人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测

论文摘要

【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549～790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝（表达单元）pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

1.1.2 重组质粒构建及相关试剂耗材

1.1.3 主要仪器和设备

1.2 试验方法

1.2.1 人微小纤溶酶原基因序列的设计及扩增

1.2.2 人微小纤溶酶原基因与pPICZαA质粒的连接

1.2.3 重组质粒pPICZαA-mPlg的扩增及构建多拷贝

1.2.4 人微小纤溶酶原基因在毕赤酵母中的表达

1.2.5 人微小纤溶酶原的活性检测

1.2.6 甲醇添加比对人微小纤溶酶原表达的影响

1.2.7 pH对人微小纤溶酶原表达的影响

1.2.8 温度对人微小纤溶酶原表达的影响

1.2.9 溶氧量对人微小纤溶酶原表达的影响

1.2.10 发酵周期对人微小纤溶酶原表达的影响

1.2.11 纯化

2 结果与分析

2.1 人微小纤溶酶原基因与pPICZαA质粒的连接后用BglⅡ酶切

2.2 多拷贝载体双酶切后核酸电泳结果

2.3 转化到酵母中的菌落PCR鉴定

2.4 SDS-PAGE电泳结果

2.5 发酵周期对人微小纤溶酶原产量的影响

2.6 诱导剂浓度对人微小纤溶酶原产量的影响

2.7 pH对人微小纤溶酶原产量的影响

2.8 不同OD600诱导对人微小纤溶酶原产量的影响

2.9 溶氧量对人微小纤溶酶原产量的影响

2.10 温度对人微小纤溶酶原产量的影响

2.11 蛋白纯化SDS-PAGE及活性检测

3 结论

4 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王娜,何成霞,邹强,苟兴华,陈松,吴昊俣,蔡心析,许天恒

关键词: 人微小纤溶酶原,甲醇诱导,发色底物法

来源: 西南农业学报 2019年12期

年度: 2019

分类: 农业科技,医药卫生科技

专业: 基础医学

单位: 成都大学

基金: 成都市科技惠民技术研发项目(2015-HM01-00176-SF)

分类号: R346

DOI: 10.16213/j.cnki.scjas.2019.12.015

页码: 2807-2814

总页数: 8

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