导读:本文包含了中脑边缘多巴胺系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:中脑边缘皮质多巴胺系统,中脑腹侧被盖区,伏隔核核部,伏隔核壳部
中脑边缘多巴胺系统论文文献综述
景漫毅[1]（2019）在《中脑边缘皮质多巴胺系统在线索触发复吸中的精确调控作用》一文中研究指出药物成瘾是一种带有明显社会和心理特征的慢性复发性脑疾病,是重大的医学生物学和社会问题。我国相关政府管理部门估计,在我国实际药物成瘾患者已愈千万。药物成瘾不仅给成瘾者自身造成严重精神和躯体危害,而且引起巨大的经济(每年仅毒资消耗就高达数千亿元人民币)、社会(80%吸毒者有违法犯罪行为)和公共卫生(艾滋病、结核和肝炎的传播)问题,严重威胁国家安全和社会稳定。药物成瘾之所以能造成如此严重的危害,主要是因为人体对毒品的易感性和高复吸率(药物成瘾者经脱毒治疗后半年内复吸率高达95%以上)。实现降低复吸率的根本途径则是尽快全面认识成瘾复吸的神经生物学机制,发现有效的防复吸靶标,成功研发理想的防复吸药物和其他有效干预技术。在临床上,导致复吸的最关键因素是线索刺激。所谓线索指的是存在于外界环境中的一些本不具备奖赏效应的中性刺激,当其在时间和空间上和药物奖赏刺激反复偶联之后,这些中性刺激就会发生转化,变为条件性刺激。而这一发病过程中涉及了奖赏、动机、执行、决策、学习记忆和控制等多个中枢神经系统控制的一系列高级神经精神功能异常。传统假说认为由中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)多巴胺(dopamine,DA)能神经元编码的正性强化作用通过VTA到前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)多巴胺投射通路激活mPFC谷氨酸能神经元;当这一调控过程与中性线索,如声音或光线等,在时间和空间上与来自VTA多巴胺神经元编码的正性强化刺激相偶联之后,就会使mPFC谷氨酸能神经元发生代偿性适应改变,赋予上述中性刺激奖赏效应。在此基础上,经过消退训练后,线索刺激即可引起上述谷氨酸神经元兴奋,通过伏隔核(nucleus accumbens,NAc)引起复吸。然而基于该理论研发的化学(药物)干预策略仍未有效解决临床中线索诱发复吸问题。这主要是因为既往难于获得药物成瘾过程中脑区、核团、神经元及神经环路的精确功能定位;特定脑区之特定神经元在成瘾过程中,特别是复吸过程中神经环路之间的信息编码、加工与处理,及其与行为之间的关系的精确、直接的实验证据。而这些研究发现不仅是认识药物成瘾发生过程中关键节点,也是发现防复吸有效潜在靶点的关键。诚然,虽然这些研究工作尚处于数据积累阶段,但毫无疑问它将是有效降低药物成瘾复吸率的重要突破口,对全面阐明药物成瘾神经生物学机制具有重要意义。目前研究认为中脑边缘皮质多巴胺系统是与成瘾复吸最为密切的神经投射调控通路。该系统由VTA的多巴胺神经纤维投射至NAc和mPFC脑区,构成了公认的调节奖赏效应的公共通路。各类成瘾性物质直接或间接的快速升高该通路中DA浓度,产生强大的欣快感,并伴随产生与奖赏相关的关联性学习记忆,进而诱导强迫性用药行为的出现,最终导致成瘾的形成。然而,成瘾性物质进入机体后,除了作用于奖赏中枢外,同时也作用于其他脑区引起多种神经递质和复杂神经网络功能的改变。那么,中脑边缘皮质多巴胺系统在线索诱发复吸中扮演怎样的特异性调控角色?采用传统的药理学、脑区损毁及电生理等实验技术,无法在空间和时间上特异精确地解析特定神经元及单投射通路的作用。随着神经科学研究工具的跨越式发展,光遗传学技术的出现使得人类以往对神经元之间作用的理解由仅停留在相关性上,精确到特定神经环路和大脑功能之间的因果关系上。采用该技术,最新的研究发现:单独刺激VTA的DA能神经元即可诱导正性强化作用;并且在巴普洛夫经典实验中,特异性激活VTA-DA能系统可赋予线索动机激励价值并且发挥奖赏预测能力。与此同时,本实验室前期研究不仅发现了特异性刺激VTA-DA系统能够编码正性强化作用,而且首次直接证明,VTA中支配NAc壳部(NAc shell)、NAc核部(NAc core)和下边缘皮质(infralimbic cortex,IL)的DA能神经元,均可编码正性强化作用,而支配前边缘皮质(prelimbic cortex,PL)脑区的VTA多巴胺能神经元则无此作用。因此以上研究强烈提示,VTA-DA能系统是诱导成瘾行为的充分条件。然而这些假设仍不能回答的一个重大的科学问题是,VTA-DA能系统是否能触发线索诱导的复吸行为以及是怎样调控的?因为线索诱发复吸是发生在长时程消退或戒断之后,而成瘾的消退过程中机体中枢神经系统发生了广泛的神经生物学的改变。换言之,尽管以上最新研究明确了在成瘾形成过程中脑边缘皮质多巴胺系统发挥重要作用,也能赋予线索奖赏效应;那么经过长时间的消退训练后,中脑边缘皮质多巴胺系统是否依然能够启动调控成瘾复吸行为,是否存在特异性的调控通路及其神经生物学基础是什么?回答这些科学问题不但有益于全面、正确地认识成瘾的神经生物学机制,还对发现药物成瘾潜在的干预靶点具有重要科学意义。本课题拟在上述研究基础上,利用光遗传学、化学遗传学以及光纤记录等特异性神经操控技术,研究中脑边缘皮质多巴胺系统是否能直接启动线索触发的复吸行为,并且这一机制是否存在于药物成瘾过程中?哪些VTA-DA能神经投射能够特异性赋予线索奖赏激励价值以及启动触发线索复吸行为?具体研究结果如下所述:一、特异性刺激中脑边缘皮质多巴胺系统对成瘾奖赏行为及复吸的调节作用(一)中脑边缘皮质多巴胺系统对奖赏行为的调节作用脑内多巴胺神经递质在奖赏、学习及记忆过程中发挥重要调控作用。而各类成瘾性物质能够直接或间接的快速升高中脑边缘皮质多巴胺系统的DA浓度,产生强大奖赏效应,因此被认为是驱动成瘾发生发展的始动因素。那么,该系统中DA能神经元及其各神经投射纤维在成瘾的奖赏行为中发挥怎样的直接调控作用呢?因此,该部分研究采用化学遗传学和光遗传学的方法特异性干预该系统观察其对奖赏样行为(活动性及正性强化作用)的直接调控作用。1.特异性刺激中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元对活动性的调节高活动性被认为是药物产生正性强化作用的一个重要行为学表现。采用化学遗传学技术,将激活型或抑制型病毒(hM3Dq-YFP或hM4Di-YFP)注射在DAT-Cre+/-、鼠的VTA脑区,通过免疫荧光检测发现hM3Dq和hM4Di与TH的共染率分别为83%和80%,表明病毒高度特异性表达在酪氨酸羟化酶(TH)阳性的DA能神经元上。这些结果提示化学遗传学模型已被成功建立。首先为了排除化学遗传学病毒特异性配体氯氮平氮氧化物(Clozapine nitrogen oxide,CNO)本身对小鼠活动性的影响,对未注射病毒的小鼠,腹腔注射CNO(1 mg/kg)或者溶剂后,实验结果显示:与给予溶剂(n=3)相比,给予CNO对小鼠活动性无影响(n=4,P>0.05,t检验)。对于表达hM3Dq-YFP病毒的小鼠,腹腔注射CNO(1 mg/kg)或者溶剂,行为学测试结果显示:与给予溶剂相比,给予CNO特异性激活VTA-DA能神经元显着升高小鼠的活动距离(n=6,P<0.01,配对t检验);对表达hM4Di-YFP病毒的小鼠,腹腔注射CNO(1 mg/kg)或者溶剂后,与给予溶剂相比,给予CNO抑制VTA-DA能神经元显着降低小鼠的活动距离(n=5,P<0.01,配对t检验)。该结果提示,VTA-DA能神经元对活动性有直接调节作用,而这一功能是其调节正性强化作用的基础。2.特异性刺激中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元对正性强化作用的调节2.1.特异性刺激中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的效应曲线以往研究以及本实验室前期的研究均证实特异性激活VTA的DA能神经元能够建立颅内自给光刺激(optical intracranial self-stimulation,oICSS)行为。但是在上述模型中,只采用了单一刺激频率和脉冲时长,并且在训练过程中伴随了条件性线索的出现,无法排除其诱导的正性强化作用,是由于刺激VTA-DA能神经元所导致的还是由于具有奖赏激励价值的条件性线索作为强化物本身所维持的。因此,本部分研究采用不同的刺激频率或脉冲时长,观察正性强化作用的特异性改变,从而进一步明确VTA-DA能神经元对正性强化作用的直接调节。采用光遗传学技术,将激活性光遗传学病毒ChR2-mCherry注射在DAT-Cre+/-小鼠的VTA脑区后,用免疫荧光技术检测到ChR2-mCherry与TH的共表达率为89%,提示该病毒能够高度特异性表达在TH阳性的DA能神经元上。频率效应曲线的建立:在固定刺激激光的脉冲时长为15 ms的情况下,分别采用频率为 1 Hz、5 Hz、10 Hz、20 Hz、25 Hz、50 Hz 和65 Hz的激光刺激VTA-DA能神经元观察自身给光行为的变化。结果显示:小鼠的有效鼻触次数随着刺激频率的升高而显着性增加(单因素重复测量方差分析,频率主效应P<0.001,n=7);而无效鼻触无显着性变化(单因素重复测量方差分析,频率主效应P>0.05,n=7)。脉冲时长效应曲线的建立:在固定刺激频率为20 Hz的情况下,分别采用脉冲时长为2 ms,5 ms,10 ms,15 ms,20 ms的激光刺激VTA-DA能神经元观察自身给光行为的改变。结果显示:小鼠的有效鼻触次数与脉冲时长呈正相关,小鼠的有效鼻触次数随着脉冲时长的延长而增加(单因素重复测量方差分析,脉冲时长主效应P<0.001,n=5);无效鼻触无显着性变化(单因素重复测量方差分析,脉冲时长主效应P>0.05,n=5)。以上实验提示,特异性激活VTA-DA能神经元可直接介导正性强化作用。根据上述两条曲线和DA能神经元的生理特点,确定本文的刺激条件为20 Hz和15 ms。下文将通过微透析和药理学干预进一步探讨其正性强化作用的物质基础和受体机制。2.2.中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元调节正性强化的物质基础和受体机制在清醒动物微透析的实验中,将兴奋性光敏蛋白ChR2-mCherry特异性表达在VTA-DA能神经元上,将刺激光纤埋置一侧VTA脑区,并同时将微透析探针埋置同侧的NAc脑区。采用20 Hz 15 ms的激光刺激参数特异性激活VTA-DA能神经元,持续收集NAc脑区的灌流人工脑脊液,通过高效液相仪检测脑脊液内DA含量的变化。结果显示:与刺激前的DA基础水平相比,连续刺激VTA-DA能神经元单位时间内(每30分钟收集一个样品)能够升高NAc脑区的DA浓度(n=3,P<0.05,单因素重复测量方差分析)。结果提示,光遗传学激活VTA-DA能神经元通过增加DA的释放介导正性强化作用。那么NAc是否是DA调节正性强化作用的主要靶脑区?为回答这一问题,采20 Hz 15 ms的激光刺激VTA-DA能神经元建立自给光行为,然后在NAc双侧微量注射多巴胺D3受体阻断剂YQA14(2μg/侧),观察对自给光行为的影响。结果表明,与溶剂处理相比,在NAc注射YQA14能够抑制小鼠的自给光行为(有效鼻触:n=3,P<0.05;无效鼻触:n=3,P>0.05)。结果提示,多巴胺D3受体参与正性强化作用,并且NAe是DA调节正性强化作用的主要脑区。多巴胺受体分为D1样受体和D2样受体两大类,而D3受体属于D2样受体。那么D1样受体是否也在正性强化作用中发挥作用?以下的研究将回答这一问题。在光刺激VTA-DA能神经元建立的自给光频率效应曲线模型中,分别腹腔注射多巴胺D1受体阻断剂SCH23390(0.2mg/kg)或溶剂观察其频率效应曲线的改变。实验结果显示:与溶剂相比,SCH23390显着抑制小鼠有效鼻触次数使得频率效应曲线向下移动(双因素重复测量方差分析:药物主效应P<0.001,频率主效应P<0.001,交互作用P<0.001,n=7),而对无效鼻触无影响(双因素重复测量方差分析:药物主效应P>0.05,频率主效应P>0.05,交互作用P>0.05,n=7)。综上所述,通过第(一)部分的研究,从实验水平直接证实了 VTA-DA能神经元对成瘾奖赏样行为(活动性及正性强化作用)的直接调控作用,及递质和受体机制,为系统研究中脑边缘皮质多巴胺系统与线索诱发复吸的关系提供了良好的实验基础。在第(二)部分的研究中,我们将重点阐述该系统对线索诱发复吸行为的精确贡献及特异性调控作用。(二)中脑边缘皮质多巴胺系统对觅光行为的调节作用通过第(一)部分的研究,明确了激活VTA-DA能系统可以建立正性强化作用,但并不意味着其就能直接建立成瘾样行为。按照成瘾的定义,只有在经过消退后仍能被相关诱发因素激发复吸行为才能被称之为成瘾。本部分将在以上实验基础上,进一步研究在不同刺激因素诱导下,其觅光行为的重建(复吸),从而确定该系统对成瘾复吸的调节作用和特异性调节的神经通路。1.不同诱因对刺激中脑边缘皮质多巴胺系统觅光行为重建的影响1.1.线索和药物对刺激中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的觅光行为重建的诱导目前大量研究认为,导致复吸的因素主要有与成瘾刺激相关的线索和导致机体依赖的成瘾性药物。因此,本部分也将采用不同类型的成瘾性药物和相关线索进行复吸觅光行为重建的研究。首先,在oICSS模型中,将兴奋性光敏蛋白ChR2注射在VTA 一段时间后,采用20 Hz 15 ms的激光特异性激活VTA-DA能神经元训练小鼠形成稳定的自给光行为,之后进行消退训练,直至其正确触鼻次数达到稳定水平。分别用线索和腹腔注射可卡因、甲基苯丙胺、海洛因进行点燃。每次不同因素点燃后继续进行3-5天的消退训练直至行为稳定后,再进行下一次诱发。实验结果显示:(1)线索点燃:与消退期后3天的平均值相比,线索出现后,小鼠有效鼻触次数显着升高(n=6,P<0.05,配对t检验),而无效鼻触无显着变化(n=6,P>0.05,配对t检验),表明觅光行为被重建,提示在成瘾形成过程中激活VTA-DA能系统,无关线索可被赋予奖赏激励价值成为相关线索,从而诱发复吸觅光行为的出现。因此推测VTA-DA能系统的激活可能是线索诱发复吸的重要结构和物质基础,值得进行深入研究。(2)药物点燃:与消退期后3天的平均值相比,采用文献报道在药物成瘾中诱发复吸的通用剂量,可卡因(l0mg/kg,腹腔注射)、甲基苯丙胺(1 mg/kg,腹腔注射)或海洛因(1 mg/kg,腹腔注射),分别刺激实验动物,结果发现不但不能引起自给光行为重建,而且均显着降低有效鼻触次数(可卡因:n=8,P<0.01;海洛因:n=7;P<0.01;甲基苯丙胺:n=8,P<0.05;配对t检验)和无效鼻触的次数(可卡因:n=8,P<0.01;海洛因:n=7,P<0.01;甲基苯丙胺:n=8,有效鼻触,P<0.05;配对t检验)。以上结果提示,当给予更强奖赏效应刺激时,可产生显着的替代效应从而降低小鼠觅光行为。通过以上研究表明:VTA-DA能神经元直接编码正性强化作用,并能赋予线索奖赏激励机制,使线索能诱发觅光行为的重建,说明VTA-DA能系统是诱发成瘾样行为的充分条件。基于线索可显着诱发觅光行为重建这一重要发现,提示VTA-DA能系统可能特异性地参与了复吸的启动和触发。因此,下部分将深入研究该系统对线索诱发复吸觅光行为的特异性作用。1.2.线索对刺激中脑边缘皮质多巴胺系统各投射通路的觅光行为重建的诱导上述1.1的研究结果虽然明确了刺激VTA-DA能神经元的胞体可以编码正性强化作用,赋予线索正性强化作用和引起自给光行为重建的潜能;然而由于VTA的DA能神经元可根据其支配的脑区不同(NAccore、NAcshell、IL和PL)而分为相应的亚群,上述1.1的研究结果不能说明VTA-DA能神经元各个不同亚群在介导上述作用中扮演的角色。回答这一科学问题将将有助于发现VTA-DA能神经元在赋予线索奖赏激励价值、启动和触发线索复吸行为中是否存在特异性的投射通路。采用光遗传学技术,将激活型光敏蛋白ChR2-mCherry病毒微注射在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区,并且能够在显微镜下观察到NAc core、NAc shell、IL及PL脑区的DA能神经投射纤维上ChR2-mCherry红色荧光表达。在确保了兴奋性光敏蛋白表达后,将刺激光纤分别埋置在上述投射靶脑区,采用20Hz 15 ms的激光刺激参数,分别刺激VTA-DA能神经元的各个投射靶脑区诱导小鼠形成自给光行为,经过消退训练以后,用线索进行点燃。结果发现:分别激活VTA-NAc core、VTA-NAc shell及VTA-IL DA投射通路后可形成自给光行为,激活VTA-PL DA通路不能建立自给光行为。经过消退训练后,线索点燃均可显着升高有效鼻触次数(n=4,P<0.01;n=5,P<0.05;n=4,P<0.05;配对t检验),而对无效鼻触无显着影响(P>0.05,配对t检验)。以上研究提示,除VTA-PLDA能神经通路,激活其他通路均可编码正性强化作用并赋予线索奖赏激励价值,使得线索能够诱发觅光行为的重建。然而,大量研究表明在消退训练过程中,中枢神经系统发生了广泛的可塑性改变。那么即使VTA-DA能神经元及各神经投射能够赋予线索奖赏激励价值,在经过消退后,其是否仍能触发线索诱发复吸行为的出现?如果回答是肯定的,那么精确的神经环路什么?2.中脑边缘皮质多巴胺系统对线索诱发复吸的直接调控作用及特异性通路为回答以上问题,该部分将刺激VTA-DA能神经元和各投射通路建立自给光行为,经过消退训练后,激活VTA-DA能神经元及各投射通路观察对觅光行为重建的影响。2.1.激活中脑边缘皮质多巴胺系统对刺激中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的觅光行为重建的影响采用光遗传学技术,将兴奋型光敏蛋白ChR2-mCherry病毒特异性表达在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区的TH阳性的DA能神经元中,并将刺激光纤分别埋置VTA、NAc core、NAc shell、IL及PL等脑区。采用20 Hz 15 ms的激光刺激参数激活VTA的DA能神经元训练小鼠形成稳定的自给光行为,之后进行消退训练直至鼻触次数稳定。然后再分别用20 Hz 15 ms或者80 Hz 15 ms的激光分别刺激VTA、NAc core、NAc shell、IL和 PL脑区 100次 次(100 laser stimulation(100 LS)),激活VTA-DA神经元及各DA投射进行觅光行为的诱导。结果发现:与消退期相比,只有特异性激活VTA-NAc core的DA能神经投射通路能够显着增加小鼠有效鼻触次数(n=4,P<0.05,配对t检验),而对无效鼻触没有影响(P>0.05,配对t检验);而20 Hz 100 LS或者80 Hz 100 LS刺激所激活的VTA-DA能神经元、VTA-NAc shell DA通路以及VTA-ILDA通路均未能显着升高小鼠有效鼻触次数和无效鼻触(n=6,4,4;20 Hz 100LS:P>0.05;80 Hz 100LS:P>0.05;配对t检验);并且激活VTA-PL DA通路时,20 Hz 100 LS激活VTA-PL DA能神经投射通路,小鼠的有效鼻触与消退期有效鼻触相比出现了显着性的降低(n=4,P<0.05,配对t检验),80 Hz 100 LS激活VTA-PL DA通路有效鼻触无显着变化(n=4,P>0.05,配对t检验)。那么激活VTA-NAc core DA投射通路触发的觅光行为重建与线索诱发的复吸存在怎样的关系?将兴奋型光敏蛋白病毒ChR2-mCherry和抑制性化学遗传学病毒hM4Di-YFP特异性表达在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区的TH阳性的DA能神经元中,并将刺激光纤埋置在VTA和NAc core脑区。采用20 Hz 15 ms的激光刺激参数激活VTA的DA能神经元训练小鼠形成稳定的自给光行为,之后进行消退训练直至鼻触次数稳定。线索点燃前20 min在NAc core注射CNO(0.9 ng/侧)抑制VTA-NAc core DA通路。结果发现,当以相同方式给与溶剂时,线索能够升高有效鼻触次数(n=4,P<0.05,配对t检验),而对无效鼻触没有影响(n=4,P>0.05,配对t检验),提示线索诱发复吸行为。而在线索点燃前,抑制VTA-NAc core DA投射通路,小鼠的有效鼻触次数与溶剂组有效鼻触相比,显着降低(n=4,P<0.05;配对t检验)。结果表明,抑制VTA-NAc core DA通路抑制线索诱发的觅光行为重建。因此,通过以上研究首次发现,VTA-NAc core DA能神经投射通路特异性地参与线索触发的复吸行为。那么,这种现象是在起始阶段刺激VTA-DA能系统过程中,各系统相互作用的结果,还是单纯激活VTA-NAc core的DA能神经投射通路即可启动复吸行为?以下研究将做进一步的说明。2.2.激活中脑边缘皮质多巴胺系统各投射通路对刺激各投射通路的觅光行为重建的影响与上述实验不同的是,本实验单独激活VTA-DA各投射通路来建立自给光行为,经过消退训练,再次激活各投射通路进行觅光行为重建的诱导,以研究其在成瘾初始阶段对复吸的启动作用。首先将激活型光敏蛋白ChR2特异性表达在VTA-DA能神经元上,然后将刺激光纤分别埋置在NAc core、NAc shell、IL和PL,采用20 Hz 15 ms的激光刺激参数分别激活各投射通路(除了VTA-PL)建立自给光行为消退后,分别用80 Hz 150 LS的激光激活各投射进行觅光行为重建的诱导。实验结果显示:与消退期有效鼻触相比,只有激活VTA-NAc core DA通路显着升高小鼠的有效鼻触次数(n=8,P<0.05,配对t检验),对无效鼻触无明显影响(n=8,P>0.05,配对t检验)。提示,激活VTA-NAc core DA通路能够启动觅光行为重建。而激活VTA-NAc shell和VTA-ILDA通路时,有效或无效鼻触次数与消退期相比均无显着变化(n=5,5;P>0.05;配对t检验)。并且,在刺激VTA-IL建立的自给光行为消退后,特异性地激活VTA-NAc core DA通路后,小鼠的有效鼻触次数较消退期显着升高(n=3,P<0.05,配对t检验),而无效鼻触无明显变化(P>0.05,配对t检验)。该结果强烈提示,VTA-NAc core DA神经投射不仅在能够在起始阶段就发挥启动线索复吸的作用,而且能在其他DA神经投射建立的成瘾样行为中,对线索复吸发挥触发作用。综合第一部分研究可得出以下结论:①VTA-DA能神经元及各投射通路(除VTA-PLDA神经投射通路外)不仅能够编码正性强化作用,还能赋予线索动机激励价值;②在经过戒断消退训练后,只有VTA-NAc core DA投射通路是启动和触发线索诱发复吸行为的特异性神经投射通路。那么该机制是否在药物成瘾的线索复吸中,发挥同样重要的特异性作用?接下来在第二部分的研究中,将采用可卡因诱发自身给药成瘾模型,进行详细阐述。二、中脑腹侧被盖区到伏隔核核部的多巴胺投射对线索诱发可卡因复吸的调控作用研究本部分研究将采用可卡因自身给药成瘾模型,首先明确在线索诱发成瘾复吸中,VTA-DA能神经元活性变化,从而确定两者的直接相关性;进而在线索诱发复吸中,特异性干预(抑制和激活)VTA-DA能神经元及特异性投射通路,明确对复吸行为的直接调节作用。最终确定VTA-DA特异性通路对线索诱发复吸的充分必要性作用。采用DAT-Cre+/-模式动物为研究对象,将神经元激活指示剂、激活性光敏蛋白以及抑制性化学遗传学蛋白特异性地表达在VTA的DA能神经元上,然后结合小鼠可卡因自身给药模型开展相关研究。具体研究结果如下:(一)线索诱发可卡因复吸时腹侧被盖区多巴胺能神经元活性的动态变化首先将神经元激活指示剂(GCaMP6m)注射在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区,并将记录光纤埋置在同样的位置。通过免疫荧光检测发现,GCaMP6m与TH共染率达到92%,表明GCaMP6m高度特异性地表达在TH阳性的DA能神经元上。在确定病毒有效表达后,采用可卡因(0.5 mg/kg,静脉注射)训练上述小鼠建立自身给药行为。其中一组在训练过程中给予与药物相匹配的触鼻灯光线索,即线索匹配组;另一组则不给与药物相匹配的鼻触灯光,即非线索匹配组。待两组小鼠获得稳定的自身给药行为后进行消退训练,然后分别用鼻触灯光对两组小鼠进行点燃,同时对觅药复吸行为和VTA脑区的DA能神经元的特异性改变进行动态检测。结果发现:(1)线索匹配组小鼠的有效鼻触次数较消退期相比显着升高(n=5,P<0.05,配对t检验),无效鼻触无显着变化(n=5,P>0.05,配对t检验),并且神经元激活指示剂(GCaMP6m)的荧光的信号值AF/F较消退期显着升高(n=5,P<0.05,配对t检验),而且在线索出现的时间段内VTA-DA能神经元的活性一直维持在较高水平。(2)对于非线索匹配组,小鼠有效鼻触与消退期相比无显着变化(n=2,P>0.05,配对t检验),并且神经元激活指示剂钙调蛋白(GCaMP6m)的荧光的信号值AF/F较消退期无显着变化(n=2,P>0.05,配对t检验)。结果提示,只有当中性的鼻触灯光刺激与药物的奖赏效应匹配后才能够转化为条件性线索,从而被赋予奖赏激励价值从而诱发复吸的出现。并且在线索诱发复吸行为出现的同时VTA-DA能神经元能够特异性激活,该结果强烈提示VTA-DA能神经元直接参与线索诱发复吸行为的产生。结合第一部分光遗传学的研究结果,下文中采用化学遗传学和光遗传学的方法,在可卡因自身给药成瘾模型中,抑制或者激活VTA-DA能系统和各神经投射对线索诱发复吸行为进行干预,最终阐明启动和触发线索诱导复吸的特异性VTA-DA神经投射通路。以此,与第一部分研究结果相呼应。(二)线索诱发可卡因复吸的特异性多巴胺投射通路1.特异性干预中脑边缘皮质多巴胺系统对线索诱发复吸的影响将抑制性化学遗传学蛋白hM4Di-YFP注射在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区,使其特异性表达在TH阳性的DA能神经元上,并且能够在NAc core、NAc shell、IL以及PL脑区DA神经投射纤维上检测到抑制性蛋白的特异性荧光表达,并将微注射导管埋置在NAc core、NAc shell、IL以及PL。在确保病毒的有效性表达后,对上述小鼠进行可卡因自身给药训练,消退训练后,在线索点燃前20分钟分别腹腔注射氯氮平(Clozapine,CLZ,0.1 mg/kg)或者在NAc core、NAc shell、IL和PL各脑区双侧微注射CNO(0.9 ng/侧),从而分别抑制VTA-DA能神经元或各DA神经投射通路。结果发现:各组小鼠以相同方式给予溶剂,线索均能够升高有效鼻触次数(VTA组:n=4,P<0.05;NAccore组:n=3,P<0.01;NAcshell组:n=4,P<0.05;IL组:n=3,P<0.001;PL组:n=4,P<0.01;配对t检验),而对无效鼻触没有影响(VTA组;n=4,P>0.05;NAccore组:n=3,P>0.05;NAc shell组:n=4,P>0.05;IL组:n=3,P>0.05;PL组:n=4,P>0.05;配对t检验),提示线索诱发复吸行为。而在线索点燃前,抑制VTA-DA能神经元或者VTA-NAc core DA投射通路,小鼠的有效鼻触次数与溶剂组有效鼻触相比,显着降低(n=4,3;P<0.05;配对t检验);但抑制VTA-NAc shell、VTA-IL以及VTA-PL DA投射通路后,与溶剂相比,小鼠有效鼻触和无效鼻触均无显着变化(P>0.05,配对t检验)。以上结果表明,VTA-DA能系统确实参与了线索触发的复吸行为,而且是通过VTA-NAc core DA投射通路发挥特异性调节作用。2.激活中脑边缘皮质多巴胺系统对复吸行为的影响在确定了VTA-NAc core DA通路在触发线索诱导复吸行为的必要性作用后,该部分研究将激活各神经投射研究其触发复吸行为的充分性作用。本部分研究将携带兴奋型光敏蛋白ChR2-mCherry病毒注射在DAT-Cre+/-小鼠VTA脑区,使其特异性表达在TH阳性的DA能神经元上。在NAc core、NAc shell、IL以及PL脑区DA神经投射纤维上观察到光敏蛋白的特异性荧光表达。将光纤导管埋置在NAccore、NAc shell、IL以及PL等脑区。在确证病毒已有效性表达基础上,建立上述小鼠可卡因自身给药模型,经消退训练后,采用20 Hz 15 ms 100 LS的刺激参数分别激活VTA-NAc core、VTA-NAc shell、VTA-IL和VTA-PL DA能神经投射通路,观察其对复吸觅药行为重建的影响,结果显示:只有激活VTA-NAc core DA通路时,小鼠有效鼻触次数与消退期相比显着升高(n=6,P<0.05,配对t检验),而对无效鼻触次数无影响(n=6,P>0.05,配对t检验)。但采用20 Hz 15 ms 100 LS或80 Hz 15 ms 100 LS激活VTA-NAc shell、VTA-IL以及VTA-PLDA通路时,小鼠的有效触鼻次数与消退期相比均无显着性改变(n=4,4和4;20 Hz 100 LS:P>0.05;80 Hz 100 LS:P>0.05;均采用配对t检验)。因此,VTA-DA能系统参与了可卡因成瘾中线索诱发复吸的调节,并且通过VTA-NAc core DA能投射通路发挥特异性调控作用。综上所述,本课题采用光遗传学、化学遗传学和光纤记录等特异性的神经系统操作技术,证明了中脑边缘皮质DA系统对成瘾性奖赏行为的直接调控作用,并在此基础上阐述了该系统对线索诱发复吸行为的精确调控作用。首次发现了特异性激活VTA-DA能神经元以及各投射能够赋予线索动机激励价值,并且VTA-NAc core的DA能投射是启动触发线索诱发复吸特异性通路,具有充分必要性的调节作用。本课题的研究不仅对于正确、全面地认识成线索诱发复吸的神经生物学机制具有重要的意义,并且将为复吸早期、精准的干预提供理论依据。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-06-03）
韩笑[2]（2017）在《中脑边缘皮质多巴胺系统对奖赏效应的精确调控与外源性大麻正性强化作用及其机制研究》一文中研究指出奖赏效应是机体趋利避害、保证个体生存和种族延续的重要机制之一。脑内的奖赏通路由中脑边缘皮质多巴胺系统构成。该通路始于中脑腹侧被盖区(VTA)的多巴胺(DA)能神经元,其神经纤维上行,经内侧前脑束投射至伏隔核(NAc)、海马(Hippo)、内侧前额叶皮层(mPFC)、杏仁核(Amg)等脑区,是目前公认的调节奖赏效应的公共通路。研究发现各类成瘾性物质均能直接或间接的激活上述奖赏中枢,诱导DA浓度升高,产生奖赏效应;在此基础上,进一步产生与药物奖赏作用相关的关联性学习记忆,进而诱导强迫性用药行为的出现,最终导致成瘾的形成。然而,成瘾性物质进入机体后,除会作用于奖赏中枢产生上述奖赏效应和成瘾外,还会同时作用于其他脑区,引起多种复杂神经递质的变化和复杂神经调控网络功能的改变。中脑边缘皮质DA系统在药物成瘾过程中扮演怎样的角色,对药物成瘾的产生有怎样直接的贡献尚没有足够的直接实验证据。采用传统的药理学、脑区损毁及电生理等实验技术,无法在空间和时间上特异精确解析特定神经元及单投射通路的作用。新兴的光遗传学技术能够克服这一瓶颈,可在动物清醒自由活动的状态下,研究瞬时激活或者抑制单神经元、单投射对于行为的调控作用。采用该技术,能够精确分析中脑边缘皮质DA系统在奖赏中所发挥的作用。这方面的精确解析不但对认识成瘾的神经生物学机制具有重要意义,还会为评价和研究药物成瘾性及药物对成瘾的影响与DA系统的关系建立更为灵敏的实验动物模型提供新的策略,为大麻等弱精神活性物质的奖赏效应评价和机制研究提供有效技术手段。目前,大麻是在全球范围内滥用最为严重的精神活性物质。造成这一现状的根本原因是吸食大麻能给吸食者带来欣快感、幸福感和放松感等正性强化效应。大麻产生上述精神效应的主要成分是四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)。THC进入中枢神经系统后主要作用于大麻素受体1(Cannabinoid Receptor Type 1,CB1R)。CB1R是与Gi偶联的G蛋白偶联受体(GPCR)。传统观点认为CB1R主要表达在γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元上。THC作为CB1R的激动剂,当其与CB1R结合后,即可激活该受体,从而抑制了GABA能神经元的活性,解除GABA能神经元对DA能神经元的抑制,增强了后者的兴奋性,最终产生欣快效应。虽然,大麻是当今世界上滥用最为广泛的精神活性物质,但在动物实验中大麻致成瘾潜能尚无定论。在评价成瘾的金标准模型——自身给药实验中,仅一家实验室,仅在非人灵长类动物(松鼠猴)成功建立了THC自身给药行为模型。在啮齿类动物条件性位置偏爱模型(Conditioned Place Preference,CPP)和颅内电刺激模型((Intracranial self-stimulation,ICSS)上评价THC的成瘾潜能时,其研究结果相互矛盾。那么,究竟是何原因导致理论和实践如此大的不同呢?首先,大麻的致成瘾潜能较其他经典毒品(可卡因和海洛因)及合成毒品(甲基苯丙胺)相对较低;其次,对于大麻作用的主要靶点CB1R的研究而言,以往主要采用放射自显影,原位杂交或电生理的技术手段来确定其在脑内的表达分布,而以上技术手段由于操作繁杂,结果较大程度受限于信噪比的影响,无法精确实现不同细胞类型共定位,导致对于结果的解释存在一定的局限性和不完整性。例如,多数研究结果集中于报道CB1R表达水平较高的脑区,如海马,皮层等的GABA能神经元上,对于在奖赏作用中扮演重要作用的VTA脑区的CB1R表达情况鲜有涉及,而且对于其在与成瘾行为密切相关的其他神经元(DA能神经元)的表达也尚无明确结论。此外,THC作用于中枢神经系统后,可能诱发多种神经递质释放量的改变,目前的动物模型无法在时间和空间中精确分析该物质对单一的DA奖赏系统的影响作用。以上问题,导致了对大麻的正性强化作用及其神经生物学机制认识的局限性。阐明这些问题不但对人类准确认识大麻的成瘾潜能具有重要意义,还有利于我们对成瘾机制的全面认识。在欧美国家出现大麻合法化倾向的今天显得尤为重要。基于以上问题,本文采用光遗传技术对中脑边缘皮质DA系统对奖赏效应的精确调节作用进行研究,成功建立了自给光模型;以此为基础,研究了大麻对奖赏系统的作用及可能的神经生物学机制。本研究的主要发现如下。一、中脑边缘皮质多巴胺系统直接参与奖赏效应的调控(一)特异性激活腹侧被盖区的多巴胺能神经元能够建立自给光行为为了特异性的研究DA神经元的正性强化作用,本文采用了DAT-Cre转基因小鼠,将带有兴奋性光敏蛋白(ChR2)的腺相关病毒(AAV-DIO-Ch R2-mCherry)微注射在VTA脑区,使得光敏蛋白特异性的表达在DA能神经元上,获得了DAT-CreChR2模型小鼠。在此动物模型上,波长为473nm的蓝色激光能特异性激活VTA脑区表达的腺相关病毒从而激活DA神经元。1.病毒表达特异性与功能性确证在本实验中,对进行立体定位注射病毒后的小鼠脑组织进行连续切片和免疫荧光染色,可观察到表达红色荧光的病毒神经元与DA神经元高度重合,提示该病毒在VTA脑区DA能神经元上能高特异性表达,能够满足实验要求。对于已表达病毒的脑片进行全细胞膜片钳记录,实验结果发现在用不同频率473nm的蓝色激光刺激下,神经元可发放与刺激频率相应的动作电位,证明此实验系统已被成功建立。2.自给光刺激模型建立2.1.刺激参数的选择在本实验中,采用固定刺激时程(15 ms/pulse)和波长(473 nm),不同刺激频率(1、5、10、20、25及50 Hz,)诱导DAT-CreChR2小鼠建立自给光刺激模型(oICSS)及相应的频率效应曲线。结果表明,在上述刺激频率下DAT-CreChR2小鼠的有效鼻触次数随刺激频率增加而增加(n=9),呈现明显的频率依赖性;20Hz以下的单个光脉冲刺激都能诱导稳定的动作电位发放(n=8)。此结果提示在特异性激活VTA的DA神经元后可使DAT-CreChR2小鼠产生相应的正性强化行为。根据上述实验结果,本文选择20 Hz为实验刺激频率,供后续实验研究使用。2.2.颅内自给光训练采用上述确定的刺激参数对VTA的DA能神经元进行刺激。对完成立体定位术后小鼠的VTA进行固定频率(20 Hz),每天60 min的自给光训练。结果发现,随训练次数的增加DAT-CreChR2小鼠有效鼻触次数(与光刺激偶联鼻触)迅速增加。与无效鼻触次数相比,从训练的第2天开始,有效鼻触次数显着升高(P<0.01,n=9),表现出正性强化效应。而对照组DAT-CremCherry无此反应出现(P>0.05,n=5)。以上结果提示利用光遗传学技术能高效且特异性强的操控DA神经元活动,具有时间和空间特异性;单纯激活VTA的DA神经元即可产生稳定的奖赏效应。同时建立的仅依赖DA系统的o ICSS行为,可以用于评价药物对DA奖赏系统的影响。已知中脑边缘皮质DA系统是由始于VTA的DA神经纤维上行经内侧前脑束投射至NAc、Hippo、mPFC、Amg等脑区所构成,那么激活DA系统所产生的奖赏效应,具体是由哪个或哪几个投射通路所完成的呢?我们利用特异性刺激DA神经元投射末梢的方法对此进行研究。(二)腹侧被盖区的多巴胺神经元不同投射通路在奖赏效应中的作用1.免疫荧光和逆向追踪实验我们首先在VTA单侧注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒,然后对脑组织进行切片观察,发现在伏隔核核区(NAc core)、伏隔核外壳(NAc shell)、下边缘皮质(IL)和前边缘皮层(PL)均有红色荧光的神经纤维存在。接下来将逆向追踪染料Retrobeads分别定位注射于上述脑区,对VTA进行染色观察,发现VTA均有被标记的红色荧光表达,且与DA神经元的特异性染色标志物酪氨酸羟化酶(TH)重合,结果确证了从VTA发出的DA神经元投射到了上述脑区。2.腹侧被盖区的多巴胺能神经元投射通路在奖赏中作用将刺激光纤分别植入NAc core、NAc shell、IL和PL,进行光刺激,结果发现:1)与光刺激VTA相比,虽然在训练开始的前6天实验动物的有效鼻触增加速度均较慢,但与无效鼻触相比,NAc core组动物从训练第7天开始有效鼻触出现显着增加(P<0.05,n=9);NAc shell组动物则从训练第12天开始与无效鼻触相比出现显着差异(P<0.05,n=7);NAc core、NAc shell刺激的后3天有效鼻触次数分别为179±36.2次(n=9)和159±42.2次(n=7),均显着高于无效鼻触,但均显着少于刺激VTA时的有效鼻触723±112次(n=9);2)刺激IL的DA能神经元末梢后,从第10天开始,有效鼻触显着高于无效鼻触(P<0.05,n=7),后叁天平均有效鼻触次数为140±29.4次,显着高于无效鼻触28±10.3次(n=7);刺激PL的DA能神经元末梢后,不能使实验动物出现显着自给光行为,最后叁天有效鼻触次数为46±16.0,无效鼻触为35±12.4(n=7),无显着差异(P>0.05,n=5)。以上结果提示,从VTA发出的DA神经纤维在NAc core、NAc shell、IL的投射均参与到了奖赏过程,单独刺激上述通路即可引起奖赏行为,尽管效应较刺激VTA弱;在PL部位的投射与奖赏启动无直接关联。以往通过在体电生理记录以及测定DA浓度的方式认为NAc core只参与到了奖赏预期,只有shell才参与到奖赏正性刺激中,但我们的研究结果有力的证明刺激core和shell的DA能神经纤维均可直接产生奖赏作用。另外,以往认为mPFC的亚区主要参与决策与动机的调控,从我们的结果可看到IL也参与到了奖赏效应中。由此,我们将奖赏系统中的各条通路剥离开进行了研究,并初步阐明了它们在奖赏效应中的作用,对奖赏异常相关疾病提供了更为精确的靶区。二、大麻正性强化作用及可能机制研究。以上研究结果提示,中脑边缘皮质DA系统直接参与奖赏行为的调控。那么外源性大麻素的主要成分四氢大麻酚(THC)是否会影响该系统产生相应的药理学效应呢?THC是否具有奖赏作用呢?本研究分别从行为学和神经生物学两方面进行了相关研究。(一)大麻受体1在腹侧被盖区的神经元分布因为大麻受体1(CB1R)是THC在脑内发挥作用的主要靶点,因此了解CB1R的表达分布,特别是其神经元特异性分布的情况,则成为研究THC中枢作用的前提。通过免疫荧光技术和RNAscope技术,对CB1R在VTA的神经元特异性分布进行探究,结果发现:1)用免疫荧光技术可以在VTA的神经纤维水平上检测到CB1R蛋白存在,但未能实现其与神经元类型之间的准确共定位;2)用RNAscope实验技术则发现在VTA,CB1R的mRNA特异性地表达在DA能神经元、谷氨酸(Glu)能神经元及GABA能神经元的胞体上,提示CB1R可能在VTA的GABA能、Glu能和DA能神经元上均有表达。在特异性表达各类神经元的检测中,其表达比例分别为GABA:99.8±0.2%、Glu:99.4±0.4%,DA:26.8±4.3%。上述实验结果首次验证了在VTA脑区的GABA神经元和Glu神经元上有CB1R表达,并且首次发现在VTA的DA神经元上存在CB1R的mRNA表达。那么,DA能神经元上表达的CB1R是如何影响DA能神经元功能而实现THC作用的呢?于是,我们进一步采用已建立的仅激活DA奖赏系统的o ICSS模型进行行为学和机制的深入研究。(二)多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用及其可能神经生物学机制研究1.多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用——行为学实验在本实验中,应用DA能神经元CB1R条件性敲除小鼠DA-CB1-/-和非敲除小鼠DA-CB1+/+对THC激活DA能神经元上CB1R的作用开展了研究。由于THC无法在实验动物上建立自给药模型,所以我们利用本文第一部分创建的oICSS模型研究THC与DA系统的关系。结果发现:1)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,o ICSS反应曲线呈剂量依赖性向左上方移动,曲线下面积(AUC)较给可卡因前均显着增大(n=6,P<0.01)。提示可卡因诱导DA释放增多后增强了光刺激的奖赏效应;提示oICSS频率效应曲线和经典的电刺激-ICSS曲线一样可用于评价药物的奖赏相应以及致依赖潜能;2)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予THC(1 mg/kg)后oICSS曲线均显着左移(非敲除组:n=8,P<0.01;敲除组:n=7,P<0.01);在腹腔给THC 3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线右移,AUC显着降低(n=8,P<0.01),而敲除组小鼠无显着变化(n=7,P>0.05);腹腔给予选择性CB1R激动剂ACEA 3 mg/kg(n=8)后获得了同上实验结果。提示(1)低剂量THC对自给光行为可产生兴奋性作用(正性强化作用)。THC的此效应的神经生物学机制不是通过直接作用于DA能神经元发挥的,可能与其下调抑制性GABA能神经元功能相关;(2)当剂量升高到3 mg/kg时,THC对自给光行为可产生抑制性作用,其机制可能是通过激活DA能神经元上CB1R下调DA能神经元功能实现的;3)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予大麻素受体2(CB2R)特异性激动剂JWH-133(10 mg/kg)后对o ICSS曲线均无显着影响(n=4,P>0.05)。提示本实验模型中THC所发挥的作用与激活CB2R无关;4)腹腔给药THC 1、3、10 mg/kg后,3 mg/kg THC仅能使非敲除组小鼠自发活动显着降低(n=8,P<0.01),对敲除组小鼠自发活动无显着影响;10 mg/kg THC能使敲除和非敲除两组小鼠自发活动均显着降低(n=8,P<0.01)。提示3 mg/kg的THC对自发活动的降低作用可能是通过CB1R发挥的,高剂量10 mg/kg的THC对自发活动影响可能是大剂量THC对中枢神经系统的非特异抑制作用引起的;5)在检测活动能力的转棒实验中,腹腔给THC 3 mg/kg后,敲除和非敲除两组小鼠活动能力均未受影响(n=5,P>0.05)。提示3 mg/kgTHC减少实验动物自发活动可能是由于其降低基础DA水平,引起厌恶性效应,实验动物主观不愿意活动造成的。这些实验结果提示THC在低剂量(1 mg/kg,i.p.)下对实验动物有奖赏效应,该效应可能不是通过THC直接作用在DA能神经元上产生的,而是通过优势激活GABA能神经元上的CB1R,下调GABA能神经元功能,解除了后者对DA能神经元的抑制,间接上调DA能神经元功能引起的。中剂量(3 mg/kg)THC则呈现出致厌恶(抑制)效应,其机制很可能通过激活DA能神经元上的CB1R,抑制DA能神经元的兴奋性,而降低了DA神经递质的释放引起的。本实验通过对特异性敲除小鼠的研究,首次发现DA神经元上的CB1R直接参与了THC厌恶作用的调节。2.可能神经生物学机制研究——神经化学实验那么以上的推论确实存在与之对应的神经机制吗?在第一部分的研究中,我们已证实DA直接介导了奖赏效应,而NAc则是其发挥奖赏效应的主要靶脑区。为了进一步证明以上推论,我们采用清醒动物微透析技术进行研究,在相同的干预条件下,观察NAc内的DA浓度变化。结果发现:1)非敲除组小鼠DA-CB1+/+腹腔给药THC 1 mg/kg后,NAc的DA含量无显着变化(n=7,P>0.05);腹腔注射给予THC 3 mg/kg后,NAc脑区的DA浓度显着降低。(n=6,P<0.01);2)条件性敲除小鼠DA-CB1-/-腹腔给药THC 1 mg/kg后,NAc脑区的DA浓度显着升高(n=8,P<0.01);腹腔注射给予THC 3 mg/kg后,NAc脑区DA浓度依旧显着升高(n=7,P<0.01),但升高幅度较1 mg/kg低,两者无显着差别;以上结果进一步提示,THC对机体的作用可能根据给药剂量的变化而呈现双相性的表现,即低剂量产生奖赏效应,而当剂量升高到一定程度后产生厌恶效应,这种效应是以NAc内DA浓度变化为基础的。又由于DA的变化在非敲除组与敲除组上呈现明显不同,此结果呼应了我们行为学研究的结论,更进一步说明了THC作用的剂量依赖性和DA神经元上CB1R对于厌恶作用的重要调节。在以上研究中,我们首次证明了VTA脑区DA能神经元上存在CB1R,通过自身给光模型,发现小剂量THC发挥正性强化作用,剂量升高到一定程度则引起厌恶作用,为研究THC的中枢作用开辟了全新的研究领域。(叁)谷氨酸神经元参与四氢大麻酚作用及可能的神经生物学机制研究在VTA脑区除存在DA能神经元外,还有Glu能神经元。前期的研究发现CB1R在Glu能神经元也有表达,而该神经元作为主要的兴奋性神经元,THC又会如何影响该类神经元,发挥了怎样的作用呢。本实验利用oICSS模型和Glu能神经元上特异性敲除CB1R的小鼠Vglut2-CB1-/-来研究THC作用与Glu能神经元之间的关系。结果发现:1)用如前所述光遗传学技术和研究方法特异性兴奋VTA的Glu能神经元也可使小鼠产生oICSS行为,但是整体踏板次数低于DA兴奋时的踏板次数,且给予D1R与D2R阻断剂后踏板次数均显着降低(n=4,P<0.01),提示激活Glu能神经元后兴奋了DA能神经元产生奖赏效应;2)非敲除组(Vglut2-CB1+/+)与敲除组(Vglut2-CB1-/-)小鼠均腹腔分别给予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,oICSS反应曲线剂量依赖性地向左上方移动,在10 mg/kg剂量下曲线下面积均显着增加(n=6,P<0.01),曲线阈值与M50均显着降低(n=6,P<0.05),提示可卡因诱导DA增多后能够增强奖赏效应;2)非敲除组与敲除组小鼠腹腔给予THC1 mg/kg后o ICSS曲线均出现左移趋势,但无显着性差异(n=6,P>0.05);在腹腔给予THC 3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线显着右移,曲线下面积显着减小(n=6,P<0.01),曲线阈值与M50值显着升高(n=6,P<0.001);而敲除组小鼠则无上述变化(n=6,P>0.05)。提示两组小鼠对低剂量的THC反应一致,但中剂量对非敲除组产生了抑制效应。此抑制效应的产生机制可能与大剂量THC激活了Glu神经元上的CB1R、下调Glu能神经元功能、最终引起DA能神经元功能下调相关;3)腹腔给药THC 1、3、10 mg/kg后,在3 mg/kg与10 mg/kg剂量下仅非敲除组小鼠自发活动显着减少(n=8,P<0.01),而对敲除组小鼠无影响(n=8,P>0.05)。提示Glu神经元上的CB1R参与调节了自发活动;4)腹腔给予THC 3mg/kg后,伴随光刺激时,依旧可以升高已降低的自发活动(n=7,P<0.05)提示该剂量的THC并没有改变小鼠对于光刺激反应性。上述实验结果提示Glu能经元的兴奋通过上调DA神经元功能、增加DA的释放介导奖赏效应。外源性大麻(THC)通过激活Glu能神经元上的CB1R、下调DA能神经元功能,间接调节了中剂量THC产生的厌恶作用。综上所述,本课题证明中脑边缘皮质DA系统在奖赏中发挥了重要作用;首次发现了由VTA发源的DA能神经纤维投射在NAc core、NAc shell、IL和PL等脑区在奖赏行为正性强化作用中分别扮演的角色;成功建立了oICSS模型。首次发现DA能经元上存在CB1R表达。在这一发现基础上,利用此模型研究发现外源性大麻通过激活位于DA能和Glu能神经元上的CB1R,改变这些神经元功能,实现其自身的低剂量奖赏效应和中高剂量的厌恶效应。本课题的研究为阐明DA系统在奖赏中的作用提供了理论依据,为外源性大麻作用的神经生物学机制提供了新线索。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2017-06-02）
牛小莉,杨欢,李双成,郭力[3]（2012）在《中脑边缘多巴胺系统在药物成瘾机制中的研究现状》一文中研究指出人及其他动物大脑中能产生快感的系统被称之为奖赏系统,分为天然奖赏和药物奖赏。天然奖赏指对先天性的某些东西产生渴望,如食物;药物奖赏指长期接触或服用某种药物后形成的精神和身体依赖,如阿片类、酒精、安非他明、可卡因等,也称为成(本文来源于《临床荟萃》期刊2012年17期）
陈群,周文华[4]（2012）在《甲基苯丙胺依赖与中脑边缘多巴胺神经系统相关研究》一文中研究指出以甲基苯丙胺为代表的苯胺类中枢兴奋剂滥用问题日益突出,文章对甲基苯丙胺依赖的作用途径和机制进行了概述,包括中脑边缘系统多巴胺神经通路、多巴胺受体、多巴胺转运体及其他神经递质,最后提出了当前甲基苯丙胺成瘾治疗研究的主要方向.(本文来源于《宁波大学学报(理工版)》期刊2012年03期）
许静,李煜,宗蕾,侯文光,梁艳[5]（2012）在《针刺调节中脑边缘多巴胺系统治疗阿片类药物成瘾的研究进展》一文中研究指出自上世纪70年代以来,针刺被日渐广泛地运用于阿片类成瘾药物所致戒断症状的治疗,其疗效已被临床实验所证实[1],成为对抗成瘾,防止复吸的重要手段之一。但是,针刺缓解戒断症状的作用机制尚(本文来源于《中国药物依赖性杂志》期刊2012年01期）
刘超,卢大华[6]（2008）在《中脑边缘多巴胺系统与酒精依赖的研究进展》一文中研究指出酒精依赖(alcohol dependence)是一种以强迫觅酒行为、对酒精的摄取失去控制并伴有明显的社会和职业功能损害等为特征的精神障碍疾病。据世界卫生组织统计,全球酒精依赖者约1·4亿,还有4亿多人过度饮酒并可造成事故、损伤、疾病和死亡。酒精依赖形成(本文来源于《中国药物依赖性杂志》期刊2008年03期）
邓云新,范秋维[7]（2006）在《药物成瘾与中脑边缘多巴胺神经系统相关的研究》一文中研究指出药物成瘾是一种慢性、易复发性脑病,核心特征是以强迫性的药物寻求行为的综合征,即成瘾者失去了对药物寻觅和摄取的控制。中断给药后产生戒断综合征,最终导致身心健康损害和社会活动障碍。研究发现几乎所有存在滥用潜力的化学物质都有一个共同特性,那就是服用后引起前脑伏膈核区域多巴胺神经元末梢释放多巴胺增加。可见药物成瘾与脑内多巴胺系统的活动性改变密切相关,而且中脑边缘多巴胺系统(MLDS)是公认的与成瘾有关的最重要的脑区。急性给药后,成瘾药物一般都能够激活MLDS,这成为成瘾药物的奖赏、强化等共性效应的基础,也是形成条件信号的关联、诱导渴求或者觅药行为的神经基础。在药物的反复作用下MLDS内相关核团或神经元突触发生持续的对抗(本文来源于《2006年中华医学会全国麻醉学术年会知识更新讲座》期刊2006-09-01）
顾钧,杨国栋[8]（2004）在《中脑边缘多巴胺神经系统与成瘾的研究进展》一文中研究指出药物成瘾是慢性、复发性脑疾病,主要表现为强迫性药物使用,即成瘾者失去了对药物寻觅和摄取的控制[1-3]。几乎所有存在滥用潜力的化学物质都有一个共同特性,那就是服用后会引起前脑伏核区域的多巴胺神经元末梢释放多巴胺增加,这些发现使中脑多巴胺神经元投射到伏核和(本文来源于《中国药物滥用防治杂志》期刊2004年02期）
王玢,罗非,葛学彩,付爱华,韩济生[9]（2003）在《6-羟多巴胺损毁中脑边缘多巴胺能系统抑制药物点燃诱导的大鼠吗啡条件性位置偏爱消退后重建(英文)》一文中研究指出目的 :考察中脑边缘多巴胺能系统在小剂量吗啡点燃诱导吗啡觅药行为重建中的作用。方法 :将小剂量儿茶酚胺能神经毒素 6 羟多巴胺微量注射到双侧伏核 (1g·L-1)或腹侧背盖区 (5g·L-1) ,观察其对已消退的吗啡条件性位置偏爱之点燃重建的作用。结果 :6 羟多巴胺微量注射到腹侧背盖区选择性地损毁多巴胺能神经元的胞体 ,或注射到伏核以损毁多巴胺能纤维的末梢 ,均可完全消除小剂量吗啡 (0 .2 5mg·kg-1,s.c.)的点燃效应。结论 :中脑边缘多巴胺能系统功能的完整性是药物点燃导致条件位置偏爱重建的必要条件。(本文来源于《北京大学学报(医学版)》期刊2003年05期）
王惠玲,赵晏[10]（2003）在《阿片类药物依赖与中脑—边缘多巴胺系统回路》一文中研究指出阿片依赖是一种细胞适应性反应[1] ,包括细胞机能适应和形态适应 ,从而导致细胞的生理生化过程及组织结构的代偿性改变 ,最终达到病理状态的平衡。在这适应过程中有许多脑区参与 ,如弓状核、兰斑核、中脑导水管周围灰质、中脑被盖脚桥核、中脑腹测被盖区 (ＴＶＡ(本文来源于《中国药物依赖性杂志》期刊2003年01期）
中脑边缘多巴胺系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
奖赏效应是机体趋利避害、保证个体生存和种族延续的重要机制之一。脑内的奖赏通路由中脑边缘皮质多巴胺系统构成。该通路始于中脑腹侧被盖区(VTA)的多巴胺(DA)能神经元,其神经纤维上行,经内侧前脑束投射至伏隔核(NAc)、海马(Hippo)、内侧前额叶皮层(mPFC)、杏仁核(Amg)等脑区,是目前公认的调节奖赏效应的公共通路。研究发现各类成瘾性物质均能直接或间接的激活上述奖赏中枢,诱导DA浓度升高,产生奖赏效应;在此基础上,进一步产生与药物奖赏作用相关的关联性学习记忆,进而诱导强迫性用药行为的出现,最终导致成瘾的形成。然而,成瘾性物质进入机体后,除会作用于奖赏中枢产生上述奖赏效应和成瘾外,还会同时作用于其他脑区,引起多种复杂神经递质的变化和复杂神经调控网络功能的改变。中脑边缘皮质DA系统在药物成瘾过程中扮演怎样的角色,对药物成瘾的产生有怎样直接的贡献尚没有足够的直接实验证据。采用传统的药理学、脑区损毁及电生理等实验技术,无法在空间和时间上特异精确解析特定神经元及单投射通路的作用。新兴的光遗传学技术能够克服这一瓶颈,可在动物清醒自由活动的状态下,研究瞬时激活或者抑制单神经元、单投射对于行为的调控作用。采用该技术,能够精确分析中脑边缘皮质DA系统在奖赏中所发挥的作用。这方面的精确解析不但对认识成瘾的神经生物学机制具有重要意义,还会为评价和研究药物成瘾性及药物对成瘾的影响与DA系统的关系建立更为灵敏的实验动物模型提供新的策略,为大麻等弱精神活性物质的奖赏效应评价和机制研究提供有效技术手段。目前,大麻是在全球范围内滥用最为严重的精神活性物质。造成这一现状的根本原因是吸食大麻能给吸食者带来欣快感、幸福感和放松感等正性强化效应。大麻产生上述精神效应的主要成分是四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)。THC进入中枢神经系统后主要作用于大麻素受体1(Cannabinoid Receptor Type 1,CB1R)。CB1R是与Gi偶联的G蛋白偶联受体(GPCR)。传统观点认为CB1R主要表达在γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元上。THC作为CB1R的激动剂,当其与CB1R结合后,即可激活该受体,从而抑制了GABA能神经元的活性,解除GABA能神经元对DA能神经元的抑制,增强了后者的兴奋性,最终产生欣快效应。虽然,大麻是当今世界上滥用最为广泛的精神活性物质,但在动物实验中大麻致成瘾潜能尚无定论。在评价成瘾的金标准模型——自身给药实验中,仅一家实验室,仅在非人灵长类动物(松鼠猴)成功建立了THC自身给药行为模型。在啮齿类动物条件性位置偏爱模型(Conditioned Place Preference,CPP)和颅内电刺激模型((Intracranial self-stimulation,ICSS)上评价THC的成瘾潜能时,其研究结果相互矛盾。那么,究竟是何原因导致理论和实践如此大的不同呢?首先,大麻的致成瘾潜能较其他经典毒品(可卡因和海洛因)及合成毒品(甲基苯丙胺)相对较低;其次,对于大麻作用的主要靶点CB1R的研究而言,以往主要采用放射自显影,原位杂交或电生理的技术手段来确定其在脑内的表达分布,而以上技术手段由于操作繁杂,结果较大程度受限于信噪比的影响,无法精确实现不同细胞类型共定位,导致对于结果的解释存在一定的局限性和不完整性。例如,多数研究结果集中于报道CB1R表达水平较高的脑区,如海马,皮层等的GABA能神经元上,对于在奖赏作用中扮演重要作用的VTA脑区的CB1R表达情况鲜有涉及,而且对于其在与成瘾行为密切相关的其他神经元(DA能神经元)的表达也尚无明确结论。此外,THC作用于中枢神经系统后,可能诱发多种神经递质释放量的改变,目前的动物模型无法在时间和空间中精确分析该物质对单一的DA奖赏系统的影响作用。以上问题,导致了对大麻的正性强化作用及其神经生物学机制认识的局限性。阐明这些问题不但对人类准确认识大麻的成瘾潜能具有重要意义,还有利于我们对成瘾机制的全面认识。在欧美国家出现大麻合法化倾向的今天显得尤为重要。基于以上问题,本文采用光遗传技术对中脑边缘皮质DA系统对奖赏效应的精确调节作用进行研究,成功建立了自给光模型;以此为基础,研究了大麻对奖赏系统的作用及可能的神经生物学机制。本研究的主要发现如下。一、中脑边缘皮质多巴胺系统直接参与奖赏效应的调控(一)特异性激活腹侧被盖区的多巴胺能神经元能够建立自给光行为为了特异性的研究DA神经元的正性强化作用,本文采用了DAT-Cre转基因小鼠,将带有兴奋性光敏蛋白(ChR2)的腺相关病毒(AAV-DIO-Ch R2-mCherry)微注射在VTA脑区,使得光敏蛋白特异性的表达在DA能神经元上,获得了DAT-CreChR2模型小鼠。在此动物模型上,波长为473nm的蓝色激光能特异性激活VTA脑区表达的腺相关病毒从而激活DA神经元。1.病毒表达特异性与功能性确证在本实验中,对进行立体定位注射病毒后的小鼠脑组织进行连续切片和免疫荧光染色,可观察到表达红色荧光的病毒神经元与DA神经元高度重合,提示该病毒在VTA脑区DA能神经元上能高特异性表达,能够满足实验要求。对于已表达病毒的脑片进行全细胞膜片钳记录,实验结果发现在用不同频率473nm的蓝色激光刺激下,神经元可发放与刺激频率相应的动作电位,证明此实验系统已被成功建立。2.自给光刺激模型建立2.1.刺激参数的选择在本实验中,采用固定刺激时程(15 ms/pulse)和波长(473 nm),不同刺激频率(1、5、10、20、25及50 Hz,)诱导DAT-CreChR2小鼠建立自给光刺激模型(oICSS)及相应的频率效应曲线。结果表明,在上述刺激频率下DAT-CreChR2小鼠的有效鼻触次数随刺激频率增加而增加(n=9),呈现明显的频率依赖性;20Hz以下的单个光脉冲刺激都能诱导稳定的动作电位发放(n=8)。此结果提示在特异性激活VTA的DA神经元后可使DAT-CreChR2小鼠产生相应的正性强化行为。根据上述实验结果,本文选择20 Hz为实验刺激频率,供后续实验研究使用。2.2.颅内自给光训练采用上述确定的刺激参数对VTA的DA能神经元进行刺激。对完成立体定位术后小鼠的VTA进行固定频率(20 Hz),每天60 min的自给光训练。结果发现,随训练次数的增加DAT-CreChR2小鼠有效鼻触次数(与光刺激偶联鼻触)迅速增加。与无效鼻触次数相比,从训练的第2天开始,有效鼻触次数显着升高(P<0.01,n=9),表现出正性强化效应。而对照组DAT-CremCherry无此反应出现(P>0.05,n=5)。以上结果提示利用光遗传学技术能高效且特异性强的操控DA神经元活动,具有时间和空间特异性;单纯激活VTA的DA神经元即可产生稳定的奖赏效应。同时建立的仅依赖DA系统的o ICSS行为,可以用于评价药物对DA奖赏系统的影响。已知中脑边缘皮质DA系统是由始于VTA的DA神经纤维上行经内侧前脑束投射至NAc、Hippo、mPFC、Amg等脑区所构成,那么激活DA系统所产生的奖赏效应,具体是由哪个或哪几个投射通路所完成的呢?我们利用特异性刺激DA神经元投射末梢的方法对此进行研究。(二)腹侧被盖区的多巴胺神经元不同投射通路在奖赏效应中的作用1.免疫荧光和逆向追踪实验我们首先在VTA单侧注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒,然后对脑组织进行切片观察,发现在伏隔核核区(NAc core)、伏隔核外壳(NAc shell)、下边缘皮质(IL)和前边缘皮层(PL)均有红色荧光的神经纤维存在。接下来将逆向追踪染料Retrobeads分别定位注射于上述脑区,对VTA进行染色观察,发现VTA均有被标记的红色荧光表达,且与DA神经元的特异性染色标志物酪氨酸羟化酶(TH)重合,结果确证了从VTA发出的DA神经元投射到了上述脑区。2.腹侧被盖区的多巴胺能神经元投射通路在奖赏中作用将刺激光纤分别植入NAc core、NAc shell、IL和PL,进行光刺激,结果发现:1)与光刺激VTA相比,虽然在训练开始的前6天实验动物的有效鼻触增加速度均较慢,但与无效鼻触相比,NAc core组动物从训练第7天开始有效鼻触出现显着增加(P<0.05,n=9);NAc shell组动物则从训练第12天开始与无效鼻触相比出现显着差异(P<0.05,n=7);NAc core、NAc shell刺激的后3天有效鼻触次数分别为179±36.2次(n=9)和159±42.2次(n=7),均显着高于无效鼻触,但均显着少于刺激VTA时的有效鼻触723±112次(n=9);2)刺激IL的DA能神经元末梢后,从第10天开始,有效鼻触显着高于无效鼻触(P<0.05,n=7),后叁天平均有效鼻触次数为140±29.4次,显着高于无效鼻触28±10.3次(n=7);刺激PL的DA能神经元末梢后,不能使实验动物出现显着自给光行为,最后叁天有效鼻触次数为46±16.0,无效鼻触为35±12.4(n=7),无显着差异(P>0.05,n=5)。以上结果提示,从VTA发出的DA神经纤维在NAc core、NAc shell、IL的投射均参与到了奖赏过程,单独刺激上述通路即可引起奖赏行为,尽管效应较刺激VTA弱;在PL部位的投射与奖赏启动无直接关联。以往通过在体电生理记录以及测定DA浓度的方式认为NAc core只参与到了奖赏预期,只有shell才参与到奖赏正性刺激中,但我们的研究结果有力的证明刺激core和shell的DA能神经纤维均可直接产生奖赏作用。另外,以往认为mPFC的亚区主要参与决策与动机的调控,从我们的结果可看到IL也参与到了奖赏效应中。由此,我们将奖赏系统中的各条通路剥离开进行了研究,并初步阐明了它们在奖赏效应中的作用,对奖赏异常相关疾病提供了更为精确的靶区。二、大麻正性强化作用及可能机制研究。以上研究结果提示,中脑边缘皮质DA系统直接参与奖赏行为的调控。那么外源性大麻素的主要成分四氢大麻酚(THC)是否会影响该系统产生相应的药理学效应呢?THC是否具有奖赏作用呢?本研究分别从行为学和神经生物学两方面进行了相关研究。(一)大麻受体1在腹侧被盖区的神经元分布因为大麻受体1(CB1R)是THC在脑内发挥作用的主要靶点,因此了解CB1R的表达分布,特别是其神经元特异性分布的情况,则成为研究THC中枢作用的前提。通过免疫荧光技术和RNAscope技术,对CB1R在VTA的神经元特异性分布进行探究,结果发现:1)用免疫荧光技术可以在VTA的神经纤维水平上检测到CB1R蛋白存在,但未能实现其与神经元类型之间的准确共定位;2)用RNAscope实验技术则发现在VTA,CB1R的mRNA特异性地表达在DA能神经元、谷氨酸(Glu)能神经元及GABA能神经元的胞体上,提示CB1R可能在VTA的GABA能、Glu能和DA能神经元上均有表达。在特异性表达各类神经元的检测中,其表达比例分别为GABA:99.8±0.2%、Glu:99.4±0.4%,DA:26.8±4.3%。上述实验结果首次验证了在VTA脑区的GABA神经元和Glu神经元上有CB1R表达,并且首次发现在VTA的DA神经元上存在CB1R的mRNA表达。那么,DA能神经元上表达的CB1R是如何影响DA能神经元功能而实现THC作用的呢?于是,我们进一步采用已建立的仅激活DA奖赏系统的o ICSS模型进行行为学和机制的深入研究。(二)多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用及其可能神经生物学机制研究1.多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用——行为学实验在本实验中,应用DA能神经元CB1R条件性敲除小鼠DA-CB1-/-和非敲除小鼠DA-CB1+/+对THC激活DA能神经元上CB1R的作用开展了研究。由于THC无法在实验动物上建立自给药模型,所以我们利用本文第一部分创建的oICSS模型研究THC与DA系统的关系。结果发现:1)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,o ICSS反应曲线呈剂量依赖性向左上方移动,曲线下面积(AUC)较给可卡因前均显着增大(n=6,P<0.01)。提示可卡因诱导DA释放增多后增强了光刺激的奖赏效应;提示oICSS频率效应曲线和经典的电刺激-ICSS曲线一样可用于评价药物的奖赏相应以及致依赖潜能;2)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予THC(1 mg/kg)后oICSS曲线均显着左移(非敲除组:n=8,P<0.01;敲除组:n=7,P<0.01);在腹腔给THC 3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线右移,AUC显着降低(n=8,P<0.01),而敲除组小鼠无显着变化(n=7,P>0.05);腹腔给予选择性CB1R激动剂ACEA 3 mg/kg(n=8)后获得了同上实验结果。提示(1)低剂量THC对自给光行为可产生兴奋性作用(正性强化作用)。THC的此效应的神经生物学机制不是通过直接作用于DA能神经元发挥的,可能与其下调抑制性GABA能神经元功能相关;(2)当剂量升高到3 mg/kg时,THC对自给光行为可产生抑制性作用,其机制可能是通过激活DA能神经元上CB1R下调DA能神经元功能实现的;3)非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予大麻素受体2(CB2R)特异性激动剂JWH-133(10 mg/kg)后对o ICSS曲线均无显着影响(n=4,P>0.05)。提示本实验模型中THC所发挥的作用与激活CB2R无关;4)腹腔给药THC 1、3、10 mg/kg后,3 mg/kg THC仅能使非敲除组小鼠自发活动显着降低(n=8,P<0.01),对敲除组小鼠自发活动无显着影响;10 mg/kg THC能使敲除和非敲除两组小鼠自发活动均显着降低(n=8,P<0.01)。提示3 mg/kg的THC对自发活动的降低作用可能是通过CB1R发挥的,高剂量10 mg/kg的THC对自发活动影响可能是大剂量THC对中枢神经系统的非特异抑制作用引起的;5)在检测活动能力的转棒实验中,腹腔给THC 3 mg/kg后,敲除和非敲除两组小鼠活动能力均未受影响(n=5,P>0.05)。提示3 mg/kgTHC减少实验动物自发活动可能是由于其降低基础DA水平,引起厌恶性效应,实验动物主观不愿意活动造成的。这些实验结果提示THC在低剂量(1 mg/kg,i.p.)下对实验动物有奖赏效应,该效应可能不是通过THC直接作用在DA能神经元上产生的,而是通过优势激活GABA能神经元上的CB1R,下调GABA能神经元功能,解除了后者对DA能神经元的抑制,间接上调DA能神经元功能引起的。中剂量(3 mg/kg)THC则呈现出致厌恶(抑制)效应,其机制很可能通过激活DA能神经元上的CB1R,抑制DA能神经元的兴奋性,而降低了DA神经递质的释放引起的。本实验通过对特异性敲除小鼠的研究,首次发现DA神经元上的CB1R直接参与了THC厌恶作用的调节。2.可能神经生物学机制研究——神经化学实验那么以上的推论确实存在与之对应的神经机制吗?在第一部分的研究中,我们已证实DA直接介导了奖赏效应,而NAc则是其发挥奖赏效应的主要靶脑区。为了进一步证明以上推论,我们采用清醒动物微透析技术进行研究,在相同的干预条件下,观察NAc内的DA浓度变化。结果发现:1)非敲除组小鼠DA-CB1+/+腹腔给药THC 1 mg/kg后,NAc的DA含量无显着变化(n=7,P>0.05);腹腔注射给予THC 3 mg/kg后,NAc脑区的DA浓度显着降低。(n=6,P<0.01);2)条件性敲除小鼠DA-CB1-/-腹腔给药THC 1 mg/kg后,NAc脑区的DA浓度显着升高(n=8,P<0.01);腹腔注射给予THC 3 mg/kg后,NAc脑区DA浓度依旧显着升高(n=7,P<0.01),但升高幅度较1 mg/kg低,两者无显着差别;以上结果进一步提示,THC对机体的作用可能根据给药剂量的变化而呈现双相性的表现,即低剂量产生奖赏效应,而当剂量升高到一定程度后产生厌恶效应,这种效应是以NAc内DA浓度变化为基础的。又由于DA的变化在非敲除组与敲除组上呈现明显不同,此结果呼应了我们行为学研究的结论,更进一步说明了THC作用的剂量依赖性和DA神经元上CB1R对于厌恶作用的重要调节。在以上研究中,我们首次证明了VTA脑区DA能神经元上存在CB1R,通过自身给光模型,发现小剂量THC发挥正性强化作用,剂量升高到一定程度则引起厌恶作用,为研究THC的中枢作用开辟了全新的研究领域。(叁)谷氨酸神经元参与四氢大麻酚作用及可能的神经生物学机制研究在VTA脑区除存在DA能神经元外,还有Glu能神经元。前期的研究发现CB1R在Glu能神经元也有表达,而该神经元作为主要的兴奋性神经元,THC又会如何影响该类神经元,发挥了怎样的作用呢。本实验利用oICSS模型和Glu能神经元上特异性敲除CB1R的小鼠Vglut2-CB1-/-来研究THC作用与Glu能神经元之间的关系。结果发现:1)用如前所述光遗传学技术和研究方法特异性兴奋VTA的Glu能神经元也可使小鼠产生oICSS行为,但是整体踏板次数低于DA兴奋时的踏板次数,且给予D1R与D2R阻断剂后踏板次数均显着降低(n=4,P<0.01),提示激活Glu能神经元后兴奋了DA能神经元产生奖赏效应;2)非敲除组(Vglut2-CB1+/+)与敲除组(Vglut2-CB1-/-)小鼠均腹腔分别给予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,oICSS反应曲线剂量依赖性地向左上方移动,在10 mg/kg剂量下曲线下面积均显着增加(n=6,P<0.01),曲线阈值与M50均显着降低(n=6,P<0.05),提示可卡因诱导DA增多后能够增强奖赏效应;2)非敲除组与敲除组小鼠腹腔给予THC1 mg/kg后o ICSS曲线均出现左移趋势,但无显着性差异(n=6,P>0.05);在腹腔给予THC 3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线显着右移,曲线下面积显着减小(n=6,P<0.01),曲线阈值与M50值显着升高(n=6,P<0.001);而敲除组小鼠则无上述变化(n=6,P>0.05)。提示两组小鼠对低剂量的THC反应一致,但中剂量对非敲除组产生了抑制效应。此抑制效应的产生机制可能与大剂量THC激活了Glu神经元上的CB1R、下调Glu能神经元功能、最终引起DA能神经元功能下调相关;3)腹腔给药THC 1、3、10 mg/kg后,在3 mg/kg与10 mg/kg剂量下仅非敲除组小鼠自发活动显着减少(n=8,P<0.01),而对敲除组小鼠无影响(n=8,P>0.05)。提示Glu神经元上的CB1R参与调节了自发活动;4)腹腔给予THC 3mg/kg后,伴随光刺激时,依旧可以升高已降低的自发活动(n=7,P<0.05)提示该剂量的THC并没有改变小鼠对于光刺激反应性。上述实验结果提示Glu能经元的兴奋通过上调DA神经元功能、增加DA的释放介导奖赏效应。外源性大麻(THC)通过激活Glu能神经元上的CB1R、下调DA能神经元功能,间接调节了中剂量THC产生的厌恶作用。综上所述,本课题证明中脑边缘皮质DA系统在奖赏中发挥了重要作用;首次发现了由VTA发源的DA能神经纤维投射在NAc core、NAc shell、IL和PL等脑区在奖赏行为正性强化作用中分别扮演的角色;成功建立了oICSS模型。首次发现DA能经元上存在CB1R表达。在这一发现基础上,利用此模型研究发现外源性大麻通过激活位于DA能和Glu能神经元上的CB1R,改变这些神经元功能,实现其自身的低剂量奖赏效应和中高剂量的厌恶效应。本课题的研究为阐明DA系统在奖赏中的作用提供了理论依据,为外源性大麻作用的神经生物学机制提供了新线索。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
中脑边缘多巴胺系统论文参考文献
[1].景漫毅.中脑边缘皮质多巴胺系统在线索触发复吸中的精确调控作用[D].军事科学院.2019
[2].韩笑.中脑边缘皮质多巴胺系统对奖赏效应的精确调控与外源性大麻正性强化作用及其机制研究[D].中国人民解放军军事医学科学院.2017
[3].牛小莉,杨欢,李双成,郭力.中脑边缘多巴胺系统在药物成瘾机制中的研究现状[J].临床荟萃.2012
[4].陈群,周文华.甲基苯丙胺依赖与中脑边缘多巴胺神经系统相关研究[J].宁波大学学报(理工版).2012
[5].许静,李煜,宗蕾,侯文光,梁艳.针刺调节中脑边缘多巴胺系统治疗阿片类药物成瘾的研究进展[J].中国药物依赖性杂志.2012
[6].刘超,卢大华.中脑边缘多巴胺系统与酒精依赖的研究进展[J].中国药物依赖性杂志.2008
[7].邓云新,范秋维.药物成瘾与中脑边缘多巴胺神经系统相关的研究[C].2006年中华医学会全国麻醉学术年会知识更新讲座.2006
[8].顾钧,杨国栋.中脑边缘多巴胺神经系统与成瘾的研究进展[J].中国药物滥用防治杂志.2004
[9].王玢,罗非,葛学彩,付爱华,韩济生.6-羟多巴胺损毁中脑边缘多巴胺能系统抑制药物点燃诱导的大鼠吗啡条件性位置偏爱消退后重建(英文)[J].北京大学学报(医学版).2003
[10].王惠玲,赵晏.阿片类药物依赖与中脑—边缘多巴胺系统回路[J].中国药物依赖性杂志.2003
标签：中脑边缘皮质多巴胺系统; 中脑腹侧被盖区; 伏隔核核部; 伏隔核壳部;