虫3个免疫相关基因的克隆表达》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种寄生于水牛红细胞内,由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫,只引起水牛巴贝斯虫病。该病主要分布在中国长江以南,主要临床症状为发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿,严重时导致死亡,给我国水牛养殖业带来了巨大损失。尽管对东方巴贝斯虫的体外培养、形态学、传播媒介、分子分类学和诊断方法等有了一定的认识,但对其入侵机制还不了解,缺乏有效的抗原用于免疫诊断和预防。本研究在建立了东方巴贝斯虫cDNA文库的基础上,通过免疫筛选挑选3个可能与免疫相关的基因,对其进行生物信息学分析,原核或真核表达及免疫原性研究。(1)B. orientalis cDNA文库的免疫筛选用东方巴贝斯虫阳性的水牛血清对东方巴贝斯虫裂殖子cDNA文库进行免疫筛选,挑选其中3个可能与免疫相关的基因：BoP34、BoP21和AMA1,对其进行克隆测序和生物信息学分析。BoP34基因的核苷酸序列全长为1088bp,包含两个开放阅读框(ORF),编码251个氨基酸,蛋白分子量约为34kDa。BLAST分析表明,BoP34与牛巴贝斯虫核移动蛋白(XM001611335)核苷酸序列的相似性为72%,证明其为东方巴贝斯虫的核动蛋白基因。BoP21基因的核苷酸序列全长为732bp,包含一个579bp的ORF,编码192个氨基酸,蛋白分子量约为21kDa。BLAST分析表明,BoP21与牛巴贝斯虫假定蛋白(BAN64167.1)核苷酸序列的相似性为68%,证明其为东方巴贝斯虫的假定蛋白基因。东方巴贝斯虫AMA1基因的核苷酸序列全长为1803bp,没有内含子,编码600个氨基酸,蛋白分子量约为67kDa。同源性分析表明,该基因与牛巴贝斯虫(GenBank序列号：XP001611043)、双芽巴贝斯虫(GenBank序列号：ADP02977)、吉氏巴贝斯虫(GenBank序列号：ABD04040) AMA1核苷酸序列的相似性分别为72%、52%和53%。结构分析表明,它具有AMA1基因家族的氨基酸结构特征,如N端信号肽,形成二硫键的半胱氨酸残基,含有叁个结构域的胞外域,C端跨膜区及胞质尾域。(2)BoP34、BoP21和AMAl基因的克隆、原核表达及免疫反应原性根据BoP34、BoP21和AMAl基因的全长测序结果,分别设计特异性引物克隆BoP34-ORF2、BoP-ORF和AMA1的结构域Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ,构建原核表达质粒pET-32a-BoP34-ORF2. pET-28a-BoP21-ORF和pET-28a-AMA1-DI/II/III,在E.coliBL21中实现了高效表达。将纯化后的BoP34、BoP21和AMA1蛋白分别免疫日本大耳白兔,制备了抗东方巴贝斯虫BoP34、BoP21或AMA1的多克隆抗体。ELISA结果表明,制备的BoP34、BoP21和AMA1多克隆抗体效价分别为100×27,100×27和100×28；Western blot结果显示,BoP34、BoP21和AMA1重组蛋白均可被东方巴贝斯虫阳性的水牛血清所识别,表明此3种蛋白均具有良好的免疫反应原性。分别用BoP34、BoP21和AMA1的多抗血清免疫印迹东方巴贝斯虫总蛋白,均看到与目的蛋白大小一致的特异性条带,表明此3种蛋白均存在于东方巴贝斯虫中。(3)AMA1截短片段的真核表达根据AMA1蛋白二硫键的位置,将AMA1胞外域划分为3个结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,分别克隆结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ/Ⅲ和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ,插入Flag标签后将其连接真核表达载体pT8,通过脂质体转染COS-1细胞,48h后通过间接免疫荧光检测到所有质粒均表达在细胞表面。本研究通过筛选东方巴贝斯虫cDNA文库,挑选3个免疫相关的基因——BoP34、BoP21和AMA1。对它们进行了克隆表达,生物信息学分析,制备了各自的多克隆抗体,并验证了它们均具有良好的抗原性,且在东方巴贝斯虫中有较高量的表达。这些研究为进一步深入探索BoP34、BoP21和AMA1在东方巴贝斯虫中的功能奠定了基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2014-06-01）
余倩[4]（2013）在《东方巴贝斯虫热休克蛋白20基因克隆表达及功能研究》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是寄生于水牛的一种重要的血液原虫,以镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)为传播媒介,临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时导致水牛死亡。东方巴贝斯虫病在我国南方许多省份发生和流行,造成严重经济危害。本实验室通过对东方巴贝斯虫的形态学、生活史、传播媒介和分子分类学等多方面详细研究,确立B. orientalis为一新种。近年来,本实验室致力于B.orientalis分子生物学研究,对东方巴贝斯虫进行了全基因组测序,为研究B.orientalis的功能基因提供了重要途径。小分子热休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)是分子量大小在12-43kDa,具有保守的约80～100氨基酸组成的α晶状体蛋白结构域的一类热休克蛋白亚家族。sHSPs与寄生虫感染具有重要的关系,其中小分子热休克蛋白HSP20影响顶复门寄生虫的移行和入侵等过程。巴贝斯虫的HSP20蛋白非常保守,是一种重要的虫体抗原,能够引起特异性T细胞的免疫应答。本研究通过比对基因组信息,找出东方巴贝斯虫HSP20基因片段,对该基因进行克隆和序列分析。随后对该基因进行表达,研究东方巴贝斯虫HSP20蛋白的免疫原性等,具体工作包括以下几个方面：(1)东方巴贝斯虫HSP20基因的克隆及序列分析通过比对东方巴贝斯虫基因组数据库找到与牛巴贝斯虫HSP20基因(AF331455.1)具有高同源性的序列片段。设计引物从东方巴贝斯虫基因组DNA中扩增得到690bp的完整东方巴贝斯虫HSP20基因(BoHsp20),其ORF为534bp,编码177个氨基酸。预测的蛋白序列中具有小分子热休克蛋白家族保守的α晶状体蛋白结构域,表明该蛋白为东方巴贝斯虫小分子热休克蛋白20(BoHSP20)。 BoHSP20序列与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫HSP20序列的同源性分别高达94%、86%和86%,以此蛋白序列建立的分子进化分析表明东方巴贝斯虫属于独立的巴贝斯虫新种,且与牛巴贝斯虫亲缘关系最接近。生物信息学分析表明,BoHSP20具有良好的抗原性。(2)东方巴贝斯虫HSP20的原核表达、纯化及重组蛋白的抗原性本研究克隆至BoHsp20完整的开放阅读框,将其插入原核表达载体pET-28a,成功构建了原核表达质粒pET-28a-BoHSP20。将重组质粒转入大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,经SDS-PAGE分析在约20kDa位置有明显的特异性表达条带,与预期一致,表明得到高效表达的重组蛋白His-BoHSP20。经镍亲和层析柱纯化后,得到单一的目的蛋白。用纯化后的BoHSP20蛋白与感染东方巴贝斯虫的水牛血清进行Western blot反应,BoHSP20蛋白与阳性牛血清可产生特异性的反应条带,表明该重组蛋白具有良好的抗原性。(3)东方巴贝斯虫HSP20的免疫反应原性用重组BoHSP20蛋白作为抗原,检测实验感染东方巴贝斯虫的水牛血清样品的抗体水平。结果表明,在水牛感染后的第16天即可检测到东方巴贝斯虫抗体,抗体水平维持较高值至感染的62天。说明东方巴贝斯虫HSP20可以诱导体液免疫。另外,用本研究制备的BoHSP20蛋白的多克隆抗体对东方巴贝斯虫进行间接免疫荧光试验。结果表明,多抗血清能识别东方巴贝斯虫虫体蛋白,特异性荧光分布于整个虫体表面。两方面实验表明,东方巴贝斯虫HSP20蛋白具有良好的免疫反应原性,可以诱导宿主的体液免疫反应,并且可用于东方巴贝斯虫的间接免疫荧光检测。(4)东方巴贝斯虫HSP20的分子伴侣活性检测本研究发现,将BoHSP20转入大肠杆菌中大量表达可以提高菌株在50℃热激条件下的存活率达2倍以上。另外,重组BoHSP20可抑制BSA在化学变性剂作用下的变性聚集。表明东方巴贝斯虫HSP20蛋白具有分子伴侣活性。本研究成功克隆了BoHsp20基因,该基因与其他巴贝斯虫HSP20基因具有高度保守性；并验证了该蛋白具有良好的免疫反应原性,可以诱导宿主的体液免疫反应,并可用于东方巴贝斯虫的间接免疫荧光试验；最后分析了该小分子热休克蛋白的分子伴侣活性,提示东方巴贝斯虫HSP20具有重要的功能,为东方巴贝斯虫病的防控和免疫机制研究打下了基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2013-06-01）
张文杰[5]（2012）在《东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis,简称：B.o)是一种由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫,主要引起水牛发病,临床症状以高热,贫血,黄疸,消瘦和血红蛋白尿等为特征,严重时导致水牛死亡。东方巴贝斯虫的发现到目前已经有二十多年,尽管对其形态学、流行病学、生活史、分子分类和诊断技术等方面进行了详细的研究,但关于该病原的入侵机制以及候选疫苗筛选等方面的研究仍然有限。因此,本研究在建立的东方巴贝斯虫基因组数据库的基础上,克隆与虫体入侵相关的棒状体相关蛋白I(RAPl)基因,对其进行氨基酸序列和进化分析,随后对其进行原核表达及免疫荧光定位,从而为阐明东方巴贝斯虫的入侵和免疫机制提供依据。(1)东方巴贝斯虫RAPl基因克隆及其结构预测根据从数据库获取的东方巴贝斯虫RAPl基因的相关信息设计一对特异性的引物RAP1-F/RAP1-R,从东方巴贝斯虫基因组扩增到一条1732bp的包含RAPl基因全长的序列。基因序列分析表明其包含一个1434bp的ORF,编码477个氨基酸。同源性分析表明,此蛋白基因序列与羊巴贝斯虫RAPl(Babesia ovis RAP1)基因(GenBank序列号：M91173.1)的第二个CDS序列同源性最高为71%；与牛巴贝斯虫(Babesia bovis; AF030058.1)、驽巴贝斯虫(Babesia caballi; AB017700.1)、犬巴贝斯虫(Babesia canis; M91168.1)的同源性分别为68%、63%和64%。预测的氨基酸序列与牛巴贝斯虫(GenBank序列号：AAB84268.1)的同源性最高为58%；与羊巴贝斯虫(AAA27805.1)、驽巴贝斯虫(ADF30793.1)、犬巴贝斯虫(AAA27807.1)的同源性分别为43%、48%和42%。RAPl氨基酸序列的进化分析表明东方巴贝斯虫是归属于巴贝斯虫的一个独立的新种。结构分析表明,它具有巴贝斯虫RAPl基因家族所特有的一些氨基酸结构特征,如N末端具有一个17个氨基酸的信号肽；四个保守半胱氨酸残基；十四个氨基酸保守基序；前300个氨基酸的一些保守的基序以及C末端的5个串连的重复区域等。(2)东方巴贝斯虫RAPl原核表达、免疫定位及免疫反应原性根据RAPl基因的序列结构特点,其主要的预测功能位点都处在N末端的前叁百个氨基酸内,本研究将克隆的东方巴贝斯虫RAPl开放阅读框全长(RAPl-F)和N末端834bp片段(RAP-N)连接到原核表达载体pGEX-KG,成功的构建了原核表达质粒pGEX-KG-RAP1-F和pGEX-KG-RAP1-N。利用原核表达所得的重组蛋白GST-RAP1-F和GST-RAP1-N免疫新西兰白兔成功的制备了多克隆抗体。利用东方巴贝斯虫感染水牛阳性血清的Western-blot分析表明,GST-RAP1-F和GST-RAP1-N都具有良好的反应原性。间接免疫荧光实验证明东方巴贝斯虫RAP1定位在红细胞内的虫体表面。本实验成功的克隆了东方巴贝斯虫RAP1基因,其基因序列与结构预测分析为进一步证明东方巴贝斯虫为独立新种提供了有力的依据；免疫荧光定位实验初步证实东方巴贝斯虫RAP1也与虫体入侵宿主红细胞相关；原核表达的结果为我们预防控制东方巴贝斯虫病提供了一定的理论基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2012-06-01）
张庆丽[6]（2012）在《牛红细胞表面受体糖蛋白和东方巴贝斯虫球状体蛋白3基因的克隆表达及分析》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫,只引起水牛巴贝斯虫病。本实验室前期的研究证实东方巴贝斯虫是一独立新种。因为东方巴贝斯虫只感染水牛,不感染黄牛和奶牛,推测可能与不同巴贝斯虫入侵配体或不同种牛红细胞受体的不同有关。由于东方巴贝斯虫裂殖子入侵红细胞的分子过程还不清楚,为从分子水平上寻找东方巴贝斯虫仅感染水牛而不感染黄牛和奶牛的原因,本研究主要从东方巴贝斯虫入侵相关的牛红细胞受体与东方巴贝斯虫入侵相关配体两方面进行研究。1.牛红细胞表面受体糖蛋白基因的克隆,分析与表达。(1)黄牛、奶牛和水牛红细胞表面受体GYPC、DARC和GYPA基因的克隆及序列分析根据GenBank公布的牛Glycophorins C (GYPC)、Duffy antigen/chemokine receptor (DARC)、Glycophorins A (GYPA)基因序列分别设计四对、两对、六对特异性引物,采用PCR方法分别从黄牛、奶牛和水牛全血基因组中扩增得到GYPC、 DAR、GYPA的基因片段,分别构建克隆载体后测序鉴定。利用clustalx和Primer Premier5.0拼接GYPC四个外显子序列、DARC的两个外显子序列和GYPA的六个外显子序列。利用DNAStar软件预测黄牛、奶牛和水牛的GYPC、DARC和GYPA的亲水性、抗原性、表面活性、等电点、一级结构、二级结构等,利用在线软件预测跨膜区,糖基化位点和信号肽,并进行比较分析。结果表明水牛GYPC、GYPA的一级结构,二级结构,等电点,糖基化位点与数目与黄牛和奶牛的GYPC都有较大差异；黄牛、奶牛和水牛DARC的等电点,一级结构,二级结构,等电点,跨膜区,糖基化位点都有差异。(2)黄牛GYPA基因的真核表达将人工合成的黄牛GYPA基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,并连接绿色荧光蛋白基因EGFP, pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP质粒测序鉴定后,通过脂质体转染PK, MDBK细胞,24h时可以看到绿色荧光,36h时荧光最强。空白荧光对照质粒pCDNA3.1(+)-EGFP的荧光分布于细胞内,pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP质粒转染细胞后荧光分布在细胞膜周围且荧光强度弱于空白荧光对照质粒pCDNA3.1(+)-EGFP,这是由于GYPA基因含有信号肽,蛋白质表达后分泌到细胞表面,而且目的蛋白的表达降低了荧光蛋白的强度。总之,通过黄牛、奶牛和水牛GYPC、DARC和GYPA的克隆和序列比较分析,推测水牛GYPC、GYPA序列与黄牛、奶牛的差异较大,可能是东方巴贝斯虫只感染水牛的原因,具有深入研究价值。2.东方巴贝斯虫SBP3基因的克隆,序列分析,原核表达及免疫反应性研究(1)东方巴贝斯虫SBP3基因的克隆及序列分析利用本实验室东方巴贝斯虫基因组测序结果和GenBank中相关的牛巴贝斯虫SBP3基因序列,设计特异引物,以含虫全血基因组作为模板,通过PCR扩增获得东方巴贝斯虫的SBP3基因,测序结果显示序列全长为3237bp,为一个完整的开放阅读框,推测出蛋白质分子量为118kDa,含1079个氨基酸残基。基因序列同源性分析分析结果表明东方巴贝斯虫与牛巴贝斯虫SBP3(GenBank序列号：AF107117.1)序列同源性最高为70%,东方巴贝斯虫SBP3比牛巴贝斯虫基因序列少33bp,蛋白质序列少11AA,进一步说明东方巴贝斯虫是新种。利用DNAStar软件中的Protean预测东方巴贝斯虫SBP3抗原决定簇,结果表明其具有良好的抗原性。(2)东方巴贝斯虫SBP3的原核表达及免疫反应性研究SBP3基因截短表达,分叁段命名为SBP3-1,SBP3-2,SBP3-3,长度分别为927bp,1329bp,1026bp。克隆入pET-28a(+)原核表达载体中,构建pET-28a(+)-SBP3-1,pET-28a(+)-SBP3-2,pET-28a(+)-SBP3-3原核表达质粒。将构建的质粒转化至大肠杆菌BL21-CondonPlus, IPTG诱导HIS-SBP3融合蛋白表达。Western-blot检测获得40kD,53kD,42kD的目的带,大小与蛋白理论预测值相符,表明SBP3重组蛋白与东方巴贝斯虫病阳性牛血清的天然抗体发生特异性反应,说明东方巴贝斯虫SBP3具有很好的免疫反应原性。本研究完成了东方巴贝斯虫SBP3的克隆,原核表达,Western-blot,表明SBP3可作为潜在的免疫检测和亚单位疫苗的候选抗原。(本文来源于《华中农业大学》期刊2012-05-01）
贺兰[7]（2011）在《东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种蜱传性血液原虫,由镰形扇头蜱经卵传播,仅对水牛致病。该病主要在我国长江以南地区发生和流行,临床症状主要为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时导致死亡,对我国的水牛养殖业造成重大的经济损失。尽管本实验室已经对东方巴贝斯虫的形态学、流行病学、生活史、诊断方法以及分子分类学等进行了较为详细的研究,但仍缺乏快速高效、敏感特异、实时定量的检测方法,同时关于东方巴贝斯虫基因组的研究也未有报道。为此,本研究首先建立了东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)技术,并利用该方法对中国湖北地区水牛、梅花鹿和南非比勒陀利亚的绵羊和山羊血液样品的血液原虫进行了鉴定和流行病学调查；随后建立了东方巴贝斯虫环介导恒温扩增(LAMP)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法,并利用这两种方法分别对湖北地区的水牛的东方巴贝斯虫进行了流行病学调查；利用东方巴贝斯虫阳性血清对东方巴贝斯虫cDNA文库进行免疫筛选,克隆和表达了3个免疫相关基因；对东方巴贝斯虫基因组进行了序列测定和初步分析；克隆、注释了东方巴贝斯虫的线粒体基因组,并对该基因组进行了多态性分析。(1)东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)检测方法的建立与应用利用巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA的v4高变区两端的保守区设计一对属特异性引物RLB-F和RLB-R (Gubbels et al.,1999),并根据东方巴贝斯虫(B. orientalis)18S rRNA基因v4高变区设计特异性探针,建立东方巴贝斯虫RLB检测方法,运用建立的方法对采自中国湖北省9个不同地区的304份水牛血液样品进行了检测,结果表明,感染湖北地区水牛的梨形虫有4种,分别是水牛泰勒虫、东方巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫,其阳性率分别是19.1%(58),8.9%(27),1%(3)和0.7%(2)；用RLB检测了采自湖北省的24份梅花鹿血样、南非比勒陀利亚的82份绵羊和244份山羊血样。结果表明,梅花鹿、绵羊和山羊样品都没有任何巴贝斯虫的杂交信号,叁种样品的泰勒虫阳性率分别是29.2%(7/24)、28.0%(23/82)和0.8%(2/244)。多序列比对和系统进化分析表明,可能存在鹿的泰勒虫新种,南非样品结果显示犀牛泰勒虫(T. bicornis)和黑貂泰勒虫未定种(T. sp.sable)探针的特异性探针与分离泰勒虫(T. separata)等羊的泰勒虫的18S rRNA相似度极高,探针的特异性较低,存在交叉反应。(2) B. orientalis环介导恒温扩增(LAMP)检测方法的建立依据东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区,用LAMP引物设计专用软件,设计4条识别目的片度6个特异性位点的引物,建立东方巴贝斯虫LAMP快速诊断方法。特异性试验表明,LAMP仅能扩增东方巴贝斯虫的DNA模板,而与其他的梨形虫DNA无任何特异性扩增。用该方法检测77份长江以南、88份长江以北的水牛血液样品和66份非洲水牛样品。结果表明,南非水牛样品全部阴性,77份长江以南和88份长江以北的样品,LAMP检测的阳性分别是24份和6份,半巢式PCR检测的阳性分别是12份和1份。检测结果表明本研究成功建立了特异性高、敏感性强、快速简便的东方巴贝斯虫LAMP检测方法,流行病学调查和统计分析显示,本试验建立的LAMP方法比此前报道的半巢式PCR更敏感,且东方巴贝斯虫已经从长江以南流行到长江以北。(3) B. orientalis实时定量检测方法的建立利用东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区设计TaqMan实时定量PCR的引物和探针,建立东方巴贝斯虫的实时定量PCR检测方法(TaqMan real-time PCR)。该方法的检测极限是每微升2个虫体,特异性试验表明仅东方巴贝斯虫DNA有特异性的扩增曲线。用实时定量PCR和RLB分别检测180份湖北地区的水牛血液样品。结果表明,两种方法分别检测的阳性样品分别为28份和21份,其中长江以北分别检出16份和12份阳性；阳性样品的染虫率范围是2.0×105～2.0×100,其中有16份的染虫率为2.0×103～2.0×102。试验结果表明所建立的实时定量PCR方法能有效、定量检测东方巴贝斯虫。(4) B. orientalis免疫相关基因的克隆表达利用东方巴贝斯虫阳性血清筛选东方巴贝斯虫cDNA文库,共得到18个阳性克隆子,经EST序列分析,挑选其中的3个可能与免疫相关的基因：B04——核动蛋白基因、B05——假定蛋白基因和B41——热休克蛋白70基因(HSP70),克隆各自的ORF,分别构建原核表达载体pET-32a-B04, pET-28a-B05和pET-32a-B41,在RosettaTM中高效表达,表达产物经纯化后western blot分析,结果表明叁个基因都有良好的抗原性,且证明了HSP70在东方巴贝斯虫中的存在。HSP70基因的核苷酸序列进化分析表明东方巴贝斯虫是一归属于巴贝斯虫的独立新种。(5) B. orientalis基因组测序本试验对东方巴贝斯虫基因组采用的Pair-end双末端测序进行了Solexa测序。共获得23,898,916个读长,测序数据量为2,389,891,600,测序深度约为306.5倍。剔除污染和低质量的读长,组装拼接后共获得1284个Scaffold,总长度为7,796,224bp,GC含量42.4%,与已发表的牛巴贝斯虫T2B株基因组GC含量41.8%相一致。结合本试验分析的结果和已报道的牛巴贝斯虫和小泰勒虫基因组信息,分析东方巴贝斯虫有4条染色体,基因组大小约为7.9 Mb。由于真核生物基因组非常复杂,而且目前所能参考的梨形虫基因组信息相对有限,对东方贝斯虫基因组的具体注释还有待进一步研究。(6) B. orientalis线粒体基因组(mitochondrion DNA, mtDNA)克隆和多态性分析根据基因组测序的高通量序列和cDNA文库钓取的部分mtDNA序列,结合NCBI公布的顶器门血液原虫mtDNA序列,选择其保守区设计引物,克隆东方巴贝斯虫mtDNA并做多态性分析。测序结果用Staden package软件进行拼接,Artemis_v11对东方巴贝斯虫的mtDNA进行注释。结果表明,东方巴贝斯虫mtDNA与已报道的巴贝斯虫和泰勒虫mtDNA相似,也含有3个编码区,即细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ),细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)和细胞色素b (cytochrome b, Cytb),其大小分别为1428bp,687 bp和1092 bp,其中COXⅠ位于正义链,COXⅢ和Cytb均位于反义链上。mtDNA的COXⅠ、Cytb以及COXⅠ和Cytb结合序列的系统进化分析结果表明叁种序列得到的结果与18S rRNA基因和热休克蛋白70(HSP70)基因进化分析的结果一致,即东方巴贝斯虫归属于巴贝斯虫分支。东方巴贝斯虫mtDNA的多态性分析发现其有99个多态性位点。本研究建立的东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)、环介导恒温扩增(LAMP)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法为进行东方巴贝斯虫病的分子流行病学调查以及反刍动物血液原虫新虫种的发现及潜在风险评估等提供了条件；东方巴贝斯虫基因组的测定和初步分析则为深入研究东方巴贝斯虫奠定了基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2011-06-01）
张颖,周艳琴,姚宝安,赵俊龙[8]（2009）在《东方巴贝斯虫线粒体基因的测序与细胞色素b基因的研究》一文中研究指出对东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)的线粒体基因进行克隆和测序及序列拼接,通过与牛巴贝斯虫线粒体基因的比对获得东方巴贝斯虫细胞色素b基因,并以此为基础构建东方巴贝斯虫细胞色素b的系统发育树。应用EST序列分析结果和电子克隆结果,采用PCR技术,扩增东方巴贝斯虫线粒体基因,将获得的序列与pMDl8-T载体相连接,测序后将各个片段利用clustalx软件进行拼接,并结合牛巴贝斯虫线粒体基因进行同源性比对,获得东方巴贝斯虫细胞色素b基因并进一步构建了细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因的系统发育树。结果表明:东方巴贝斯虫线粒体基因与牛巴贝斯虫线粒体基因的同源性高达87%,细胞色素b基因的同源性也达到了89%:根据系统发育树的结果,显示东方巴贝斯虫属于小巴贝斯虫种,与吉氏巴贝斯虫的亲缘关系最为相近。最后鉴定所获得的序列即为东方巴贝斯虫线粒体基因和细胞色素b基因,大小分别为5157bp和714bp。(本文来源于《中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛/肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会论文集》期刊2009-08-14）
张颖,周艳琴,姚宝安,赵俊龙[9]（2009）在《东方巴贝斯虫线粒体基因的测序与细胞色素b基因的研究》一文中研究指出对东方巴贝斯虫(Babbesia orientalis)的线粒体基因进行克隆和测序及序列拼接,通过与牛巴贝斯虫线粒体基因的比对获得东方巴贝斯虫细胞色素b基因,并以此为基础构建东方巴贝斯虫细胞色素b的系统发育树。应用EST序列分析结果和电子克隆结果,采用PCR技术,扩增东方巴贝斯虫线粒体基因,将获得的序列与pMD18-T载体相连接,测序后将各个片段利用clustalx软件进行拼接,并结合牛巴贝斯虫线粒体基因进行同源性比对,获得东方巴贝斯虫细胞色素b基因并进一步构建了细胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因的系统发育树。结果表明:东方巴贝斯虫线粒体基因与牛巴贝斯虫线粒体基因的同源性高达87%,细胞色素b基因的同源性也达到了89%;根据系统发育树的结果,显示东方巴贝斯虫属于小巴贝斯虫种,与吉氏巴贝斯虫的亲缘关系最为相近。最后鉴定所获得的序列即为东方巴贝斯虫线粒体基因和细胞色素b基因,大小分别为5157bp和714bp。(本文来源于《中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集》期刊2009-08-01）
周丹娜[10]（2009）在《东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究》一文中研究指出东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种由镰形扇头蜱传播的重要血液原虫,主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行,临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征,甚至引起死亡,造成重大的经济损失。本实验室已完成了对B.orientalis的形态学、生活史、传播媒介和分子分类学研究,从多种研究角度证实了该虫为一新种,并构建了B.orientalis cDNA文库。本研究以该文库为基础,用制备的B.orientalis单抗和多抗对B.orientalis cDNA文库进行免疫筛选。对筛选得到阳性克隆子进行DNA序列的测定、拼接和分析,并进一步克隆表达单抗所筛得的东方巴贝斯虫蛋白BoP29,对BoP29蛋白进行了west-blotting检测和原位间接免疫荧光定位。利用表达的重组BoP29蛋白构建间接ELISA诊断方法,并初步应用于血清流行病学的调查。(1)B.orientalis单克隆抗体的制备从感染B.orientalis的染虫血中提取东方巴贝斯虫虫体全蛋白。用粗提的东方巴贝斯虫裂殖子全抗原免疫Balb/c小鼠,制备免疫脾细胞,通过常规的细胞融合技术与sp2/0骨髓瘤细胞融合,用东方巴贝斯虫裂殖子抗原(BoMAg)、东方巴贝斯虫体外培养上清(BoECSAg)作为捕获抗原来筛选阳性克隆,最后得到了11株高效价的单克隆杂交瘤细胞系,分别为ⅣC_2A_71G_(10)、ⅣC_2A_72E_2、ⅣC_2A_71F_6、ⅣC_2A7_2G_4、ⅣC_2A_72C_5、ⅣC_2A_72F_(10)、ⅣC_2A_71E_3、ⅣC_2A_72F_2、ⅤC_9C_6A_2、ⅤC_9C_7B_1和ⅤC_9C_6C_(11)。为cDNA文库的免疫筛选奠定基础。(2)B.orientalis cDNA文库的筛选用自制的东方巴贝斯虫单抗和多抗对该虫的cDNA文库进行筛选。得到与单抗ⅤC_9C_6C_(11)对应的东方巴贝斯虫BoP-29蛋白的基因序列和与多抗发生免疫反应的8个东方巴贝斯虫蛋白的基因序列:ms-7-1,ms-37-1,ms-59-1,ms-70-2,ms-88-2,ms-99-1,ms-110-1和ms-128-1。经过测序比对和蛋白预测,显示单抗筛得的BoP29蛋白约为29 kDa,DNAstar预测该蛋白的等电点为9.68,有很好的抗原性;多抗筛得8个蛋白中ms-7-1、ms-37-1、ms-59-1、ms-99-1和ms-110-1与牛巴贝斯虫的某些已公布的蛋白有较高的同原性,ms-88-2克隆子与布氏锥虫假定蛋白Tb10.70.1650有34%的同原性,ms-70-2和ms-128-1在同源比对中没有任何相关信息,可能是东方巴贝斯虫特有的新蛋白,其结构功能还待进一步研究。(3)BoP-29蛋白的克隆表达根据EST测序的结果,设计一对特异性扩增B.orientalis BoP29基因开放性读码框(ORF)的引物,克隆了B.orientalis BoP29的ORF全长基因,构建原核表达质粒pGEX-KG-BoP29和pET-28(a)-BoP29,在E.coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达。(4)BoP-29蛋白的定位与免疫原性的初步研究将重组BoP29的表达产物经Western-blot检测分析,结果表明原核表达的BoP29具有较强的免疫反应原性。将染虫率为1%的新鲜牛血制成血推片,固定后,用单抗ⅤC_9 C_6C_(11)做为一抗,羊抗鼠IgG-FICT抗体做为二抗来完成间接免疫荧光实验,并再用吖啶橙染核。将制好的血液推片置于荧光显微镜下观察,可见染虫红细胞中的虫体核部发橙色荧光和与单抗结合发出绿色荧光的虫体膜表面。再次证实BoP-29确实来源于东方巴贝斯虫。(5)His-BoP-29间接ELISA诊断方法的构建和应用将重组的His-BoP29蛋白按倍比稀释的方法包被ELISA板,测定其最佳包被浓度。用参考阳性血清和参考阴性血清确定His-BoP-29间接ELISA的临界值为0.25,有良好的敏感性和特异性。用该间接ELISA方法完成了对感染牛血清中抗体水平的监测,并检测了来自武汉、湖北大冶、湖北嘉渔和湖北鞍山临床血清样本共132份,共检出阳性39份,总检出率为29.5%,而用本实验室已构建好的东方巴贝斯虫巢式PCR检测结果(33.3%)无显着差异。本研究以B.orientalis的cDNA文库为基础,利用制备的东方巴贝斯虫的单抗和多抗血清筛选文库,获得9个巴贝斯虫相关蛋白的基因序列,为水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。对单抗筛得的BoP29蛋白的基因完成了克隆表达定位,证实了BoP29蛋白确实存在于东方巴贝斯虫中,且有良好的免疫反应原性。随后,利用重组BoP29蛋白构建ELISA检测方法,为巢式PCR检测方法提供了有力的补充,对水牛巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查,进而对该病的防治具有重要意义。(本文来源于《华中农业大学》期刊2009-05-01）
东方巴贝斯虫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是牛的巴贝斯虫病中比较特殊的一个血液原虫虫种,其仅感染水牛的红细胞,由镰形扇头蜱经卵传播。在我国长江以南多省份均有流行,患病动物常出现黄疸、高热、贫血和血红蛋白尿等症状,严重时甚至死亡,对我国的水牛养殖业造成巨大的经济损失。现阶段对于东方巴贝斯虫的基因组信息所知有限,入侵相关机制的研究也鲜有报道。基于此,本研究一方面克隆并注释了东方巴贝斯虫的顶质体基因组DNA序列,并对其总体的结构特征进行了详细的比对分析;另一方面,钓取了东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因信息,对RON2与AMA1的相互作用进行了初步研究。(1)B.orientalis顶质体基因组的测序分析对于顶质体基因组,根据基因组测序的高通量测序序列和cDNA文库钓取的部分顶质体DNA序列,结合NCBI公布的顶复门血液原虫顶质体DNA序列,选择其保守区设计引物,克隆东方巴贝斯虫顶质体DNA全长。测序结果用软件进行拼接,Artemis做注释。结果表明,东方巴贝斯虫顶质体基因组全长33200bp的环状分子,AT含量在78.9%,包含1个核糖体大亚基(LSU)、1个核糖体小亚基(SSU),38个编码蛋白的开放读码框以及24个转运RNA(tRNA)。其中38个ORF包括4个DNA依赖的RNA合成酶小亚基(rpoB、rpoC1、rpoC2a、rpoC2b)、17个核糖体蛋白、1个翻译延长因子(tufA)、2个Clp分子伴侣基因以及14个大小功能未知的假定蛋白。进一步对所获得的东方巴贝斯虫顶质体基因组DNA与NCBI上有报道的相关顶复门寄生虫作了详细的比对分析,综合的结果表明东方巴贝斯虫顶质体基因组从基因组大小,基因种类,基因结构,基因排列顺序,基因进化分析等一系列特征上都与牛巴贝斯虫的顶质体最为接近。(2)棒状体颈部蛋白RON2和AMA1基因的相互作用根据NCBI上公布的顶复门寄生虫的RON2序列及部分假定蛋白序列和东方巴贝斯虫基因组测序获得的部分序列,设计引物克隆东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因,获得的测序结果全长为4035bp,本研究选取了RON2与AMA1有相互作用的功能域进行截短表达,分别设计特异性引物克隆BoRON2-2、BoRON2-5,构建GST标签原核表达质粒pGEX-KG-RON2-2、pGEX-KG-RON2-5,高效表达。用纯化后的RON2-2、RON2-5重组蛋白进行Far-western实验,以及和AMA1蛋白的粘附ELISA实验。结果表明,重组表达的RON2-2及RON2-5与东方巴贝斯虫全虫抗原中的AMA1之间存在相互作用,并且二者之间的相互作用以一定的比例进行粘附。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
东方巴贝斯虫论文参考文献
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