史建国[1]2003年在《嗅鞘细胞生物学特性研究及其移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察》文中研究说明因创伤所致急性SCI的发病率目前呈逐年上升趋势，严重的SCI所致的截瘫和四肢瘫不仅使患者本人及其家庭产生巨大痛苦，而且带来许多严重的社会问题。因此，损伤后脊髓再生和功能重建一直是医学界和社会密切关注的重要问题。近年研究证实，组织或细胞移植可替代受损变性的神经元，或者改善神经损伤的微环境，引导和挖掘受损神经或变性神经再生的潜能，从而达到修复治疗神经损伤的目的。其中OECs是一种可以明显促进神经再生的移植细胞，修复效果较为理想，然而OECs移植对SCI的修复作用研究较少，且作用机制尚不清楚，缺少远期效果的实验观察。本研究旨在通过体外培养OECs的生物学特性研究，观测体外OECs与脊髓神经元嵌套联合培养过程中,OECs对脊髓神经元的存活和突起生长的影响及其可能的机制；并探索研究体内神经细胞相互作用的理想的体外模型。此外，通过纯化培养OECs异体移植修复急性SCI实验研究，观察移植OECs对急性SCI神经纤维再生及功能恢复的远期效果；并探讨其作用方式与途径。一、 体外培养OECs的生物学特性研究采用新生Wistar大鼠OECs及同种胎鼠脊髓神经元的原代纯化培养及其嵌套联合培养方法，并通过培养细胞生长曲线绘制、GFAP及P75免疫细胞化学双染、抗神经丝NF-200免疫细胞化学染色、脊髓神经元存活指数与突起长度测量、OECs纯化培养液蛋白质电泳观测进行的体外培养OECs生物学特性研究所得实验结果如下：1、 体外原代纯化培养嗅鞘细胞及脊髓神经元的形态变化、生长特点及其鉴定OECs于24小时内完全贴壁；培养第4天，细胞体呈典型的双极或叁极，突起较长；培养第10天，细胞融合成片，胞体仍呈典型的双极或叁极，突起进一步加长。脊髓神经元在24小时内完全贴壁，且聚集成簇；各簇细胞大多数呈圆形，立体感较强；每簇细胞数不等，突起向周围长出，相临细胞簇之间无纤维相连。培养第6天，各簇神经元胞体增大，形态各异，突起不断伸长，其分支相互交叉呈网络状。原代纯化培养OECs时，细胞数量略有减少；培养第2天，细胞数逐渐快速增加，培养至第6天时其增长速度减缓。原代纯化培养OECs的 GFAP和P75免疫组织化学双染均呈双阳性，其纯度达90%以上。2、OECs对脊髓神经元存活指数和突起生长的影响 OECs与脊髓神经元联合培养第6天，其脊髓神经元形态规则，数目较多；而同期单纯培养脊髓神经元形态不一，数目较少，突起断裂。联合培养脊髓神经元存活指数高于同期单纯培养脊髓神经元的存活指数，两组比较有统计学差异（P〈0.05）。联合培养第24小时，脊髓神经元平均总突起长度和平均最长突起长度均明显高于同期单纯脊髓神经元培养组，两组比较有统计学显着差异( P<0.01 )。3、OECs纯化培养液蛋白质检测结果 OECs纯化培养液SDS-PAGE电泳后，可见多条蛋白电泳条带；其中分子量17-33Kd之间可见2条蛋白电泳条带，分子量48Kd以上可见多条条蛋白电泳条带。上述结果表明，体外原代纯化培养的OECs及脊髓神经元具有其特有的形态变化、生长特点。体外OECs与脊髓神经元嵌套联合培养过程中,OECs对脊髓神经元的存活和突起生长具有明显的促进作用；这种促进作用可能是通过OECs所分泌的神经营养因子和细胞黏附因子等实现的；细胞-细胞嵌套联合培养是研究体内神经细胞相互作用的理想的体外模型。二、嗅鞘细胞异体移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察在进行体外培养OECs生物学特性研究的基础上，以恢复截瘫大鼠的神经功能为出发点，选用大鼠脊髓完全损伤模型，实验分OECs移植组、DMEM注射组及Sham组，通<WP=8>过术后动物体重变化、EP检测、BBB神经功能评分、FG逆行示踪、组织病理学与超微结构观察，分析和评价纯化培养OECs异体移植对急性SCI修复作用的实验结果如下：1、 移植OECs在受体内的存活与迁移术后24周，于OECs移植组细胞注射位点及其邻近区域均可见较多圆形荧光物质，即Hoechst标记的存活OECs。2、 纯化培养OECs移植对急性SCI功能恢复的有限促进作用术后OECs移植组与DMEM注射组动物均出现体重减轻，术后4周降至最低；此后，OECs移植组动物体重逐渐增加，而DMEM注射组动物体重增加不明显；术后24周，OECs移植组动物体重与DMEM注射组比较有统计学差异（P<O.05）；观察期内两组动物均未恢复到术前重量。术后5周内，OECs移植组与DMEM注射组动物BBB评分均为0分；术后第6周， OECs移植组动物BBB评分分值逐渐增加（与DMEM注射组比较有显着差异，P＜0.01），16周以后BBB评分分值无明显增加（P>0.05）。术后12周时，OECs移植组动物可引出运动EP，而DMEM注射组动物未引出运动EP；术后 24周，OECs移植组与DMEM注射组动物均可引出运动EP，而其P1潜伏期与脊髓损伤前及同期Sham组比较均仍明显延长(P值均〈0.01)。3、 纯化培养OECs移植对急性SCI神经纤维再生的促进作用脊髓损伤区组织纵切面的HE染色观察可见，OECs移植组细胞数目较多，组织结构紊乱，基质纤维扭曲；DMEM注射组细胞数目较少，组织结构紊乱，纤维含量少且扭曲，可见大小不等的空洞形成。神经细胞FG逆行示踪标记镜下观察可见，脊髓示踪剂注射点内及附近组织充满呈金黄色荧光的FG
陆政峰[2]2010年在《人参皂甙Rg1强化嗅鞘细胞生物学行为的实验研究》文中研究表明目的:1、建立一种经济实用、易重复、细胞培养周期短、产量大的嗅鞘细胞培养、纯化方法。2、研究人参皂甙Rg1对嗅鞘细胞(OECs)增殖及相关神经营养因子(NTFs)表达、分泌等生物学行为的影响,寻找OECs有临床应用前景的调节因子。为OECs移植修复脊髓损伤更好解决种子细胞的来源和生物学活力问题。方法:1、剪切吹打分散法接种嗅鞘细胞及叁步顺序法纯化培养:从成年SD大鼠解剖分离嗅球,显微镜下剥离软脑膜、剔除中央白质,将灰质成分置于含10%胎牛血清的DMEM/F12全培养基,眼科剪剪切至组织成糜状,吸管吹打15-20次,混悬液免胰酶消化直接接种培养,每叁天半量换液。原代培养至细胞大部分融合后,依次以低浓度胰酶(0.05%)有限消化法、30min短时差速贴壁法、抗有丝分裂法叁步顺序纯化细胞,每步纯化结果作共聚焦免疫荧光染色鉴定。2、研究Rg1对嗅鞘细胞增殖的影响MTT法:OECs鉴定纯化后分组, Rg1以浓度梯度0(空白对照)、10、20、40、80μg/ml分别干预细胞24 h、48 h、72 h、96 h,MTT染色OD值绘制生长趋势图,得出Rg1对OECs作用的最适浓度和最适作用时间的结论,并作为以下所有实验步骤的基础,以此策略干预细胞;Brdu测24 h细胞增殖率:细胞分叁组,空白对照组,Rg1组,Forskolin阳性参照组,BrdU免疫荧光染色法测细胞增殖率。3、研究Rg1对OECs相关NTFs表达和分泌的影响RT-PCR:细胞纯化鉴定后分两组,一组对照,一组Rg1的最适浓度和时间干预,通过RT-PCR电泳条带对比亮度法分析Rg1对OECs胶质源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor ,GDNF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor ,BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor ,NGF)mRNA表达的影响; ELISA试剂盒:分别测上述两组细胞培养上清内GDNF、BDNF、NGF的含量,并作统计学分析。结果:1、细胞取材接种过程较传统方法大大简化,由60-90 min多步骤过程简化为8-10 min一步完成,原代培养中嗅鞘细胞快速贴壁成为优势细胞、生长旺盛,叁步顺序纯化过程细胞纯度逐步提高,以最小代价、最少细胞损耗获得纯度提升,最终鉴定纯度可达95%以上并长时间维持。2、Rg1促进嗅鞘细胞增殖,获得峰值效应;24 h增殖率:空白对照组9%,Rg1组17%,差异有统计学意义(P<0.05);Forskolin组20%,同Rg1组差异无统计学意义(P>0.05)。3、RT-RCR分析显示Rg1干预组细胞GDNF、BDNF、NGF的mRNA较对照组表达显着上调,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法测Rg1组培养上清GDNF、BDNF、NGF分泌量较对照组显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、免消化剪切吹打分散法接种OECs及其叁步顺序法纯化培养方法经济实用、易重复,细胞培养周期短,革新了传统培养纯化方法,能收获大量可控纯度的嗅鞘细胞供进一步移植实验及基础研究。2、Rg1促进OECs增殖及其GDNF、BDNF、NGF叁种关键NTFs的mRNA表达上调、分泌增加,因而正调节OECs的生物学行为。3、本研究更好地解决了OECs的来源和生物学活性问题,为脊髓损伤的细胞移植治疗提供更多更好的种子细胞。
王干[3]2010年在《应用组织工程学方法修复脊髓损伤基本问题的研究》文中进行了进一步梳理脊髓损伤的治疗是临床上的难题,也是神经科学领域研究的热点。本文根据组织工程学的基本原理,选取具有应用前景的种子细胞和支架材料,从体外到体内对修复脊髓损伤的基本问题进行了研究,主要研究内容与结果如下:(1)从成年大鼠的嗅球提取嗅鞘细胞,经过一系列纯化步骤得到可供移植的高纯度嗅鞘细胞,进行免疫荧光鉴定。从孕12天的胎鼠大脑皮层提取神经干细胞,免疫荧光鉴定表明无论是单细胞还是神经球都高度表达其标志性蛋白巢蛋白(nestin)。在含有10%胎牛血清的培养基中单独培养神经干细胞5天发现绝大多数的神经干细胞都分化成了星形胶质细胞,而共培养嗅鞘细胞和神经干细胞的结果表明嗅鞘细胞的存在能够促进神经干细胞向神经元分化。(2)建立脊髓损伤模型,在成年大鼠胸髓第九节处(T9)进行3/4横切。手术后一周,四组脊髓损伤的大鼠分别注射DMEM/F12培养基、嗅鞘细胞、神经干细胞和两种细胞共混物。功能学恢复评价结果表明共移植组的BBB评分明显高于其他叁组,免疫组织化学染色和组织学观察的结果都表明有新生神经纤维通过损伤区。共移植嗅鞘细胞和神经干细胞能够同时促进神经再生和改善运动功能恢复。共移植的效果要好于单独移植嗅鞘细胞或者神经干细胞。(3)分别制备了壳聚糖膜、多孔支架材料和多微通道导管,研究了神经干细胞在叁种材料上分化和增殖的结果。在含有10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞在壳聚糖膜上绝大部分都分化成了星形胶质细胞,而在壳聚糖多微通道导管中分化成神经元的比例有明显增加。在含有碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基中,神经干细胞在壳聚糖膜上表现出了最好的增殖结果,在多微通道导管上有适度的增殖,而在多孔支架材料上增殖最少。以上结果表明,壳聚糖的拓扑学结构对于调控神经干细胞分化和增殖起着重要作用。(4)制备了壳聚糖—海藻酸钠水凝胶作为嗅鞘细胞和神经干细胞的载体。体外表征结果表明壳聚糖—海藻酸钠水凝胶是通过壳聚糖上带正电的氨基基团和海藻酸钠上带负电的羧基基团之间相互作用构建而成。两种细胞在壳聚糖—海藻酸钠水凝胶上都表现出较好的增殖结果,表明了此水凝胶在神经组织工程中具有良好的应用前景。
李云[4]2010年在《NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究》文中进行了进一步梳理【目的】探讨NSC和OEC联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用,并探讨其作用机制。【方法】采用细胞培养、免疫组织化学、TUNEL法、蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应等技术,结合动物行为学观察(BBB评分及运动诱发电位检测),研究全横断脊髓损伤及NSC和OEC联合移植后,损伤大鼠运动功能的变化、大脑皮质运动区神经元的存活与凋亡、相关凋亡基因表达变化及其信号转导分子的调节。【结果】1.T_9全横断脊髓损伤后,大鼠后肢运动功能完全丧失,随时间延长,有一定的(甚至无)自发性恢复,但此种自发性恢复能力非常有限。在脊髓全横断损伤后的1～4周的各个时间点,手术组大鼠BBB评分明显低于假手术组(P＜0.001)。术后4周,手术组80%的大鼠未检测到MEP,20%的大鼠检测到波幅极低的MEP波形;假手术组MEP检出率为100%,波幅、潜伏期正常。细胞凋亡TUNEL检测显示:术后2周,手术组大脑皮质V层TUNEL阳性细胞数较假手术组增多(P＜0.05)。免疫组化结果表明:术后4周,手术组大脑皮质V层NeuN阳性细胞数较假手术组减少(P＜0.05);同时,手术组Bax和Caspase-3的阳性细胞数较假手术组明显增多(P＜0.05),而Bcl-2两组相比无统计学差异(P＞0.05)。RT-PCR结果显示:大脑皮质运动区Bax的表达在手术组各时间点与假手术组比较均无差异(P＞0.05);而Bcl-2的表达术后14天和28天较假手术组明显减少(P＜0.05);Caspase-3则在术后3天较假手术组表达高(P＜0.05),其他时间点接近假手术组水平。2.从细胞移植术后第3周末开始,NSC和OEC联合移植组大鼠后肢运动功能的恢复明显优于单纯全横断组(P＜0.05);叁个细胞移植组大鼠的BBB评分在整个恢复过程中均有明显的提高,其中NSC和OEC联合移植组的BBB分值在第3周末高于NSC移植组和OEC移植组,在第4周末高于NSC移植组(P＜0.05);NSC移植组和OEC移植组的BBB评分在移植术后第4周末高于单纯全横断组(P＜0.05)。细胞移植术后4周,各细胞移植组均有不同程度的MEP波幅,但均明显低于假手术组(P＜0.01);NSC和OEC联合移植组的所有受试动物均检测到MEP波形,检出率达100%,NSC和OEC单独移植组MEP检出率均为50%。细胞移植后2周,假手术组和各细胞移植组大鼠大脑皮质V层TUNEL阳性染色细胞较单纯全横断手术组少(P＜0.05);联合移植组较OEC移植组细胞凋亡数少(P＜0.05)。细胞移植术后4周,免疫组化结果显示:尽管全横断损伤组、NSC和OEC单独移植组的NeuN阳性细胞数较假手术组明显减少(P＜0.05),而NSC和OEC联合移植组与假手术组相比却无明显差异(P＞0.05),说明细胞联合移植可减轻皮质运动神经元的凋亡。结果还发现:联合移植组大脑皮质V层抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数较各对照组多(P＜0.05);而联合或单细胞移植组促凋亡基因Bax阳性细胞数均较手术组减少(P＜0.05);Caspase-3阳性细胞数仅联合移植组和OEC移植组较手术组减少,且联合移植组较两种细胞单一移植组减少明显(P＜0.05)。RT-PCR检测发现:NSC和OEC联合移植后3天,Bax mRNA的表达较NSC移植组增多,但较OEC移植组降低(P＜0.05);而在联合移植后14天和21天,Bcl-2的表达较OEC移植组增高(P＜0.05);Caspase-3的表达在移植后3天和7天较手术组表达降低(P＜0.05),移植后14天,较NSC移植组表达降低(P＜0.05)。3.信号通路分子RT-PCR检测显示:细胞移植术后3天,联合移植组、OEC移植组和手术组大脑皮质运动区PKB mRNA的表达均明显高于NSC移植组(P＜0.05),手术组还较假手术组表达高(P＜0.05);而术后14天,NSC移植组PKB mRNA的表达明显回升且显着高于OEC移植组(P＜0.05);移植术后21天,NSC和OEC联合移植组PKB mRNA的表达较NSC移植组和OEC移植组高(P＜0.05),其中,OEC移植组还低于手术组和假手术组(P＜0.05)。术后7天和28天,各组比较无差异(P＞0.05)。比较之,单独和联合移植术后ERK1mRNA的表达在各时间点均较假手术组和手术组明显减低(P＜0.01);且术后3天,NSC移植组高于OEC移植组和联合移植组(P＜0.01)。Stat-3 mRNA的表达则表现为细胞移植术后3天,联合移植组和OEC移植组较假手术组及手术组表达高(P＜0.05);移植术后14天手术组较假手术组降低(P＜0.05),而各细胞移植组均较手术组明显升高(P＜0.05);在细胞移植术后21天,各细胞移植组Stat-3的表达均较假手术组降低(P＜0.05);而在移植术后28天,NSC移植组Star-3较假手术组和联合移植组表达增高(P＜0.05)。进而,Western-blot检测结果发现:移植术后14天,联合移植组Akt非磷酸化蛋白、ERK1/2磷酸化蛋白的表达均比手术组和假手术组高,且Akt非磷酸化蛋白在NSC移植组比手术组表达高(P＜0.05)。联合移植组非磷酸化Stat-3的表达较假手术组、手术组、NSC移植组表达高(P＜0.05);Akt磷酸化蛋白、Stat-3磷酸化蛋白和ERK1/2非磷酸化蛋白的表达各组间比较均无差异(P＞0.05)。4.体外共培养显示:NSC和OEC共培养7天,联合培养组NeuN阳性细胞数较NSC单独培养组多(P＜0.05),而未分化的Nestin阳性细胞较单独培养组低(P＜0.05);GFAP和APC阳性细胞分化率两组比较无差异(P＞0.05)。提示OEC可能促进NSC向神经细胞分化。【结论】1.脊髓全横断损伤后可能有部分自主运动功能恢复,但非常有限,需要寻找有效的治疗措施;脊髓全横断损伤引发大脑皮质运动区神经元凋亡基因表达失控,进而导致细胞凋亡,因此,脊髓损伤的研究必须考虑到脊髓自身以外的损害,特别是大脑皮质。2.NSC和OEC作为两种有用的“种子”细胞,其单独和联合移植能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能部分恢复,且联合移植优于单细胞移植。3.NSC和OEC联合移植发挥作用的机制可能涉及:①OEC能促进NSC的增殖和向神经元分化;②减少大脑皮质运动区神经元凋亡;③促进抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白质表达;④调节ERK1/2信号转导通路。
刘宁[5]2013年在《嗅鞘细胞移植治疗大鼠马尾神经压迫损伤的初步研究》文中提出背景终丝及脊髓圆锥以下的神经根构成了马尾神经(cauda equina，CE)，其主要功能包括传导会阴部、马鞍区的感觉，控制大小、便功能及踝、膝或球海绵体反射，一旦损伤，患者可以出现下腰痛、坐骨神经痛以及鞍区感觉减退或缺失、排便障碍及性更能障碍等为主要表现的临床症候群。Mixter等在1934年首次报道，并将其命名为马尾神经综合征(cauda equina syndrome，CES)。大部分腰椎退变、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出患者都可以先尝试保守治疗，如果症状未见缓解或继续加重而出现不可耐受的根性痛或运动、感觉功能障碍后，才会进行择期手术治疗，而且大部分患者术后恢复令人满意。而CES却不同，一旦发病，要求进行急诊手术，否则一旦出现神经功能损伤，很难完全恢复。目前马尾神经综合征的发病机制尚不完全清楚，可能是由于神经受到机械性压迫、炎症、静脉充血或缺血等原因导致病变。由于手术减压后病人的症状改善并不确定，因此进一步研究马尾神经损伤的机制及非手术治疗方法显得非常必要。近年来，嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）移植被认为是治疗神经系统修复过程的最有前景的方法之一。嗅鞘细胞位于嗅觉系统，是一类独特的神经胶质细胞。它同时存在于外周和中枢神经系统，并兼具雪旺细胞和星型胶质细胞的特点。在生理状态下，嗅神经因与外界接触而易受损伤，因此其终身都在进行更新，在整个过程中，嗅鞘细胞始终包绕着嗅神经轴突，形成神经束，引从嗅上皮（olfactoryepithelium，OE）新生的轴突长入位于中枢的嗅球（olfactory bulb，OB）。嗅鞘细胞具有促进嗅神经轴突生长及再生的能力，同时也具有引导其生长的能力，这一特征被成功地应用于脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）的治疗。大量研究表明，移植到中枢神经损伤处的嗅鞘细胞能形成引导神经突起生长通道，再生的神经轴突可以沿着这一通道向远处延伸，使中枢神经损伤得以修复。移植神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞可明显促进全脊髓横断大鼠皮质脊髓束再生。但目前未见移植嗅鞘细胞治疗马尾神经损伤的相关报道。早期的研究表明马尾神经损害导致背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）内神经元坏死和脊髓后角细胞坏死，采用脑源性神经生长因子（Basic fibroblast growthfactor，BDNF）能够促进轻、中度损害的马尾神经功能恢复，但对于重度损伤的情况效果不理想。嗅鞘细胞的移植是否能够促进马尾神经功能恢复，是否对不同程度损害的马尾神经功能恢复都有改善作用以及嗅鞘细胞移植入体内后是否能达到功能性整合，使损伤的神经结构重建，实现损伤髓鞘的髓鞘化，有待于进一步研究。研究目的通过硅胶条压迫法建立大鼠马尾神经压迫损伤模型。通过显微注射的细胞移植方法向硬膜囊内注射OECs，将其移植到压迫损伤部位的马尾神经表面，明确OECs移植后在局部的存活时间及大鼠马尾神经MBP表达量及神经功能改变情况。研究方法一、采用硅胶条压迫法成功构建椎管狭窄的大鼠马尾神经压迫模型。将SD大鼠的腰4节段咬除椎板上缘，暴露硬膜囊，将10mm×0.8mm×1.0mm的硅胶条置入大鼠L4和L5椎管内，压迫7天，通过BBB评分、甩尾痛觉检测实验，以及免疫组化染色对损伤情况评估。二、原代OECs的培养。取SD大鼠OB嗅神经层OECs进行原代细胞培养，通过差速贴壁及Thy1.1抗体进行细胞纯化，通过OECs特异性标记物p75NTR及S100的抗体标记体外培养的原代OECs，鉴定细胞纯度。叁、OECs移植。取GFP转基因大鼠OB进行OECs培养及纯化。取符合条件的SD大鼠造模，筛选造模成功的大鼠，进行手术减压去除压迫硅胶条后硬膜囊内注射8μlGFP-OECs PBS悬液（浓度约1×105/μl），对照组则注射等量的PBS溶液。四、GFP-OECs移植后在不同时间点取细胞移植部位CE制成细胞悬液进行流式细胞检测，观察样本GFP荧光强度。五、细胞移植后在不同时间点提取各组压迫损伤部位的马尾神经组织总蛋白，通过Western blot观察MBP表达水平的变化。六、细胞移植后在不同时间点进行BBB评分和甩尾实验观察手术减压及细胞移植后马尾神经压迫损伤大鼠的功能变化。结果一、硅胶条压迫大鼠马尾神经7天后，大鼠BBB评分逐渐稳定在11分左右，甩尾潜伏期由损伤前的4-6s逐渐延长至12s左右，MBP免疫组化显示大鼠马尾神经出现脱髓鞘表现。通过硅胶条压迫法可以构建稳定的大鼠马尾神经压迫损伤模型。二、所培养的原代OECs纯度达到95%以上，该纯度能够满足后续实验需要。叁、OECs移植后2周时，样本的GFP荧光强度高于野生型SD大鼠CE细胞悬液，2周后损伤局部组织的细胞悬液GFP荧光与非转基因大鼠的本底荧光强度无明显差异，说明外源性OECs可在损伤局部存活约2周时间。四、OECs移植后MBP的表达水平在移植后的1天、3天没有显着变化，而在移植后的2-3周MBP蛋白表达水平与对照组相比有提高，4周后蛋白表达水平趋于稳定，提示OECs移植有助于成年大鼠马尾神经损伤后的再髓鞘化。五、OECs移植后BBB评分结果和甩尾实验结果表明，所有大鼠在减压、硬膜囊内注射术后后肢功能逐渐得到一定程度的改善，但是细胞移植组功能恢复并未优于假移植组，提示这些功能恢复是由于手术解除马尾神经压迫后大鼠自身恢复所致。结论OB-OECs可以通过硬膜囊内注射的方法进行移植，并可在损伤局部聚集至少2周的时间。移植组动物的MBP表达量在2-3周时高于对照组，说明，OECs移植后可能通过细胞间的相互作用，如分泌神经营养因子、激活SCs、清除坏死组织等作用而保护脱髓鞘的马尾神经，使其在后续的再髓鞘化过程中更快的恢复。但是硬膜囊内直接注射OECs在4周的时间内并未使实验动物获得明显的功能改善。因此，在OECs移植的具体方法，如注射的细胞量、细胞悬液的介质等方面仍需进一步研究，从而使OECs在马尾神经损伤修复中发挥更多的生物学效应。
任继鑫[6]2002年在《嗅鞘细胞移植促进急性脊髓损伤再生的实验研究》文中研究指明大量实验证明嗅鞘细胞（OEG）移植能促进脊髓损伤神经纤维的再生。OEG促进脊髓再生的作用是通过在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘和分泌一些促进脊髓损伤再生的因子而实现的。以前实验主要是研究OEG对脊髓横断、半切和电极致伤的促进作用，而研究OEG对临床常见的脊髓挫伤的修复作用研究较少。因为单纯挫伤可能有神经纤维的残留，其神经恢复无法区别是否为OEG的作用，所以在脊髓损伤区做横切，这样可保证神经纤维全部断裂。目的：研究OEG无血清培养下的生长特性和OEG移植后在体内存活情况，以及对大鼠脊髓挫伤加横断伤的修复作用。方法：1.细胞培养：新生Wistar大鼠嗅球（OB）做OEG原代培养，然后利用无血清培养基添加一些促进生长的微量物质做纯化培养，为OEG提供了合适的生长环境而大量增殖。由于神经元依赖血清生长而被去除，而使细胞成分相对单一化。利用中枢神经系统中仅有OEG细胞表现为神经胶质元纤维酸性蛋白（GFAP）和低亲和力神经生长因子受体（P75或L-NGFR）免疫染色双阳性的特性，鉴定OEG。2.动物实验：四月龄Wistar大鼠，体重240-260g。用NYU脊髓打击器以250gmm能量打击T9-10段脊髓，致脊髓挫伤，在挫伤区中间横行完全切断脊髓，A组（20只）在损伤远近端注射Hoechst标记的OEG，B组（20只）在相同位置注射DMEM培养液。C组（10只）单纯做T9-10节段的椎板减压。术后观察动物脊髓功能恢复情况, 每两周测定一次后肢运动功能（BBB评分法），共12周。术后叁个月取损伤段及其临近脊髓标本，做HE染色、嗜银染色和抗NF免疫组化染色，同时荧光显微镜下观察Hoechst标记的OEG在体内存活情况。结果：1.通过无血清纯化培养，OEG增殖迅速，原代培养9天，细胞数目可达16倍以上，纯<WP=9>度可达85%。2.手术后4周开始有运动功能恢复，A组运动功能好于B组。在各个时间段BBB运动功能得分A组均高于B组。比较12周时两组BBB得分，差异明显（P(0.001）。3. A、B组都有神经纤维进入损伤区，排列紊乱数量不等。在损伤近端,神经纤维数量A组多于B组（P(0.001），但都少于相应节段的C组（P(0.001）。4.A组损伤远端神经纤维数量比损伤近端少（P(0.001），而B组损伤远端几乎没有神经纤维。5.荧光显微镜下观察到Hoechst标记的OEG大量存在于脊髓损伤段周围，最远可到距离损伤区边缘2cm处。6.统计学分析表明，脊髓损伤再生神经纤维的数量与运动功能恢复之间存在正相关（r=0.9816）。结论：1. 无血清纯化培养法是一种相对简单易行、费用低廉，增殖迅速，可获得较高纯度OEG的培养方法。2. OEG植入体内可以长时间存活，并有自我迁移能力。3. OEG移植具有明显促进脊髓挫伤加横断伤神经纤维再生和功能恢复的作用。
吴军[7]2005年在《NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤再生的研究》文中研究指明目的:脊髓损伤是常见疾患,造成许多病人肢体功能的障碍。嗅鞘细胞(OEG)兼有雪旺氏细胞与星形胶质细胞的双重功能特点,它能伴从PNS进入CNS而不同于雪旺氏细胞仅局限于PNS中,克服雪旺氏细胞与成纤维细胞在脊髓移植中功能的不足;嗅鞘细胞能在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘,保护其不受局部抑制因子的影响;嗅鞘细胞尚可分泌多种神经生长因子。OEG移植治疗脊髓损伤的具有良好的前景。但由于OEG本身表达神经营养因子的水平较低,尚不能满足轴突再生的需要,实验中在损伤稍远处观察到再生轴突的数量仍较少。NT-3是NTs家族众多的成员中最有效的一种,其对轴突再生的促进效果优于NGF和BDNF。但由于外源性神经营养因子不能通过血脑屏障,半衰期短,临床应用上尚缺乏安全有效的给药途径。本研究的目的是将携带NT-3基因的真核表达载体,通过非病毒转染途径转入OEG中,再将转染后OEG移植到脊髓损伤大鼠体内,以期促进大鼠胸脊髓损伤的恢复。 方法:将我室自形构建的质粒pEGFP-NT3,应用脂质体介导的方法将其导入体外培养的嗅鞘细胞,将其移植入急性脊髓损伤大鼠体内,连续观察12周时间,与接受单纯OEG、空白质粒转染OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较。 结果:转染后OEG体外可检测到NT3mRNA的表达量的增加,细胞裂解液可检测到NT-3蛋白的表达,同时,此上清对脊神经节细胞的存活与突起生长具促进作用。移植转染后OEG能在体内长期存活,表达NT-3基因,并较对照组更能
冯林杰[8]2008年在《骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤及其体外向神经细胞诱导分化的实验研究》文中研究表明脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重威胁人类生命和健康的常见疾病。近年来,由交通事故、高处坠落和运动损伤等因素导致的SCI患者数量日渐增多,多发生于青壮年人群中。大部分患者因SCI而导致身体的终生残疾,给社会和家庭带来沉重的经济负担。目前人类还没有找到针对SCI治疗的行之有效的方法,现阶段在临床上常用的方法是在损伤后早期静脉使用甲基强的松龙和外科手术治疗,但是治疗效果不佳。因此,寻找针对SCI有效的治疗方法,确实能够在SCI后可以有效的减轻患者脊髓损伤程度,甚至促进损伤神经轴突的再生,重建脊髓的功能,一直是神经科学领域的研究热点。近年来随着组织工程技术研究的兴起和对SCI后的病理改变、机理认识不断深入的基础上,科学家们提出采用组织工程技术治疗脊髓损伤的思路,为脊髓损伤后的救治提供了新的方法。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)是骨髓造血系统中的非造血干细胞,具有容易获取、体外增殖快和具有多向分化潜能的特点,成为组织工程研究领域的种子细胞之一。本实验研究包括:1.在成年大鼠脊髓损伤区内移植BMSCs,观察BMSCs对脊髓损伤区神经纤维的保护和再生修复促进作用。2.体外观察嗅鞘细胞条件培养液对BMSCs的诱导分化作用。实验一BMSCs在骨髓造血过程中为血细胞的生成和分化提供适宜的微环境。研究表明BMSCs在体外培养过程中,具有很强的增殖能力和多向分化潜能,在体外特定的诱导条件下不仅可以分化为骨、软骨和韧带等多种细胞,也可以向神经系统细胞分化。此外,BMSCs在生长和增殖过程中可以分泌一些营养因子,如脑源性神经生长因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。SCI后脊髓损伤区将出现组织结构破坏、细胞凋亡坏死,损伤区囊性空洞形成等一系列复杂的病理生理变化。因此我们尝试利用BMSCs的生物学特性,移植入损伤区内,替代脊髓坏死凋亡的细胞,来达到对损伤区脊髓神经纤维的保护和再生修复促进作用。采用细胞贴壁培养法获得同种异体BMSCs,Hoechst标记后,采用微量注射器移植入脊髓挤压损伤大鼠的损伤间隙内。于2、4周后取材制作切片,HE和免疫组织化学染色,采用BBB评分观察运动功能恢复情况。结果证实:BMSCs可以在脊髓损伤区间内存活、迁移和向神经细胞分化,能够有效的阻止脊髓损伤囊性空洞的形成,对SCI后损伤区神经纤维有保护作用,甚至可以促进神经纤维的再生和修复,但BBB评分结果各组之间在各时间点没有统计学差别。因此认为BMSCs可以参与大鼠脊髓损伤后的修复重建过程,但还不足以促进其运动功能恢复。实验二嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种仅存在于嗅神经系统的细胞,能终生产生维持神经元存活和轴突延长的神经营养因子及神经轴突促进因子,包括NGF、BDNF、GDNF等多种神经营养因子和一些表面粘附分子。而研究证实BMSCs具有多向分化潜能,因此,我们尝试利用OECs在培养过程中分泌的神经营养因子和表面粘附分子,来诱导BMSCs向神经细胞分化,为接下来研究诱导后的BMSCs与仅纯化的BMSCs移植,在SCI损伤修复中有无差异提供实验理论依据。选择生长状态良好的OECs,取其培养液,无菌条件下离心后,收集上清液即为OECs条件培养液。将已纯化传代培养第3代的BMSCs,按103～104/cm2接种于24孔培养板中,分为两组:A组为条件培养组,加入OECs条件培养液共培养,B组为空白对照组,加入原BMSCs培养液。诱导后观察BMSCs的形态学变化和免疫组织化学染色鉴定。结果A组BMSCs在诱导后出现胞体缩小,可见突起出芽生长,突起细长。B组细胞仍呈长梭形,无明显形态学变化。免疫组织化学染色A组呈神经细胞标志物阳性,MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55.2%和23.4%。因此证实嗅鞘细胞条件培养液可以诱导BMSCs向神经系统细胞分化。本实验成功的获得了大鼠的骨髓基质干细胞,将其应用于大鼠脊髓挤压损伤的基础治疗研究和体外向神经系统细胞诱导分化的实验研究。成功的观察到BMSCs,在大鼠体内参与脊髓损伤后神经纤维的修复重建过程及其在体外向神经系统细胞的诱导分化过程。为将来临床上应用BMSCs治疗脊髓损伤及其它神经系统疾病提供了理论依据。
郭守刚[9]2007年在《NT-3基因修饰的人胚嗅鞘细胞移植治疗自身免疫性脑脊髓炎的实验研究》文中指出研究背景与目的长期以来人们一直认为自身免疫性脑脊髓炎( experimental allergic encephalomyelitis, EAE)是以中枢神经系统(CNS)的髓鞘广泛脱失而轴索结构相对保存为特征的脱髓鞘病变,直到上世纪末期国外学者证实在EAE病灶中均广泛存在轴突损伤。为了寻找克服髓鞘及轴突再生不良的治疗策略,人们进行广泛而深入的研究,但进展缓慢,目前对其尚缺乏有效的治疗方法。一般而言,治疗像EAE这样的疾病无非有以下方法:(1)促进内源性修复机制的活化;(2)通过移植提供外源性成鞘细胞;(3)阻止环境中抑制因子对神经细胞的损害。而目前提高内源性髓鞘再生的临床试验未获成功,第叁种方法针对移植环境内有害因子给予静脉内注射免疫球蛋白也未获理想效果,人们更多地寄希望于进行细胞移植来解决EAE这一医学难题。目前发现,应用细胞移植、给予神经营养因子等方法可以部分改善损伤局部的微环境,促进损伤轴突及髓鞘的再生。在此基础上,基因治疗的策略应运而生,给EAE带来了新的希望。嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种新颖的神经胶质细胞,它兼有星形胶质细胞和雪旺氏细胞的双重特性,保留了许多发育阶段的特性和可塑性。它可以协助再生轴突穿越通常无法逾越的胶质瘢痕和中枢神经系统(CNS)的微环境,引导神经长入正确的部位,促进恢复髓鞘和轴突再生;而且,更为重要的是,OECs源于CNS,与CNS的整合及在CNS内的迁移非常自然。另外,它还有易取材、易存活、易接纳重组分子及能长期表达外源基因等特性,是重组基因增殖的理想场所,因而,成为移植供体理想的来源和基因转染较理想的受体细胞。神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)是神经营养素家族众多成员中最有效的一种,其生理功能广泛,在皮质脊髓束及一些大的感觉轴突上均存在NT-3受体,而这些神经司职的正是我们在EAE伤治疗中想得到的运动及感觉功能。研究发现,BDNF主要促进神经元胞体的发育与存活,而NT-3则主要促进轴突与髓鞘的分化与延伸。本研究拟体外培养较高纯度的人胚嗅鞘细胞(Human olfactory ensheathing cells ,hOECs)应用基因工程技术,尝试利用逆转录病毒介导人NT-3基因转染hOECs,构建具有生物活性的OECs-NT-3基因工程细胞,观察其对EAE的治疗作用并探讨其机制,为下一部为自体移植的实现做一些有益的尝试和先期准备工作。方法1、采用原代培养的方法,自人胚胎的嗅球培养出hOECs,然后行抗P75和GFAP染色,SABC免疫组织化学染色,鉴定并计算细胞阳性率。得到较为理想的细胞获取方法,并运用上述纯化后的细胞进行移植。2、提取、纯化逆转录病毒载体PN2A-NT-3,通过阳离子脂质体介导将NT-3转入PA317细胞,用G418筛选阳性克隆,建立PA317-NT-3细胞株。NIH3T3细胞测定病毒上清滴度,把病毒滴度高的上清感染hOECs,并加药筛选,构建hOECs-NT-3基因工程细胞。3、用ELISA方法测定hOECs-NT-3基因工程细胞分泌的NT-3蛋白随时间变化的表达量;RT-PCR检测转染后细胞上清RNA与预期的NT-3条带的长度相符是否相符及表达量;PC12-TrkC细胞共培养实验,观察其表达的NT-3的生物活性;对转染后的细胞行MTT细胞增殖实验,观察转染对其生存的影响。4、建立EAE大鼠模型,应用hOECs-NT-3基因工程细胞移植植入大鼠侧脑室,观察其在宿主环境中分布、迁徒特点;5、从髓鞘及轴突形态学结构、再生神经纤维密度、神经电生理、对神经元的逆行性保护、神经突触素抗体灰度值、运动功能学评分及超微结构等方面,研究hOECs-NT-3基因工程细胞移植对EAE的髓鞘修复及轴突再生的作用。6、探讨hOECs-NT-3基因工程细胞移植对EAE的修复机制,提出基因治疗EAE存在的问题及解决办法。结果1、人胚嗅球来源的hOECs2-8天的细胞纯度可达90%以上;纯化后的细胞活力随培养时间变化而发生变化,纯化后9-10d左右活力最高。根据P75、GFAP免疫细胞荧光染色鉴定,可以作为移植用的种子细胞。2、ELISA方法证实转染组上清液中NT-3含量明显高于未转染组与空载体转染组,此种结果可持续至转染后28天且表达量稳定(第3d、8d、13d、18d、23d、28d的浓度值分别为29.274+0.131、30.367+0.136、30.362+0.146、30.460+0.168、30.363+0.144、30.361+0.140ng/106细胞/24h,P>0.05);RT-PCR检测细胞上清观察到约774bp和258bp特异性条带,与预期的NT3的长度相符;转染组与未转染组浓度值间没有显着差异(P>0.05),表明用转染嗅鞘细胞后,对其增殖能力影响不大;感染后的hOECs可以促进PC12-TrkC细胞的分化,证实其表达的NT-3具有生物活性。3、免疫荧光染色及超微结构形态学观察发现,hOECs-NT-3移植后,可在宿主环境内存活,广泛分布,不仅可以在病灶内迁徙,而且可以在病灶间多点迁徙;脱髓鞘性病灶伤对于hOECs有趋化影响作用;转基因组神经纤维明显增多;形态学观察提示,髓鞘修复程度最好,轴索内线粒体、微丝等细胞器完整,周围髓鞘板层结构清楚,厚度均匀,显着优于单纯hOECs治疗组;髓鞘组化染色结果炎性病灶数显着低于单纯hOECs治疗组(P<0.01)。4、移植28天时,hOECs-NT-3移植组HRP标记的神经元数目及面积明显多于hOECs移植组,差别有显着意义(1858±112.5,561.5±296.5,p<0.01)。移植4周时,hOECs转基因移植组突触素(SYN)抗体染色灰度值显着高于hOECs移植组及对照组(80.02+7.1 ,53.65+8.9,39.08+7.3,P<0.01),提示移植组的神经突触的生长数目明显高于其它组,有利于损伤神经突触的修复,促进神经冲动的传递。5、移植hOECs-NT-3基因工程细胞28天后,单位面积内的神经纤维数目(第14d,28.8±2.2;第28d, 32.5±2.8)明显高于单纯hOECs治疗组第(14d,34.4±3.2;第28d, 38.8±3.4),(P<0.05);运动评分均明显高于单纯hOECs治疗组,差别有显着性意义(P<0.05);且二者之间存在正相关。6、移植hOECs-NT-3基因工程细胞4周后,转基因组组潜伏时间(20.6+0.3ms)与正常相比无显着性差异(P>0.05),波幅也达正常人的(74+7)%;而对照组潜伏期(24.2+0.3ms)仍明显延长,而且波幅亦低,达正常人的(21+2)%,与其它二组比较差异有显着性,(P<0.05)。结论1、利用重组逆转录病毒构建hOECs-NT-3基因工程细胞可以稳定、持久地表达NT-3蛋白,具有生物活性,可以在人胚嗅鞘细胞的后代细胞中发挥作用2、hOECs-NT-3移植后,可在宿主环境内存活,广泛分布,不仅可以在病灶内迁徙,而且可以在灶间多点迁徙,脱髓鞘病灶对hOECs的迁徙有趋化影响作用,其迁徙能力及方向与宿主的内环境有关。3、移植hOECs-NT-3基因工程细胞,能减轻EAE损伤后的逆行性皮质神经元损害、促进脊髓轴突的再生;增加神经元数目和面积,利于损伤神经突触的再生。4、移植hOECs-NT-3基因工程细胞后,神经纤维数目和运动评分均明显增加,且二者之间存在正相关,对EAE损伤后肢体运动功能的恢复有明显的促进作用。5、移植hOECs-NT-3基因工程细胞后,形态学及电生理研究证实,可显着促进髓鞘再生,提高神经传导速度。6、基因修饰的hOECs分泌持续、足量的NT-3,起到很好的协同作用,治疗EAE效果优于单独移植hOECs。7、基因治疗EAE技术真正应用到临床治疗中尚存在一些瓶径问题,我们的工作为下一步自体移植的实现做了有益的尝试和先期准备。
姬振伟[10]2009年在《嗅鞘细胞对正常及损伤脊髓神经元的保护作用研究》文中研究指明目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的培养液对正常及损伤大鼠脊髓神经元的影响,进一步探讨OECs促进及保护脊髓神经元的作用机制。方法:取成年SD大鼠分离制备OECs,对OECs行低亲和力神经生长因子受体抗体( rabbit-anti-rat low-affinity nerve growth factor receptor p75,NGFRp75)细胞免疫组织化学鉴定,并制备嗅鞘细胞培养液(olfactory ensheathing cell culture medium,OECCM);取孕15～17 d SD大鼠制备胚胎SD大鼠脊髓神经元;以双氧水(H_2O_2)制备大鼠脊髓神经元损伤模型。实验分两组:(1)对照组(DMEM/F12完全培养基,A组)和OECCM组(B组)分别作用于正常脊髓神经元,观察分析这两组脊髓神经元生长指标及细胞活性的差异;(2)对照组(DMEM/F12完全培养基,C组)和OECCM组(D组)分别作用于经H_2O_2致伤的脊髓神经元,观察其细胞活性的差异。结果:OECs培养6～9 d后,细胞大多呈双极形或梭形;正常脊髓神经元胞体较大,多成圆形,培养5～7d后,突起明显生长,多为双突起。NGFRP75细胞免疫组化示OECs细胞膜棕色深染,胞体清晰,呈梭性或叁角形,OECs培养纯度> 80%。(1)正常脊髓神经元培养6～9 d后,分别加入DMEM/F12完全培养基(对照组,A组)及OECCM(实验组,B组)培养3天,分别测量两组细胞胞体平均直径、单个神经元突起数目、细胞突起长度及MTT比色A值,对照组(A组)为(33.38±6.80)D/μm、(1.67±0.80)个和(91.19±62.64)L/μm、0.402 0±0.586 9;OECCM组(B组)为(37.39±7.28)D/μm、(1.76±0.82)个、(121.33±81.13)L/μm、0.466 0±0.479 0。两组比较差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。(2)以H_2O_2制备脊髓神经元损伤模型,损伤后2 h见,神经元数量明显减少、胞体皱缩,细胞突起明显回缩或断裂。分别加入DMEM/F12完全培养基(对照组,C组)及OECCM(实验组,D组)培养3天,分别检测两组MTT比色A值,对照组(C组)为0.149 0±0.030 0; OECCM组(D组)为0.184 0±0.052 0,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:OECs培养液可促进正常脊髓神经元生长,对损伤脊髓神经元起到一定程度的保护作用,OECs分泌的促神经生长因子是OECs发挥脊髓神经元保护作用的机制之一。
参考文献：
[1]. 嗅鞘细胞生物学特性研究及其移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察[D]. 史建国. 第叁军医大学. 2003
[2]. 人参皂甙Rg1强化嗅鞘细胞生物学行为的实验研究[D]. 陆政峰. 苏州大学. 2010
[3]. 应用组织工程学方法修复脊髓损伤基本问题的研究[D]. 王干. 清华大学. 2010
[4]. NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究[D]. 李云. 昆明医学院. 2010
[5]. 嗅鞘细胞移植治疗大鼠马尾神经压迫损伤的初步研究[D]. 刘宁. 第二军医大学. 2013
[6]. 嗅鞘细胞移植促进急性脊髓损伤再生的实验研究[D]. 任继鑫. 第叁军医大学. 2002
[7]. NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤再生的研究[D]. 吴军. 中国人民解放军军医进修学院. 2005
[8]. 骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤及其体外向神经细胞诱导分化的实验研究[D]. 冯林杰. 第四军医大学. 2008
[9]. NT-3基因修饰的人胚嗅鞘细胞移植治疗自身免疫性脑脊髓炎的实验研究[D]. 郭守刚. 华中科技大学. 2007
[10]. 嗅鞘细胞对正常及损伤脊髓神经元的保护作用研究[D]. 姬振伟. 第四军医大学. 2009
标签：外科学论文; 脊髓损伤论文; 细胞分化论文; 细胞生物学论文; 神经元细胞论文; 脊髓论文; 科学论文; 马尾神经论文;