蚕丝磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的抗真菌功能研究

论文摘要

家蚕属于鳞翅目昆虫,是一类典型的泌丝昆虫,每当家蚕化蛹之时都会吐丝结茧。在家蚕由蛹化蛾的这十天时间之中,蚕茧作为重要的防御屏障,在应对外界微生物入侵时发挥着极为关键的作用。那么蚕茧中到底有哪些组分能够抵御外界微生物的入侵呢?2013年,本实验室利用蛋白质组学的方法对蚕丝中的蛋白组分进行了鉴定,发现蚕丝中除了有丝素和丝胶外,还存在很多蛋白酶抑制剂、酶和未知功能蛋白。之前的研究已经证明了蚕丝中的蛋白酶抑制剂和seroin蛋白具有抑制微生物生长的活性。蚕丝中是否还存在有其他类型的抗菌蛋白质呢?蚕丝中抗菌蛋白的研究对于阐明昆虫防御病原微生物的系统以及开发具有抗菌功能的蚕丝都有着非常重要的意义。我们前期的研究中从蚕茧中鉴定到一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP）,发现其在蚕丝中的含量非常高,果蝇中的同源蛋白可以通过激活免疫途径来发挥功能。果蝇中PEBP的过表达可以帮助幼虫抵御细菌的感染,提高幼虫的成活率。然而,目前没有证据表明果蝇的PEBP可以直接抑制微生物的生长,且果蝇中PEBP参与免疫的具体机制仍不清楚。本研究期望阐明家蚕PEBP（BmPEBP）蛋白的生物学功能,解析BmPEBP蛋白在蚕丝中发挥功能的具体机制。我们从序列与进化、表达与分布特征、抗菌活性与机制等几个方面对BmPEBP进行了研究。主要研究结果如下:1、BmPEBP的基本信息分析我们从silkDB中获取得到BmPEBP蛋白的氨基酸序列并在NCBI中进行检索。利用生物信息学分析方法对昆虫、植物、哺乳动物中PEBP蛋白进行了系统进化及序列比对分析。发现昆虫、植物和哺乳动物的PEBP蛋白明显聚类为三支,昆虫中PEBP蛋白在序列组成上高度保守;与植物和哺乳动物中的PEBP蛋白明显的不同之处主要体现在很多昆虫的PEBP含有信号肽,而植物和哺乳动物的PEBP蛋白都不含有信号肽,表明昆虫的PEBP蛋白在进化过程中获得了分泌到细胞外的能力。2、BmPEBP的原核表达、纯化及生化分析根据BmPEBP的ORF序列设计引物并进行PCR扩增,把扩增得到的片段连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组表达质粒pET28a-PEBP。随后转化到表达菌株BL21（DE3）,经过诱导表达,在16℃上清中获得了含His标签的可溶性蛋白。经过镍柱亲和层析以及凝胶过滤层析获得纯度达到95%以上的重组BmPEBP蛋白。利用圆二色谱分析BmPEBP蛋白的二级结构,结果显示在常温状态下BmPEBP蛋白的二级结构主要以β折叠为主,为了验证BmPEBP酸碱稳定性,我们利用圆二色谱光谱对BmPEBP蛋白在pH值3到11这个范围内的二级结构进行分析,发现在此区间BmPEBP的结构也处于一个较为稳定的状态。温度稳定性研究发现当温度升高到60℃时,BmPEBP蛋白开始发生降解。3、BmPEBP的表达特征研究我们利用荧光定量PCR对BmPEBP基因的表达模式进行了检测。组织表达谱发现BmPEBP基因在5龄第3天的丝腺中大量表达。时期表达谱进行分析发现BmPEBP基因在5龄第5天和5龄第7天高量表达。利用Western blot的方法,发现5龄第7天BmPEBP蛋白主要存在于家蚕丝腺的中部;对蚕茧进行分层处理后,发现BmPEBP蛋白从蚕茧的外层到内层含量逐渐减少。利用免疫荧光的方法发现BmPEBP蛋白分布于单根蚕丝的最外层。因此,我们推测BmPEBP蛋白主要在家蚕5龄期的中部丝腺中合成,分泌到蚕丝的丝胶层中。4、BmPEBP的抗菌机制研究为了检测BmPEBP蛋白是否具有抑菌活性。我们选取了两种细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）和四种真菌（白色念珠菌、酿酒酵母、球孢白僵菌、烟曲霉菌）,对BmPEBP的抑菌能力进行了研究。荧光定量PCR和Western blot结果表明BmPEBP在微生物诱导后会在脂肪体和血淋巴中有部分的上调。抑菌动力学曲线表明BmPEBP对白色念珠菌、酿酒酵母、球孢白僵菌和烟曲霉菌这四种真菌有较好的抑制作用,而对细菌基本没有抑制活性。圆二色谱结果显示磷脂酰乙醇胺（PE）能够影响BmPEBP的二级结构,使得其由β折叠向α螺旋转变。结合实验表明BmPEBP能够和磷脂酰乙醇胺（PE）发生特异性结合。通过进一步的研究分析,我们发现BmPEBP与白色念珠菌或酿酒酵母进行孵育后,BmPEBP能够附着于这两种真菌,初步表明BmPEBP是附着在菌体周围来发挥抑菌作用。由于磷脂酰乙醇胺是真菌细胞膜的重要组成成分,我们推测BmPEBP可能通过作用于真菌的细胞膜来发挥抑菌功能。

论文目录

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 抗菌蛋白和抗菌肽

1.2 昆虫中抗菌蛋白和抗菌肽

1.2.1 抗菌肽

1.2.2 凝集素

1.2.3 溶菌酶

1.3 家蚕中的抗菌肽

1.3.1 家蚕抗菌肽的分类

1.3.2 家蚕抗菌肽的抑菌功能及抗菌机理

1.4 家蚕蚕丝中的抗菌蛋白

1.5 PEBP蛋白的研究进展

第2章引言

2.1 研究背景、目的及意义

2.2 研究内容

2.3 研究技术路线

第3章 BmPEBP的生物学信息分析

3.1 实验方法

3.1.1 BmPEBP的 BLAST

3.1.2 BmPEBP的序列分析

3.2 实验结果

3.2.1 PEBP的系统发生分析

3.2.2 PEBP蛋白的序列同源性比对

3.2.3 BmPEBP蛋白的序列分析

3.3 讨论

第4章 BmPEBP的原核表达、纯化及生化分析

4.1 实验材料与仪器试剂

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验试剂

4.1.4 主要溶液配制

4.2 实验方法

4.2.1 引物设计

4.2.2 目的基因的获取

4.2.3 载体构建

4.2.4 诱导表达

4.2.5 蛋白纯化

4.2.6 二级结构及热稳定性分析

4.3 结果与分析

4.3.1 BmPEBP原核表达载体的构建

4.3.2 BmPEBP重组蛋白的表达

4.3.3 BmPEBP重组蛋白的纯化

4.3.4 BmPEBP蛋白质谱鉴定和抗体检测

4.3.5 BmPEBP的二级结构及其耐热性分析

4.3.6 BmPEBP的三维建模

4.4 讨论

第5章 BmPEBP的表达特征分析

5.1 实验材料与仪器试剂

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验仪器

5.1.3 实验试剂

5.1.4 主要溶液配制

5.2 实验方法

5.2.1 荧光定量PCR

5.2.2 提取各组织总蛋白

5.2.3 Western blot

5.2.4 免疫荧光定位蚕丝中的BmPEBP

5.3 结果与分析

5.3.1 Bm PEBP在丝腺中特异表达

5.3.2 Bm PEBP在五龄分段丝腺表达特征

5.3.3 BmPEBP在五龄第七天中部丝腺高量表达

5.3.4 BmPEBP在在蚕茧和蚕丝中的定位

5.4 讨论

第6章家蚕BmPEBP的抗菌活性及抑菌机理探究

6.1 实验材料与仪器试剂

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验仪器

6.1.3 实验试剂

6.1.4 主要溶液配制

6.2 实验方法

6.2.1 荧光定量-PCR检测微生物诱导BmPEBP在脂肪体的表达水平

6.2.2 Western blot检测微生物诱导BmPEBP在血液的表达水平

6.2.3 细菌活性抑制率的测定

6.2.4 真菌活性抑制率的测定

6.2.5 个体注射对球孢白僵菌抑制活性测定

6.2.6 圆二色谱扫描

6.2.7 ELISA测定结合信号

6.2.8 免疫荧光检测结合信号

6.2.9 Western blot检测BmPEBP信号

6.2.10 免疫荧光定位

6.3 实验结果与分析

6.3.1 Bm PEBP被微生物诱导在脂肪体中上调表达

6.3.2 BmPEBP被微生物诱导在血液中上调表达

6.3.3 BmPEBP对真菌孢子生长的抑制作用

6.3.4 BmPEBP抑制球孢白僵菌在家蚕体内的生长

6.3.5 BmPEBP的二级结构受PE的影响

6.3.6 BmPEBP与 PE的结合具有梯度依赖性

6.3.7 BmPEBP与 PE的相互作用

6.3.8 BmPEBP与白色念珠菌、酿酒酵母的结合

6.4 讨论

第7章综合与讨论

参考文献

在读期间发表论文及参研课题

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汤沐亚

导师: 赵萍,董照明

关键词: 家蚕,磷脂酰乙醇胺结合蛋白,表达谱,抑菌机制

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q965

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蚕丝磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的抗真菌功能研究

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