张红英[1]2004年在《Herceptin对乳腺癌细胞化疗增敏作用的实验研究》文中进行了进一步梳理Herceptin是一种针对癌基因的单抗类抗肿瘤药，对于人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性的转移性乳腺癌有较好的疗效，是第一个以癌基因为靶的HER-2阳性乳腺癌转移患者的治疗药物。它可单独应用，也可与其它化疗药物联合应用。本文用MTT比色方法研究Herceptin对DDP、ADM和TXT化疗的增敏作用，结果如下： 1．HER-2/neu抗体(Herceptin)对乳腺癌细胞543具有明显的抑制作用。 2。DDP、ADM和TXT对人乳腺癌细胞543均有抑制作用，其中ADM和TXT的抑制作用尤为明显。ADM与人乳腺癌细胞543共同培养6小时，其30％抑制率为1.0ug/ml，DDP与人乳腺癌细胞543共同培养6小时，其30％抑制率为5.9ug/ml，TXT与人乳腺癌细胞543共同培养6小时，其30％抑制率为3.0ug/ml。 3．Herceptin分别与DDP、ADM和TXT联用时对乳腺癌细胞的抑制均明显高于单用Herceptin。 4．在最适浓度(2ug/ml)的条件下，Herceptin与化疗药DDP联用，在用DDP后24小时时加入Herceptin，对乳腺癌细胞的抑制作用最强；Herceptin与化疗药ADM联用，在用ADM后24小时时加入Herceptin，对乳腺癌细胞的抑制作用最强；Herceptin与化疗药TXT联用，在用TXT后18小时时加入Herceptin，对乳腺癌细胞的抑制作用最强。
钱朋飞[2]2011年在《基因靶向治疗对乳腺癌化疗增效作用的实验研究》文中认为背景:在世界范围内,乳腺癌已经成为女性肿瘤性疾病中发病率居第一位,死亡率位居第二的恶性肿瘤。据2007年统计,全世界每年约有7.9万新发乳腺癌病例,占全部女性恶性肿瘤总数的21%。全世界乳腺癌年均发病率为30.30/10万,世界人口调整率为32.97/10万。其中近60%的乳腺癌新发病例在发达国家。虽然乳腺癌的发病率在世界范围内差异较大,但整体呈上升趋势,发病年龄也呈年轻化。在我国一些大城市,乳腺癌已位居妇女癌症中第一位,成为女性恶性肿瘤的头号杀手。因而提高乳腺癌的疗效和治愈率已成为迫在眉睫的问题。乳腺癌作为一种全身性疾病,以手术、化疗、放疗和内分泌治疗相结合的综合治疗是当前乳腺癌的标准治疗模式。随着全身性疾病观念的确立,全身化疗在综合治疗中所起的作用必不可少。在众多化疗方案中,以阿霉素为代表的葸环类同以多西紫杉醇为代表的紫杉醇类化疗药物扮演着不可或缺的角色,对减少复发和改善预后起着至关重要的作用。BCIRG 001和NSABP B-28临床实验显示含蒽环类和紫杉类的(TAC)方案疗效显着,被推荐为乳腺癌辅助化疗的标准方案。然而,临床不得不面对的问题是:阿霉素的剂量限制性心脏毒性和骨髓抑制限制其在临床广泛应用;阿霉素类同紫杉类骨髓毒性具有迭加作用,两者联合化疗往往给患者带来IV度骨髓抑制,时时威胁患者生命。近年来,随着肿瘤分子生物学的深入研究,人们对乳腺癌的发生、发展、信号传导机制有了较为深入的了解,发现了许多与乳腺癌发生发展密切相关的基因和蛋白,以这些基因分子为靶点的肿瘤靶向治疗也逐渐成为乳腺癌辅助治疗的热点,有些已经取得不错的成绩,比如针对雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性患者进行内分泌治疗,有效率可达50-60%。从疗效来看目前这些治疗手段仍不能取代化疗,同时还有一定的局限性,如ER、PR(-)乳腺癌患者内分泌治疗有效率不超过10%。乳腺癌的分子靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的癌基因及其相关表达产物进行治疗。分子靶向药物通过阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导,来控制细胞基因表达,从而抑制或杀伤肿瘤细胞。在众多基因中,针对人类表皮生长因子受体-2(HER-2)基因无疑是同类基因中颇为成功的一个范例。HER-2基因是位于染色体17q21,具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。临床研究表明,20%-30%的乳腺癌中存在HER-2基因明显扩增和过表达,过表达者组织学分级高,分期晚,更容易发生实质性脏器转移,化疗后极少能够获得完全缓解。赫赛汀(Herceptin)是以乳腺癌HER-2基因作为治疗靶点的第一个分子靶向药物。它在临床上的应用已获得了巨大成就,已成为乳腺癌临床标准治疗不可分割的一部分,靶点明确,对正常机体无明显毒副作用,具有传统化疗所不具备的优越性。近年来,国内外临床上将目前乳腺癌化疗有效率最高的TAC方案同Herceptin一起用于HER-2阳性的乳腺癌患者,取得了可喜的成就。N9831和BCIRG006实验研究显示:采用环磷酰胺+阿霉素序贯多西他赛再序贯Herceptin模式(AC→T→H)与单纯辅助化疗相比,无病生存率和总生存率都明显提高。个中原因,是基因靶向治疗提高了化疗的敏感性,还是两者之间具有协同作用,很少有实验研究加以考证和探讨。若具有协同作用,能否在不降低化疗效果上减量,从而减轻Docetaxel+THP(DA)这个颇为有效率化疗方案的毒副作用,这些是临床所关注的问题。目的:用四唑蓝快速比色法(MTT)和细胞凋亡途径探讨验证DA联合Herceptin对乳腺癌细胞杀伤作用和可能机理,比较两者不同给药顺序对乳腺癌细胞杀伤作用的差异,为现行乳腺癌的化疗方案DA+ Herceptin提供实验依据开阔新的思路。方法:1.用免疫组化方法检测M453、M231两个细胞系HER-2表达情况,选取HER-2高表达细胞系进行实验。2.应用四氮唑蓝快速比色法(MTT)测定Docetaxel(D)、THP(A)对人乳腺癌细胞株M453作用24h、48h、72h的生长抑制率,采用Compusyn 1.0软件分析数据,绘制浓度-细胞抑制率曲线,计算IC50值。3.应用MTT法测定赫赛汀单独、联合、序贯Docetaxel(D)、THP(A)对人乳腺癌细胞株M453作用48h的生长抑制率,按金氏公式分析药物合并效应。4.用碘化丙啶(PI)渗入法测定单药,联合及不同序贯方式作用M453细胞48h,流式细胞仪各组细胞周期的变化。5. Annexin-V/FITC双标记法测定单药,联合及不同序贯方式作用M453细胞48h,流式细胞仪各组细胞早期凋亡率。6. Gimesa染色法处理,光镜下观察凋亡细胞形态。7.所有实验数据应用SPSS13.0软件包进行分析。单药作用采用Compusyn 1.0软件分析数据,绘制浓度-细胞抑制率曲线;检验浓度-抑制率曲线采用Microsoft Excel图表法;检验药物对细胞的抑制率、细胞周期分布、凋亡率,统计学方法采用t检验,计量资料用x±S表示。P<0.05有统计学意义。结果:1、免疫组化检测M453 HER-2高表达(3+),M453不表达(-)。2、Docetaxel作用M453细胞24h、48h、72h IC_(50)值分别为80.4372 ug/ml、53.9763 ug/ml、26.2771 ug/ml;THP作用24h、48h、72h IC_(50)值分别为13.9195 ug/ml、5.8422 ug/ml、1.4973 ug/ml,呈时间浓度依赖效应。3、Docetaxel与THP IC_(50)浓度联合对M453细胞作用48h的IC_(50)值为0.95114ug/ml, Q值为0.87(+);在1/4倍IC_(50)浓度联合Q值为1.19(++);2倍IC_(50)浓度联合时Q值为0.83(-)。4、1/2倍IC_(50)浓度Herceptin联合IC_(50)浓度Docetaxel抑制率为53.35%,Q值为1.08(+);1/4倍IC_(50)浓度Herceptin联合IC_(50)浓度Docetaxel、Docetaxel+THP抑制率分别为51.01%、61.95%,Q值分别为1.21(++)、1.17(++)。5、Docetaxel、THP、Docetaxel+THP序贯Herceptin抑制率为62.66%、85.47%、73.61%,Q值分别为0.94(+)、1.11(+)、0.84(-),Herceptin序贯Docetaxel、THP、Docetaxel+THP抑制率为80.23%、66.85%、88.11%,Q值分别为1.08(+)、0.86(+)、0.97(+)。6、THP作用M453细胞使G_0/G_1、S期比例下降,G_2/M比例升高;Docetaxel作用后使G_0/G_1、S期比例下降,G_2/M比例上升;Docetaxel联合Herceptin表现为G_0/G_1比例增加,S期、G_2/M比例减少;THP联合Herceptin G_0/G_1、S期比例下降,G_2/M比例上升;Docetaxel+THP+Herceptin时G_0/G_1比例减少,S期、G_2/M比例增加。7、Herceptin序贯Docetaxel G_0/G_1比例升高,S期、G_2/M比例下降。Docetaxel序贯Herceptin则S期增加,G_2/M比例减少;THP序贯Herceptin使G_/G_1、S期比例进一步下降,G_2/M比例继续升高;而Herceptin序贯THP则G_/G_1比例升高,S期、G_2/M比例下降;Docetaxel+THP序贯Herceptin表现为G_/G_1比例下降,G_2/M比例升高。Herceptin序贯Docetaxel+THP则G_/G_1、S期比例进一步下降,G_2/M比例继续升高。8、Gimesa染色及光镜下观察不同处理方式下凋亡细胞形态不同。结论:1、Docetaxel、THP、Herceptin单药对乳腺癌M453细胞均出现不同程度的增殖抑制,Docetaxel、THP对HER-2阳性细胞强于阴性细胞;Docetaxel+THP联合Herceptin对M453细胞抑制作用强于Docetaxel +THP;0.31、0.75、1.6倍IC50浓度的Docetaxel+THP联合Herceptin分别同1/2、1、2倍IC50浓度的Docetaxel+THP对乳腺癌细胞抑制作用相当。2、Herceptin主要引起G_1期阻滞,Docetaxel主要作用G_2/M期,THP主要对S期敏感;Docetaxel联合THP凋亡率高于单药;Docetaxel+THP联合Herceptin凋亡率高于Docetaxel+THP。3、Herceptin与Docetaxel+THP的不同给药顺序会影响乳腺癌抑制增殖的效果;THP序贯Herceptin、Herceptin序贯Docetaxel对细胞的抑制作用强于反向序贯;Herceptin序贯Docetaxel+THP对细胞的抑制作用强于Docetaxel+THP序贯Herceptin。
吴志勇[3]2007年在《赫赛汀对人乳腺癌细胞株MDA-MB453化疗增敏作用的研究》文中研究表明【目的】探讨赫赛汀(HER)对化疗药泰索帝(TXT)、盖诺(NVB)、顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、健择(GEM)、依托泊甙(VP-16)增敏的规律及其机制，为临床赫赛汀联合化疗药物联合使用提供实验依据。【方法】应用免疫细胞化学方法选择HER-2高表达的细胞系进行实验研究；应用四氮唑蓝(MTT)快速比色法测定赫赛汀组、单药化疗组以及以不同序贯方式结合的赫赛汀联合化疗组对人乳腺癌细胞株(MDA-MB453)的生长抑制率；流式细胞仪各组细胞周期的变化。【结果】1、免疫细胞化学方法检测MDA-MB453 HER-2蛋白表达为(3+)2、化疗药物HER、TXT、NVB、DDP、ADM、GEM、VP-16均对体外MDA-MB453细胞有直接的抑制和杀伤作用(P＜0.001)；3、MTT检查发现：(1)使用HER18h后应用TXT组取得最高的抑制率，明显高于其他序贯组及单药TXT组(P＜0.05)，发挥协同作用；(2)使用NVB后40h应用HER组的抑制率高于单药NVB组(P＜0.01)，此时抑制率最高，发挥协同作用；使用NVB组10h后应用HER组抑制率低于单药NVB组(P＜0.05)，此时拮抗作用最强；(3)HER与DDP联用时抑制率均好于单药DDP(P<0.01)，各组均为相加作用，其中以同时作用时效果最好；(4)各序贯ADM+HER联合作用组抑制率好于单药ADM组，表现为相加或协同作用；其中使用ADM后12～24h组协同作用较强：(5)使用HER后应用GEM组及HER+GEM同时应用组抑制率高于单药(P＜0.01)；使用GEM后应用HER组抑制率明显低于单药GEM组；同时使用时表现为相加作用，其他组则为拮抗作用(6)使用HER后应用VP16组、HER+VP16同时应用组及使用VP16 24h后应用HER组抑制率高于单药(P＜0.01)，同时应用组及化疗前应用HER组表现为相加作用，以化疗前6h应用最好。6、细胞周期分析发现：(1)单药HER引起细胞周期G1期阻滞，S期减少；(2)单独TXT使细胞周期阻滞于G_2／M期；与单药TXT化疗组相比，使用HER18h后应用TXT组G_0／G_1期细胞所占比例增加，G_2／M期细胞减少，而使用TXT6h后应用HER组则S期细胞所占比例明显增加，G_2／M期细胞明显减少；(3)单独NVB将细胞周期阻滞于G_2／M期；与单药化疗组相比，使用NVB 10h后应用HER组G_0／G_1期细胞所占比例减少，S、G_2／M期细胞增多；而其他序贯组则相反；(4)单独DDP使细胞周期阻滞于G_2／M期；与单药DDP组相比，先使用HER后应用DDP组G_0／G_1、S期期细胞所占比例减少，G_2／M期细胞增多，而其他组则未见明显变化；(5)单药ADM使肿瘤细胞阻滞在G_2／M期；使用ADM 24h后应用HER组较其他序贯方式组及单药ADM组，G_0／G_1、S期比例下降，G_2／M期比例升高；随着赫赛汀与ADM序贯方式的改变，G_0／G_1、S期比例逐渐下降，G_2／M期比例升逐渐升高；(6)单药GEM使肿瘤细胞阻滞在S、G_2／M期；GEM+HER同时应用组S期阻滞增强；随着序贯方式的改变，G_2／M期所占比例逐渐降低；(7)单药VP-16使细胞周期阻滞在S、G_2／M期；先HER后VP-16组及VP-16+HER同时应用组S期比例增高，G_2／M期比例下降；而使用VP-16 6h后应用HER组引起明显的G_1期阻滞，S、G_2／M期比例减少。【结论】赫赛汀同与不同化疗药物，以不同序贯方式使用可取得不同的生长抑制作用：与泰索帝联合时，提前18h应用HER可取得最佳抑制作用；与盖诺联合应用时，化疗后40h应用HER为最佳序贯方式；与顺铂联合应用时，先化疗后使用HER可取得最佳效果；与阿霉素联合应用时，化疗至少12h后应用HER时可取得最佳抑制作用；与健择联合应用时，同时应用HER为最佳序贯方式；与VP16联合应用时，提前6h应用HER为最佳序贯方式。其发生机制可能与细胞周期的变化有关。
王瑞[4]2006年在《胰岛素对5-氟尿嘧啶化疗增效作用及其机制》文中指出化疗是目前恶性肿瘤治疗的主要手段之一，然而多数化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常人体细胞也有较大损伤，产生毒副反应，从而使化疗不能顺利进行，严重影响了疗效。寻找和发现能够增加肿瘤对化疗药物敏感性的化疗增敏剂，使化疗药物能更大程度的提高疗效并减少毒副反应，是治疗恶性肿瘤急需解决的问题。 胰岛素是一种代谢促进剂，可以提高细胞和组织的代谢水平。另一方面，它还可以促进RNA和DNA的合成，刺激正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖，诱导肿瘤细胞进入增殖周期。已被证实：生长缓慢，生长分数低的肿瘤对化疗敏感性差；而生长快，生长分数高的肿瘤却有较好的化疗敏感性。生长快的肿瘤细胞多处于增殖周期，分裂增殖活跃，代谢旺盛，对化疗药物敏感；而生长缓慢的恶性肿瘤较多的肿瘤细胞处于非增殖周期，受细胞毒药物的影响也较小。 合理地使用促代谢剂胰岛素，将肿瘤细胞调整到代谢旺盛，分裂增殖活跃的状态，能够增加肿瘤组织对化疗药物的敏感性。本实验证实：裸鼠移植瘤动物模型上，胰岛素可增强5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗效果。增效的过程毒性并不增加。这与以往的体外研究结果一致。在观察疗效的基础上，对胰岛素增效机制也做了进一步探讨。 第一部分 胰岛素对化疗药物5-氟尿嘧啶的增效作用研究方法： (1) 建立裸鼠S180肉瘤、H22肝癌和人食管癌移植瘤动物模型，随机分为六组：对照组、单用胰岛素组、单用5-FU组、大中小剂量胰岛素联合5-FU组。胰岛素叁种剂量分别按0.09，0.06，0.03U／20g左腋皮下注射，5-FU按10mg／kg腹腔注射，胰岛素提前5-FU 30分钟给药。为防止低血糖的发生，每只裸鼠按0.8ml／20g灌胃50％G-S。
韩真真[5]2013年在《曲妥珠单抗对HER2高表达胃癌细胞株的放疗增敏作用》文中认为目的：研究曲妥珠单抗对HER2高表达人胃癌细胞NCI-N87的放疗增敏作用。方法：应用免疫组化法检测HER2蛋白在胃癌NCI-N87细胞中的表达；荧光免疫杂交法(FISH)检测HER2基因在NCI-N87细胞中的扩增情况；CCK8法筛选曲妥珠单抗杀伤NCI-N87细胞的浓度,一般选取<20%的抑制浓度(20%inhibition concentration,
张红[6]2006年在《叁羟异黄酮与化疗药物联合作用对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响及其机制研究》文中指出乳腺癌目前已经成为第一位威胁女性健康的恶性肿瘤,其中原癌基因HER-2/neu过度表达类型的乳腺癌约占30%。此类乳腺癌对传统化疗药物存在明显耐药,常导致化疗失败。HER-2/neu编码的蛋白为跨膜型人表皮生长因子受体家族成员,具有内在的酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, PTK)活性,有报道HER-2/neu高表达乳腺癌的化疗抗性与HER-2/neu PTK激活介导的信号转导通路有关。Herceptin(又名trastuzumab),人源化的抗HER-2/neu单克隆抗体已于1998年通过美国FDA批准上市进入临床应用,其主要作用机制是通过降低HER-2/neu蛋白表达来发挥作用。目前Herceptin和化疗药物联合应用已作为HER-2/neu过度表达乳腺癌的首选治疗方案。但是Herceptin价格昂贵,一个疗程花费需数十万元,并且对心脏有一定的毒副作用,因此寻求价格低廉、毒副作用小的Herceptin的替代药物具有十分重要意义。叁羟异黄酮(Genistein,GEN)作为大豆中的一种主要异黄酮成分,已有大量流行病学和实验研究证据表明其具有抗肿瘤作用,尤其是对乳腺癌防治可能具有重要意义。传统的亚洲饮食结构中富含大豆,从某种程度上可部分解释亚洲妇女乳腺癌发病率相对较低的原因。Genistein是一种重要的天然植物雌激素,对人体无明显毒副作用,其结构与雌二醇非常相似,具有模拟和拮抗雌激素、抑制PTK活性等重要药理作用。有关genistein的抗癌作用研究近年来备受国内外学者重视,尽管已有大量研究资料表明genistein是一种潜在的乳腺癌化学防治药物,且前期我们实验室研究发现genistein能抑制HER-2/neu的PTK活性,但其能否增强HER-2/neu高表达乳腺癌化疗的敏感性尚不清楚。基于以上分析,本研究以体外培养的HER-2/neu过度表达人乳腺癌细胞MDA-MB-453为研究对象,首先通过MTT实验、流式细胞分析、细胞形态学观察和Annexin-V-FITC/ PI双标记法等方法,观察genistein和化疗药物紫杉醇(Paclitaxel ,PTX)、阿霉素
王秀英[7]2007年在《固本抑瘤Ⅱ号对乳腺癌抑瘤作用及其机制的实验研究》文中认为乳腺癌是危害妇女健康的恶性肿瘤之一,居女性各类恶性肿瘤发病率和死亡率之首。乳腺癌成年女性发病约1‰,每年约有7.9万新病例发生,呈逐年增加趋势,因此乳腺癌的预防与治疗研究已经成为刻不容缓的任务。传统的手术及放、化疗过程对病变组织和正常组织的选择性较差,会引起各种并发症和后遗症,并造成机体的气血耗伤,使患者的生存质量及行为状态均较差,因此具有一定的局限性。中医药在乳腺癌治疗中所起的作用越来越不可替代。中医认为乳腺癌主要是由于脏腑虚损、血瘀痰凝毒结而成。癌症患者,尤其是中晚期癌症患者普遍存在血瘀证或气虚血瘀证,应对证采用益气活血法治疗。益气活血法属于“扶正祛邪”范畴,具有益气不留寇,驱邪不伤正的功效。固本抑瘤II号(GYⅡ)是北京市中医医院治疗气虚血瘀证肿瘤患者的有效方剂,常配合化疗应用。临床资料表明该方能够改善患者生活质量,减轻化疗的毒副作用。研究目的:探讨固本抑瘤Ⅱ号治疗乳腺癌的作用机制,为临床治疗乳腺癌提供理论依据。实验:1.固本抑瘤II号及联合化疗对MCF-7人乳腺癌细胞作用的实验研究制备GYⅡ水提物及GYⅡ的含药鼠血清。采用MTT法检测GYⅡ、表阿霉素(EPI)、GYⅡ+EPI及20%、10%、5%浓度的GYⅡ的含药鼠血清对MCF-7人乳腺癌细胞生长的影响。结果显示:GYⅡ对MCF-7人乳腺癌细胞生长表现为抑制作用,GYⅡ对MCF-7人乳腺癌细胞生长抑制达到30%、50%时的生药浓度分别是1.22mg/ml、3.25mg/ml;EPI随着浓度的增加对MCF-7人乳腺癌细胞生长的抑制作用增强,EPI的IC30、IC50的浓度分别为0.095μg/ml、0.228μg/ml;GYⅡ与EPI联合用药指数q值在0.85～1.25之间,提示两药联合应用有相加作用;20% GYⅡ的含药鼠血清在作用24h和48h后,对MCF-7细胞生长抑制率分别达到20.84%和23.91%,均大于20%,说明含药血清有细胞毒活性。2.固本抑瘤II号单独及联合化疗对EMT-6小鼠乳腺癌治疗作用的研究80只体重(19±1)g BALB/C雌性小鼠复制EMT-6小鼠乳腺癌动物模型。随机分为生理盐水对照组[Control]、EPI组[EPI](3mg/Kg腹腔注射)、GYⅡ低剂量组[S(GYⅡ)](13.7g/Kg·d灌胃)、GYⅡ中剂量组[M(GYⅡ)](27.3g/Kg·d灌胃)、GYⅡ高剂量组[H(GYⅡ)灌胃](54.6g/Kg·d)、GYⅡ低剂量+EPI组[S(GYⅡ)+ EPI]、GYⅡ中剂量+EPI组[M(GYⅡ)+ EPI]、GYⅡ高剂量+EPI组[H(GYⅡ)+ EPI]共8组,每组10只。观察GYⅡ单独及联合EPI对EMT-6小鼠乳腺癌移植瘤及转移瘤的作用。结果显示:H(GYⅡ)、EPI、H(GYⅡ)+ EPI平均出瘤时间的延迟率分别为22.45%、24.49%、28.57%;S(GYⅡ)、M(GYⅡ)、H(GYⅡ)组抑瘤率分别为13.6%、17.4%、34.38%,H(GYⅡ)组瘤重(1.722±0.555g)与对照组瘤重(2.624±0.582g)有显着差异(p<0.01),各给药组也不同程度地缩小了实体瘤的体积;S(GYⅡ)+ EPI组、M(GYⅡ)+ EPI组的q值均在0.85～1.15范围内,说明联合用药有相加作用;GYⅡ单独及EPI单独应用,对小鼠EMT-6小鼠乳腺癌自发性肺转移没有明显影响,S(GYⅡ)+ EPI组、M(GYⅡ)+ EPI组肺转移灶(分别为2.9±1.0个、2.7±1.3个)与对照组(5.5±1.5个)差异显着(p<0.05)。3.固本抑瘤II号对EMT-6荷瘤小鼠免疫功能的影响复制EMT-6小鼠乳腺癌动物模型。随机分为生理盐水对照组Control、EPI、M(GYⅡ)、H(GYⅡ)、M(GYⅡ)+ EPI 5组,每组10只。血球计数仪测量小鼠外周血的血常规,流式细胞仪测量外周血T细胞亚群水平;称量脾及胸腺的重量,计算脾指数及胸腺指数;取腹腔冲洗液中性红染色法测量巨噬细胞吞噬功能,用脾细胞采用MTT法检测荷瘤小鼠NK细胞活性、T淋巴细胞增殖功能。结果显示:GYⅡ可增加外周血RBC数量Hb的含量,改善肿瘤的贫血状态,对WBC的影响不明显;GYⅡ能增加EMT-6荷瘤小鼠胸腺指数,对脾指数影响不大;GYⅡ单独及联合EPI均能增加EMT-6荷瘤小鼠NK细胞活性,巨噬细胞吞噬功能,T淋巴细胞的增殖能力;GYⅡ能增加外周血CD3、CD4、CD8的水平;M(GYⅡ)组、M(GYⅡ)+ EPI组的EMT-6荷瘤小鼠的平均活存时间分别为33.3±7.3d和33.5±6.3d,与对照组23.6±6.87d比较,生存时间明显延长(p<0.05)。4.GYⅡ单独及联合EPI对荷瘤MCF-7人乳腺癌裸鼠实体瘤细胞周期和凋亡的影响48只体重(17±1)g BALB/C雌性裸鼠复制MCF-7人乳腺癌动物模型。待肿瘤直径生长至0.6cm左右时,随机分为6组,分别为Control、EPI(2mg/kg)、M(GYⅡ)、H(GYⅡ)、M(GYⅡ)+ EPI、M(GYⅡ)+ EPI,每组8只。给药25天后处死小鼠,摘取瘤组织称重后计算抑瘤率;流式细胞仪测量小鼠实体瘤组织的凋亡指数和细胞周期。结果显示:H(GYⅡ)的瘤重(1.59±0.39g)与对照组瘤重(2.49±1.35g)有显着差异(p<0.05),H(GYⅡ)+ EPI瘤重(0.70±0.55g)与对照组及EPI组瘤重(1.04±0.73g)均有显着差异(p<0.05);联合用药的q值均在0.85～1.15,提示其在抑瘤方面有相加作用。GYⅡ对乳腺癌瘤组织的细胞周期有一定的影响,GYⅡ随着剂量的增加肿瘤细胞在G0/G1期的分布有增加趋势,且H(GYⅡ)组的G0/G1值(54.74±2.11)与对照组(50.71±2.07)比较有统计学差异(p<0.05),而G2/M期的分布有减少趋势,对S期的影响不明显,联合用药组对肿瘤细胞周期的分布影响不明显。GYⅡ单独及联合EPI均显着促进瘤组织凋亡。结论:GYⅡ及含药鼠血清在体外能抑制MCF-7人乳腺癌细胞的生长,具有抑瘤和化疗增效作用;GYⅡ对EMT-6乳腺癌移植瘤及MCF-7乳腺癌移植瘤的生长有抑制作用,对EPI有化疗增效作用;并能提高荷瘤小鼠的免疫功能,改善贫血,延长荷瘤存活时间,能将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期,促进实体瘤的细胞凋亡;GYⅡ联合EPI能减少自发性肺转移灶,而单独用药对自发性肺转移灶的作用不明显。
张斌[8]2012年在《β-榄香烯与吉非替尼逆转乳腺癌MCF-7细胞他莫西芬耐药的实验研究》文中研究指明目的：内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌的重要治疗手段，但许多ER阳性的患者在内分泌治疗过程中出现ER转阴，导致获得性耐药，因此对内分泌治疗获得性耐药研究备受关注。对耐药机制的研究在ER水平和信号转导机制的研究则最被重视，内分泌耐药是ER和EGFR家族信号网络的双向作用共同调节的，ER阳性的细胞在MAPK信号表达上调后转为ER阴性。乳腺癌的综合治疗中，内分泌治疗多是序贯于放化疗之后，内分泌治疗过程中也可能伴有乳腺癌干细胞的富集，干细胞的富集是否构成内分泌耐药的原因，如何提高内分泌治疗的疗效，并延缓和逆转内分泌耐药是临床亟待解决的问题。中药β-榄香烯（β-Elemene，β-ELE）是从姜科植物温郁金中提取的抗癌有效成分，临床上应用于多种肿瘤的放疗增敏及化疗辅助，尚有逆转化疗耐药的研究，有报道与内分泌治疗具有协同作用。吉非替尼（Gefitinib，Iressa）是小分子酪氨酸激酶抑制剂，主要应用于肺癌的分子靶向治疗，近年来也应用于乳腺癌的内分泌联合治疗研究。据文献报道，化疗多药耐药逆转的研究中，具有逆转耐药的药物本身与化疗药物具备协同治疗的作用，与内分泌治疗有协同作用的药物是否具备逆转耐药的作用，对此我们进行一系列实验设计。首先，本研究模拟了人体乳腺癌治疗后复发的生物学特点，引入乳腺癌干细胞的概念，即在综合治疗后富集了少量的乳腺癌干细胞，在适当条件下进行增殖分化，导致乳腺癌复发的过程，通过体外干细胞培养条件下培养激素敏感的人乳腺癌MCF-7细胞，检测具备干细胞特性的悬浮球细胞雌激素受体（ER）的表达及对他莫西芬（Tamoxifen，TAM）的治疗敏感性，初步探讨内分泌耐药与乳腺癌干细胞的关系；并同时构建乳腺癌对TAM耐药的MCF-7/TAM细胞株（干细胞培养及传统低剂量诱导的方法），检测耐药细胞中ER在mRNA和蛋白表达水平改变，相关信号转导通路MAPK通路蛋白RAS、MEK1/2、p-ERK1/2水平变化，分析耐药MCF-7对TAM的耐药机制。其次，通过β-ELE、Gefitinib与TAM的联合应用，采用不同给药顺序干预乳腺癌MCF-7细胞的增殖，确定β-ELE和Gefitinib与TAM在内分泌治疗方面的联合应用价值，探索最佳给药顺序，确定其对MCF-7和MCF-7/TAM细胞的低剂量（细胞增殖抑制率<5%）。继而采用低剂量的β-ELE和Gefitinib作为逆转实验的干预剂量，处理对TAM耐药的MCF-7/TAM细胞，通过后者恢复对TAM敏感的现象，进一步检测治疗过程中ERα、ERβ在mRNA和蛋白表达水平的变化，以及MAPK通路蛋白RAS、MEK1/2、p-ERK1/2水平变化，分析β-ELE与Gefitinib在逆转乳腺癌内分泌耐药中的作用及机制。方法：分别于常规培养及干细胞培养条件下（悬浮球培养）培养激素敏感的MCF-7细胞株，流式细胞仪检测分子表型CD44~+CD24~(–/low)与CD44~+CD24~+亚群细胞比例变化，免疫细胞化学法测定ERα和ERβ的表达变化，MTT法检测细胞对他莫西芬的敏感程度。培养乳腺癌MCF-7/TAM耐药细胞；分别应用TAM与β-ELE联合、TAM与Gefitinib联合作用于MCF-7细胞，设立序贯与混合联用方案，用MTT法检测不同用药顺序对MCF-7细胞的增殖抑制作用，计算二药联合作用指数(combine index，CI)，比较不同方案对细胞增殖抑制率的影响，并着重观察ELE和Gefitinib低剂量下TAM对MCF-7细胞的增殖抑制情况。流式细胞仪检测Gefitinib与ELE细胞毒性剂量对MCF-7细胞周期的影响。采用干细胞培养及传统低剂量诱导的方法构建出ERα阴性的乳腺癌TAM耐药细胞MCF-7/TAM，分别不同剂量和不同时间段β-ELE和Gefitinib处理MCF-7/TAM细胞，通过MTT法分析并确定β-ELE和Gefitinib对MCF-7/TAM和对MCF-7细胞的低剂量及最佳作用时间，据MTT结果用10ug/ml的β-ELE和Gefitinib处理MCF-7/TAM细胞48h，设立MCF-7组（M0），MCF-7/TAM组（M/T），MCF-7/TAM-ELE10ug/ml（E10），MCF-7/TAM-Gefitinib10ug/ml（G10）组进行后续试验，用MTT方法检测经处理后的E10与G10组细胞对TAM的敏感性，RT-PCR和免疫细胞化学观察ERα和ERβ在mRNA和蛋白水平的变化，并检测各组细胞MAPK通路RAS，MEK1/2、p-ERK1/2蛋白水平变化。实验结果应用SPSS16.0软件，计数资料ERα与ERβ的阳性表达采用卡方检验进行统计学分析，结果用百分率表示；凝胶电泳结果分析采用IMAGEJ与LabWorks4.6软件分析，计量资料确保符合正态分布，两组样本比较采用t检验，叁组IC50值采用方差分析，结果以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。结果：干细胞培养条件下CD44~+CD24~(–/low)亚群细胞所占比例由常规培养的（0.27±0.08）%增至（1.60±0.08）%（p＜0.05），而CD44~+CD24~+亚群细胞比例由（5.59±0.88）%增至（30.63±4.40）%（p＜0.05）。干细胞培养条件培养下ERα和ERβ表达率较常规培养下调，分别由85.27%和90.53%降至69.43%和73.20%，差异有统计学意义（p均＜0.05），且对他莫西芬的敏感性降低，IC50值由(9.82±0.31)umol/L升至(16.46±0.50)umol/L，再次诱导分化后ER并未出现上调，对他莫西芬的敏感性仍旧降低（p＜0.05）。TAM与β-ELE序贯联用具有协同作用，序贯方法优于混合应用的迭加作用（p＜0.05）。TAM与Gefitinib联用不同顺序均具有协同作用，序贯联用方法优于混合应用（p＜0.05）。β-ELE5ug/ml及10ug/ml时ELE--TAM显示出优于TAM--ELE方案的趋势， Gefitinib5ug/ml及10ug/ml时Gefitinib--TAM显示出优于TAM--Gefitinib方案的趋势。流式细胞仪检测显示，β-ELE20ug/ml及40ug/ml作用于MCF-7细胞后，G0/G1期细胞比例由49.26%提高到64.04%和63.88%；Gefitinib10ug/ml及20ug/ml作用于MCF-7细胞后，G0/G1期细胞比例由49.26%提高到54.89%，68.35%。确定了β-ELE与Gefitinib与TAM的可联合性。后续试验发现，10μg/ml的β-ELE与Gefitinib作为干预剂量作用于M/T细胞48h后，细胞可重新对TAM敏感，细胞增殖受到抑制，实现耐药逆转。RT-PCR检测发现β-ELE治疗后可上调MCF-7/TAM细胞中ERα mRNA表达水平。与M0组相比，M/T组ERα mRNA与ERβ mRNA水平均见下调，以ERα mRNA下调最为显着(p＜0.05)。经β-ELE治疗后，E10组ERα mRNA明显上调(p＜0.05)，ERβ mRNA也在E10组出现上调(p＜0.05)。M0、M/T、E10各组ERα表达率分别为(95.04±1.81)%、(2.10±0.24)%、(82.34±3.21)%；各组ERβ表达率(96.13±1.07)%、(85.13±2.17)%、(74.33±3.07)%。ERα在M/T组细胞中的表达率显着下降p＜0.05)，在经过β-ELE治疗后表达率再次升高(p＜0.05)。而ERβ在M/T组细胞中的表达率仅有轻度下降(p＞0.05)，应用β-ELE治疗后表达率呈下降趋势。Western blot分析结果显示，M/T组MAPK通路蛋白Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M0组明显增强(p＜0.05)，经10μg/ml的β-ELE治疗48h后Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M/T组下调(p＜0.05)。在Gefitinib实验中，我们发现，Gefitinib上调MCF-7/TAM细胞中ERα mRNA和ERβ mRNA的水平，与M0组相比，M/T组ERα mRNA与ERβmRNA水平均见下调，以ERα mRNA下调最为显着(p＜0.05)。但是经Gefitinib治疗后，G10组ERα mRNA明显上调(p＜0.05)，ERβ mRNA也在G10组出现上调(p＜0.05)。免疫细胞化学显示，M0、M/T、G10各组ERα表达率分别为(95.04±1.81)%、(2.10±0.24)%、(75.04±2.88)%；各组ERβ表达率(96.13±1.07)%、(85.13±2.17)%、(90.25±2.15)%。ERα在M/T组细胞中的表达率显着下降(p＜0.05)，在经过Gefitinib治疗后表达率再次升高(p＜0.05)。而ERβ在M/T组细胞中的表达率仅有轻度下降(p＞0.05)，应用Gefitinib治疗后表达率呈上调趋势。Western blot分析结果显示，M/T组MAPK通路蛋白Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M0组明显增强(p＜0.05)，经10μg/ml的Gefitinib治疗48h后Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M/T组下调(p＜0.05)。结论：1.干细胞培养条件下可培养出具备干细胞特性的细胞亚群的悬浮球，且ER为阳性表达，但对TAM治疗敏感性减低，提示乳腺癌干细胞的富集可能是内分泌耐药的原因之一。2.利用干细胞培养方法可以构建乳腺癌MCF-7细胞的TAM耐药细胞。耐药的主要原因可能与MAPK通路蛋白表达上调，导致ERα缺失有关。3. β-ELE与Gefitinib均可阻滞MCF-7细胞于G0/G1期，增强TAM的抑制细胞增殖作用，与TAM药物间有协同作用。4. β-ELE和Gefitinib通过上调ERα mRNA水平，使ERα受体再表达，恢复对TAM的治疗敏感性，逆转MCF-7细胞对TAM耐药。5. MAPK通路是ERα受体再表达的重要途径，β-ELE和Gefitinib可以通过下调MAPK通道蛋白表达而实现ERα受体再表达。
赵洪猛[9]2011年在《吉非替尼对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中研究表明EGFR 是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族的成员,是利用分子遗传学方法发现的第一个细胞表面信号蛋白及原癌基因产物,具有受体分子的典型特征。乳腺癌中有14%～91%为EGFR高表达,而EGFR高表达与肿瘤的进展与预后密切相关,因此,针对EGFR的通路的研究及其靶向治疗,具有十分深远的意义。吉非替尼(Gefitinib,易瑞沙)是一种EGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂,可以通过竞争性结合ATP抑制EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化,从而阻断下游信号的传递。目前,Gefitinib应用于非小细胞肺癌(NSCLC)已经较为成熟,而对于乳腺癌的应用,目前尚处于基础及临床试验阶段。我们在细胞水平上,考察了 Gefitinib对乳腺癌细胞生物学行为(包括增殖、凋亡、运动、耐药等)多个方面的影响,为其应用于临床提供了理论基础。我们首先通过Western Blotting筛选出EGFR表达阳性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D细胞系作为模型。通过磷酸化Western Blotting选择出最佳的EGFR通路激活条件为EGF(100ng/ml)37℃作用1Omin。进一步通过磷酸化Western Blotting验证Gefitinib对乳腺癌细胞系EGFR通路的阻断能力以评价其药效。结果显示Gefitinib可以靶向性阻断乳腺癌细胞T47D、MDA-MB-231胞膜EGFR的磷酸化,进而抑制其主要通路(Ras/Raf/ERK及PI3K/Akt)的活化水平。但其下游两个重要通路的关键蛋白Akt、ERK1/2的活化不能完全抑制,尤以MDA-MB-231细胞显着。针对Gefitinib对乳腺癌细胞增殖的作用,首先通过MTT实验初步评价了Gefitinib对MDA-MB-231及T47D细胞系存活的影响。结果显示Gefitinib在浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM时,对T47D细胞的抑制率分别为:(34.9±8.8)%、(42.6±5.0)%、(60.7±5.4)%、(89.2±0.2)%,其 IC50 为 3.61μM;对 MDA-MB-231细胞的抑制率分别为:(24.8±4.9)%、(22.4±3.7)%、(48.3±5.9)%、(56.9±3.8)%,后者对Gefitinib有一定的耐药性。为进一步探究Gefitinib对T47D细胞增殖抑制作用的机理,我们利用流式细胞术测定了 Gefitinib对细胞周期的影响。结果发现,Gefitinib可以显着抑制T47D细胞于G0/G1期,使细胞无法越过限制点,因此降低了细胞的增殖。通过倒置显微镜观察,我们同时发现Gefitinib作用后的T47D细胞部分出现凋亡形态。流式细胞术(AnnexinV/PI)进一步验证发现,Gefitinib(10μM)作用Oh、12h、24h后,细胞凋亡率分别为2.8%、72.8%及94.9%。为研究Gefitinib导致细胞凋亡的分子机制,我们通过Western Blotting发现,随着Gefitinib作用浓度的增加,Bcl-Xl表达逐渐降低,Bax表达逐渐增加,而Caspase-3及PARP的剪切也随之增加,呈明显的剂量依赖关系。即Gefitinib可通过经典的线粒体途径,引起T47D细胞的凋亡。针对Gefitinib对乳腺癌细胞运动的作用,我们首先通过划痕试验及趋化试验,发现Gefitinib可以明显延长MDA-MB-231细胞的划痕愈合时间,减少穿膜细胞个数,呈剂量依赖关系。进一步通过免疫荧光检测F-actin的分布情况,发现经Gefitinib作用后,细胞无明显片状伪足伸出,细胞F-actin聚合作用减弱,无明显的极性变化,为细胞运动能力降低的直接原因。针对Gefitinib对乳腺癌细胞耐药的影响,我们通过MTT试验、Western Blotting检验了 Gefitinib联合化疗药物Doxorubicin对MDA-MB-231细胞的作用,发现 Gefitinib 与 Doxorubicin 联用可明显降低 Doxorubicin 的 IC50、IC80,凋亡的标志性蛋白PARP也因Gefitinib的参与剪切增加。因此,Gefitinib可明显提高Doxorubicin的细胞毒作用,起到化疗增敏的效果。另外,Doxorubicin序贯Gefitinib的作用要明显高于两者同时给药;反之,Gefitinib序贯Doxorubicin的作用明显低于两者同时给药。综上所述,Gefitinib可通过抑制EGFR通路的活化,抑制乳腺癌细胞的增殖,促进凋亡过程,并抑制其趋化迁移能力,提高化疗药物的抗肿瘤作用。我们认为,Gefitinib可以为乳腺癌的治疗提供新的方法和思路。但我们的试验同时也显示,单独应用Gefitinib并不能完全抑制EGFR下游通路的活化,乳腺癌部分细胞表现出对Gefitinib 一定的耐药性,这就提示了临床应用中也许同时存在EGFR通路的耐药机制,联合其他靶向药物或化疗药物的综合治疗是非常必要的。另外,Gefitinib联合化疗用药顺序的不同,也产生了截然不同的作用效果,提示了临床应用中对于Gefitinib与化疗联合应用时也应注意用药方式的选择。
王洪伟[10]2011年在《SP-4-84对人肝癌HepG2细胞株的化疗增敏研究》文中提出研究目的探讨咪唑啉(Imidazolines,SP-4-84)联合顺铂对人肝癌HepG2细胞株的体外化疗增敏作用。研究方法(1)体外培养人肝癌HepG2细胞株;(2)应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度顺铂单药及联合SP-4-84对人肝癌HepG2细胞株的抑制作用;(3)应用流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)、Annexin V-FITC/PI双标法分析对照组及各药物处理组诱导人肝癌HepG2细胞株的凋亡情况;(4)免疫荧光法检测Bcl-2和Survivin这两种凋亡抑制基因的表达情况。实验结果1.不同浓度的顺铂单药对人肝癌HepG2细胞株的增殖有抑制作用,联合SP-4-84后随其浓度的提高,对人肝癌HepG2细胞株抑制作用明显增强,与同浓度单药顺铂组及对照组比较(P<0.05),有统计学意义。2.应用流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双标法检测结果:顺铂与高浓度SP-4-84(6μl)组细胞凋亡率最高,在与单药顺铂组、顺铂与低浓度SP-4-84组(3μl)进行比较时,差异有显着性(P<0.01)。3.对免疫荧光图片进行定性、定量分析,SP-4-84能够使Bcl-2和Survivin两种凋亡抑制基因的表达下调。结论SP-4-84能增强人肝癌HepG2细胞对顺铂的化疗敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡;其机制可能与Bcl-2和Survivin这两种凋亡抑制基因的表达下调有关。
参考文献：
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[2]. 基因靶向治疗对乳腺癌化疗增效作用的实验研究[D]. 钱朋飞. 广州医学院. 2011
[3]. 赫赛汀对人乳腺癌细胞株MDA-MB453化疗增敏作用的研究[D]. 吴志勇. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[4]. 胰岛素对5-氟尿嘧啶化疗增效作用及其机制[D]. 王瑞. 郑州大学. 2006
[5]. 曲妥珠单抗对HER2高表达胃癌细胞株的放疗增敏作用[D]. 韩真真. 青岛大学. 2013
[6]. 叁羟异黄酮与化疗药物联合作用对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响及其机制研究[D]. 张红. 第叁军医大学. 2006
[7]. 固本抑瘤Ⅱ号对乳腺癌抑瘤作用及其机制的实验研究[D]. 王秀英. 北京中医药大学. 2007
[8]. β-榄香烯与吉非替尼逆转乳腺癌MCF-7细胞他莫西芬耐药的实验研究[D]. 张斌. 大连医科大学. 2012
[9]. 吉非替尼对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 赵洪猛. 天津医科大学. 2011
[10]. SP-4-84对人肝癌HepG2细胞株的化疗增敏研究[D]. 王洪伟. 泰山医学院. 2011
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