张静[1]2003年在《PTEN基因突变在散发性大肠癌发生发展中的作用》文中研究表明目的 研究散发性大肠癌(sporadic colorectal cancer，SCRC)组织中抑癌基因PTEN突变高发区外显子5、7和8的突变情况，探讨PTEN基因突变与人类大肠癌基因不稳定性间的关系，以进一步研究大肠癌的分子遗传学发病机制。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)、PCR结合单链构象多态性(PCR-SSCP)技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色方法，对34例散发性大肠癌患者的癌组织及其癌旁组织的PTEN基因第5、7和第8外显子突变情况和Bat25、Bat40及D18S21共3个微卫星位点的改变情况进行检测分析。 结果 ①34例大肠癌组织中有2例检测到PTEN基因突变，突变率为5.88％(2／34)，其中exon7突变1例，exon8A突变1例，34例癌旁组织未检测到突变，差别无显着性(P＞0.05)；②低分化腺癌及黏液癌组织中PTEN基因突变的发生率为125％(2／16)，中、高分化腺癌中，PTEN基因突变的发生率为0，二者差异无显着性(P＞0.05)；③34例大肠癌组织中有7例(20.59％)发生了至少两个位点的微卫星改变，视为阳性个体组，其中1例有3个位点发生改变，6例有2个位点发生改变；34例癌旁组织未检测到微卫星改变(0％)，差别有统计学意义(P＜0.01)；④微卫星改变阳性个体组中PTEN基因突变发生率为28.57％(2／7)，差别有统计学意义(P＜0.05)。中文摘要 结论①PTEN基因的突变可能与大肠癌的发病有关;②PTEN基因突变在大肠癌的发展和恶化中可能起到一定的作用;③大肠癌中PTEN基因的突变与微卫星改变明显相关。
张静, 滕蕾, 战玉竹[2]2006年在《散发性结直肠癌PTEN基因突变与微卫星改变间的关系》文中研究指明背景与目的:研究散发性结直肠癌(Sporadiccolorectalcancer,SCRC)组织中抑癌基因PTEN突变高发区外显子5、7和8的突变与人类结直肠癌基因不稳定性间的关系,以进一步研究结直肠癌的分子遗传学发病机制。材料与方法:采用聚合酶链反应(PCR)、PCR结合单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对68例散发性结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织的PTEN基因第5、7和第8外显子突变情况和结直肠癌高度敏感的微卫星检测位点Bat25、Bat40及D18S21的改变情况进行检测分析。结果:微卫星改变阳性个体组中PTEN基因突变发生率为28.57%(4/14),与微卫星改变阴性个体组中PTEN基因突变发生率相比较,差异有统计学意义χ2=8.06,P<0.01,。结论:PTEN基因的突变在微卫星不稳定性结直肠癌的发生发展中产生一定的作用。
郑国宝[3]2002年在《抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及其意义》文中进行了进一步梳理结直肠癌是我国较常见、危害性较大的恶性肿瘤之一，近年来，大肠癌的发病率呈上升趋势，其发生和发展是一多基因参与和受多因素影响的复杂过程。虽然国内外学者在大肠癌的基础理论和临床研究方面做了大量工作，并取得了很大进展，但值得注意的是，大肠癌病因学的研究仍无明确定论，发病机制尚未得到实质性阐明，实行根治性手术后，五年生存率远不理想；因此，从分子水平上研究大肠癌的发病机制，寻找与大肠癌发病关系更为密切的致病基因并开辟一条大肠癌生物治疗的新途径就具有很大的现实意义。 对抑癌基因的研究已成为目前癌症研究的热点，至今已发现十余种抑癌基因，新发现的抑癌基因还在不断增加。PTEN自1997年3月被国际上叁个研究小组相继独立地克隆后立即成为细胞信号转导、分子生物学和肿瘤病理学等领域的研究热点，是继p53基因发现之后的又一个“明星分子”。该基因编码一种具有双重特异性的磷酸酶，在PTEN的第122-133位的氨基酸序列（IHCKAGKGRTG）符合蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酶的崔化序列（HCXXGXGRXG），是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，许多学者对该基因进行了多层次全方位的深入的研究，结果表明，PTEN通过对细胞内蛋白质磷酸化水平进行精细调节，影响细胞的生长，增殖，分化，凋亡、粘附和迁移等许多重要生物学行为。1997年以前，人们一直没有找到蛋白磷酸酶与肿瘤形成有直接关系的证据，PTEN作为一个抑癌基因的发现，表明了蛋白磷酸酶活性的降低可以引起肿瘤的发生。根据目前的研究结果，PTEN主要通过其脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的作用分别抑制细胞内FAK和PI3K两条信号转导通路来实现其抑癌作用。而且认为，PTEN的脂质磷酸酶功能是其主要功能。目前已有人克隆出PTEN剔除的乳腺癌细胞，并且，PTEN蛋白的晶体结构已被确定，这给PTEN基因及蛋白的研究提供了良好的基础。<WP=5>目前的研究认为，PTEN基因的突变或PTEN蛋白的低表达（或缺失表达）与很多恶性肿瘤如神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肺癌等的发生密切相关，而且该基因的缺失表达是全身多种遗传性肿瘤综合征（如Cowden Disease,JPS综合征等）的主要致病因素。然而对于在大肠癌发生发展及转移过程中是否有PTEN基因表达水平的改变，以及这些改变在上述过程中所起的作用，目前报道较少，结果很不一致。本文旨在通过应用Northern Blot、Western Blot、免疫组织化学技术以及基因转染技术，从mRNA、蛋白质和细胞水平上分析大肠癌组织PTEN基因表达水平的改变，进一步阐明PTEN基因在大肠癌发生发展及转移过程中的可能作用及其作用机制。采用免疫组化和Northern杂交结果显示：PTEN mRNA在大肠癌组织内的表达水平平均显着低于对应的癌旁组织内表达水平。进一步的分析发现，PTEN 5.5kb的转录子表达水平降低与血清中CEA水平、恶性程度分级、Duckes分期呈负相关(p<0.05)，而与年龄、肿瘤大小、组织类型、浸润深度无显着相关性；2.4kb和4.4kb的转录子表达水平降低与血清中CEA水平、恶性程度分级、组织学类型、Duckes分期呈显着负相关(p<0.05)，与年龄、浸润深度、肿瘤大小无显着相关性；1.8kb转录子表达水平的降低只与大肠癌的Duckes分期呈显着负相关(P<0.05)，与其它病理学指标无显着相关性。以2.4kb为参照标准，47例大肠癌标本中，38例表达低于对应的癌旁大肠粘膜（80.85%）。PTEN蛋白在大肠癌旁组织中的阳性率为100%，在大肠癌组织中阳性表达率为76.60%，进一步分析表明，PTEN蛋白在大肠癌组织中表达降低与大肠癌的Duckes分期、淋巴结转移及血清CEA水平呈显着负相关(p<0.05)，而与患者年龄、肿瘤大小、组织类型、肿瘤的恶性程度分级、浸润深度等无相关性(P<0.05)。用基因转染技术将PTEN基因瞬时转染大肠癌细胞株LOVO后，采用计数细胞悬液加到粘附底物后20 min和120 min的细胞贴壁数用以测定细胞粘附的结果显示：转染了pcDNA3.0及pcDNA3.0-PTEN的LOVO细胞在非特异性粘附底物上20 min、120 min后的贴壁率均与对照细胞LOVO无显着性差异。而在特异性粘附底物Laminin上，LOVO、LOVO/pcDNA3.0、LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞在20 min时贴壁率分别为18.6％ ( 1.4％、18.2％ ( 1.8％和13.9％ ( 0.48%，在加入细胞后的120 min时，细胞的贴壁率分别为71.2％ ( 2.5%、69.3％ ( 1.3%<WP=6>和56.0％ ( 1.6%，统计学处理表明，LOVO/pcDNA3.0－PTEN细胞在特异性粘附底物（Laminin）上的贴壁率显着低于对照细胞LOVO、LOVO/pcDNA3.0细胞的贴壁率。结果提示：PTEN基因可显着抑制LOVO细胞在特异性粘附底物上的粘附能力，其抑制粘附的作用可能是影响细胞表面的特异性粘附分子与特异性的细胞外基质的相互作用所致。采用Costar的浸润小室对LOVO、LOVO/pcDNA3.0、LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞的浸润能力分析结果显示：细胞悬液静置培养6小时后，对照细胞LOVO浸润穿透多聚碳膜的细胞数为11.7 ( 1.74个，LOVO/pcDNA3.0细胞穿透多聚碳膜的细胞数为11.3 ( 1.24个，而LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞穿透多聚碳膜的细胞数为7.5 ( 1.58个。统计学处理表明，LOVO/pcDNA3.0-PTEN细胞浸润能力显着低
朱宏伟[4]2008年在《散发性胃癌BRCA1抑癌基因突变的研究》文中认为目的研究BRCA1抑癌基因第2外显子,第11外显子和第20外显子在胃癌中的突变情况,探讨其与胃癌发病的关系。方法采用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析)结合银染的方法,对45例无血缘关系的胃癌患者BRCA1抑癌基因第2、11、20外显子进行突变检测。结果在外显子2、11、20的序列中未发现有突变。结论在Ashkenazi犹太妇女中发现的两个突变热点185delAG和5382insC以及在家族性乳腺癌中报道较多3232A→G(导致1038号密码子由Glu变为Gly)这叁个突变点,可能对中国人群散发性胃癌的发生影响不大,有待于继续研究探讨中国散发性胃癌与BRCA1抑癌基因突变的关系。
虞舒静[5]2009年在《基于通路的大肠癌预后标志物寻找及SPARCL1抑制转移的研究》文中认为大肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国及西方发达国家其发病率及死亡率均居恶性肿瘤谱前列,且发病率有逐年增高趋势。近年来,传统治疗手段不断发展,生物靶向治疗新药不断研发,但大肠癌的生存率仍改善不明显,五年生存率仅63.4%左右。影响大肠癌预后的因素,主要是局部复发和远处转移。在大肠癌远处转移事件中,肝脏是最主要的转移部位,肝转移也是大肠癌病人治疗失败的主要原因之一。如何临床预测及早期干预肝转移的发生发展,是一个亟待解决的问题。近年来Vogelstein等对大肠癌组织进行了DNA突变分析,发现其中突变较高的几个基因都属于PI3K这条信号传导通路,首次启示我们,肿瘤的基因改变是以通路为单位的,只有从通路出发,才能更科学、更系统、更准确的寻找到合适的标志物。而后在《SCIENCE》上,Vogelstein等又公布了其检测的大肠癌组织中38个组或通路共约140个基因的突变频率,这为我们后续研究大肠癌肿瘤标志物提供了选择的依据。研究目的:1.寻找大肠癌预后相关的标志物,为后续研究大肠癌转移提供线索,并作为潜在的干预靶点2.建立大肠癌预后相关标志物组合优化模型,预测病人预后,指导临床诊治3.明确大肠癌预后及转移相关标志物SPARCL1(Secreted protein acidic and rich incysteine like 1)和其相关分子OPN(Osteopontin)、SPARC(Secreted protein acidicand rich in cysteine)在大肠癌肝转移过程中的作用4.明确SPARCL1重组蛋白抑制大肠癌细胞的作用及机制,能否作为大肠癌抗转移治疗的候选靶点基于信号通路的大肠癌预后相关标志物的寻找基于通路水平,选择上述Vogelstein文中所列大肠癌中基因突变频率较高的3个基因(P53、APC、KRAS)及11条通路(cadherins,axonal guidance,skeletal muscledevelopment,cell-matrix interactions,attractive and repulsive receptors,cytoskeletalremodeling,FSH-beta signaling pathway,Synaptogenesis,GnRH signaling pathway,connective tissue degradation,response to DNA damage stimulus)作为基础,确定了与这些通路及肿瘤均有一定相关的14个标志物(P53、APC、P21~(ras)、E-cadherin、endothelin B receptor、Shp2、ADCY-2、SPARCL1、neuroligin1、hsp27、mmp-9、MAPK(ERK)、MSH2、Rho)作为研究对象;对156例大肠癌病人进行了叁年以上的随访,并将其手术切除的大肠癌组织制备成组织芯片,应用免疫组化的方法研究上述标志物的表达水平,结合分析其与患者的预后生存情况及多个影响预后的临床病理特征之间的相关性。分析结果显示,与大肠癌不同生物学特征显着相关的标志物有所重复又略有不同:与生存情况显着相关的标志物是SPARCL1、Shp2、MSH2、E-cadherin、P53、ADCY-2、MAPK。这7个标志物中,SPARCL1、Shp2和MSH2与绝大多数临床病理特征及预后情况均呈显着相关,它们的高表达提示着病人较好的预后;SPARCL1是唯一与远处转移显着负相关的标志物;P53主要与TNM分期显着相关;E-cadherin和MAPK主要与术后复发转移显着相关。而其它标志物,如endothelin B receptor、APC和Rho,仅与分化程度或分期相关。大肠癌预后相关标志物的组合及优化将前一部分中SPARCL1、MSH2、P53、MAPK(ERK)、E-cadherin、ADCY-2、Shp2这7个与预后显着相关的标志物,用生物信息学(支持向量机)分析方法对预后标志物进行组合及优化。结果发现,SPARCL1和P53的组合是相对最佳的预后模型,其判别结果是独立于TNM分期的提示病人预后的因素(P＜0.001),尤其在Ⅱ、Ⅲ期病人中具有比传统分期更强的判断预后作用。SPARCL1及相关蛋白在大肠癌肝转移组织中的表达及作用本课题组之前对大肠癌原发灶与肝转移灶组织的基因表达谱芯片数据,应用整合基因染色体区带的生物信息学分析方法,得到差异最显着的染色体区带4q22,其中高表达的主要贡献基因为骨桥蛋白(Osteopontin,OPN),低表达的主要贡献基因为SPARCL1(Secreted protein acidic and rich in cysteine like 1)。关于骨桥蛋白基因,目前已有较多报道与大肠癌的肝转移关系密切。而SPARCL1的功能目前尚未完全明确。前一部分研究也发现,SPARCL1与大肠癌远处转移呈显着负相关,提示其可能在肝转移过程中发挥重要的作用。首先用免疫组化和实时荧光定量PCR方法检测了SPARCL1、OPN和SPARC在非转移性大肠癌、肝转移性大肠癌原发灶及配对的肝转移灶组织中的表达情况。免疫组化的检测发现,SPARCL1的表达在非转移性大肠癌明显高于肝转移性大肠癌原发灶组织(P＜0.05),而在大肠癌原发灶及其配对的肝转移灶组织间无显着性差异;OPN的表达在肝转移灶明显高于其配对的大肠癌原发灶组织(P＜0.05),而在非转移性大肠癌及肝转移性大肠癌原发灶组织间无显着性差异;SPARC的表达在非转移性大肠癌明显低于肝转移性大肠癌原发灶组织(P＜0.05),而在肝转移灶明显低于其配对的大肠癌原发灶组织(P＜0.05)。经实时荧光定量PCR验证,上述SPARCL1的差异在mRNA水平亦具有显着性意义,但SPARC、OPN的mRNA表达在各组间的差异尚不具显着性意义。另外,应用ELISA的方法检测了大肠癌病人血清中OPN、SPARC的浓度,发现血清中OPN和SPARC的含量在伴肝转移的大肠癌病人中均略高于不伴转移的病人,但其差异均无显着性意义。SPARCL1重组蛋白体外干预实验首先,使用western blot和RT-PCR方法证实叁种大肠癌细胞系RKO、SW480、SW620中无SPARCL1蛋白及mRNA的表达。然后,将特定浓度的SPARCL1重组蛋白加入细胞培养液中,用MTT法及细胞划痕实验分别检测SPARCL1重组蛋白对这叁种大肠癌细胞的增殖和迁移能力的影响。结果显示,SPARCL1重组蛋白对叁种大肠癌细胞增殖能力无显着性改变,但RKO细胞的迁移能力明显减弱(P＜0.05),而这种抑制作用在SW480、SW620中未能观察到。研究结论:1.基于肿瘤信号通路寻找标志物的思路具有科学性、系统性,且切实可行。2.从通路出发,发现SPARCL1、MSH2、P53、MAPK(ERK)、E-cadherin、ADCY-2、Shp2是与大肠癌预后及多种临床病理特征显着相关的肿瘤标志物。3.生物信息学方法分析证实,SPARCL1和P53的组合模型判别结果是独立于分期的判断病人预后的因素,而且在Ⅱ、Ⅲ期病人中具有比传统分期更强的判断预后作用。4.在组织中,SPARCL1的表达差异主要在伴/不伴肝转移的大肠癌原发灶组织中,提示SPARCL1表达的降低可能是发生在大肠癌肝转移过程中的早期事件,可以作为早期预测大肠癌肝转移的标志物。5.SPARCL1、OPN和SPARC在大肠癌原发灶及肝转移灶组织中的表达水平各异,提示这叁者在大肠癌肝转移过程中发挥着不同的作用。6.在体外实验中,观察到SPARCL1重组蛋白具有抑制大肠癌细胞迁移的能力,但对大肠癌细胞的增殖能力抑制不明显,提示SPARCL1是大肠癌的候选抗转移靶点。
张阳德, 陈辉[6]2002年在《抑癌基因PTEN及其与肠肿瘤的研究现状》文中研究指明肿瘤的发生是一个多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程 ,癌基因的功能增强与抑癌基因的突变或功能失活被认为是肿瘤发生的重要事件。最近发现的抑癌基因ＰＴＥＮ ,是至今为止发现的第一个具有双重特异性磷酸酶 (ＤＳＰ)活性和酪氨酸磷酸酶 (ＰＴＰ)活性的抑癌
万晓娟[7]2011年在《KLF6和WWOX蛋白在大肠癌组织中的表达及意义》文中认为背景与目的Kriippel样因子6(kruppel-like factor 6,KLF6)和包含氧化还原酶的WW域(ww domain-containing oxidoreductase, WWOX)是最近几年发现的两个抑癌基因。已有研究表明两者的低表达或表达缺失与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关,但是联合检测两者在大肠癌组织中的表达及其相关性的研究,国内外尚未见相关报道,并且两者在大肠癌发病过程中的作用机制尚未完全阐明。本实验通过检测KLF6蛋白和WWOX蛋白在大肠癌组织及正常大肠黏膜组织中的表达水平,分析KLF6、WWOX蛋白与大肠癌临床病理特征的关系以及KLF6和WWOX蛋白之间的关系,进而探讨两者在大肠癌发展、转移过程中的作用及其临床意义。方法1.采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)法,分别检测40例大肠癌组织及40例正常大肠黏膜组织中KLF6蛋白和WWOX蛋白的表达水平,并分析这两种蛋白的表达水平与年龄、性别、分化程度、浆膜浸润及淋巴结转移的关系以及二者表达的相关性。2.统计学方法应用SPSS16.0统计学软件对数据进行分析,阳性率之间的比较采用x2检验,两变量间的相关性采用Spearman关联性分析,检验水准α=0.05。结果1.免疫组化结果显示KLF6蛋白在40例大肠癌组织中的阳性表达率为45.0%(18/40),在40例正常大肠黏膜组织中的阳性表达率为82.5%(33/40)且差异具有统计学意义(P<0.05)2.KLF6蛋白的表达与大肠癌临床病理特征的关系KLF6蛋白在大肠癌组织中的表达与性别和年龄均无显着性差异(P>0.05),与肿瘤组织的分化程度、浸润深度及淋巴结转移均有显着性差异(P<0.05)。3.免疫组化结果显示wwox蛋白在40例大肠癌组织中的阳性表达率为37.5%(15/40),在40例正正常大肠黏膜组织中的阳性表达率为90.0%(36/40)且差异具有统计学意义(P<0.05)。4. WWOX蛋白的表达与大肠癌临床病理特征的关系WWOX蛋白在大肠癌组织中的表达与性别和年龄均无显着性差异(P>0.05),与肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移及浸润深度均有显着性差异(P<0.05)。5.统计学分析显示KLF6蛋白和wwox蛋白在大肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.320,P<0.05)。结论1.KLF6蛋白在大肠癌组织中低表达,且与肿瘤的分化、浆膜浸润及淋巴结转移相关,提示KLF6蛋白的低表达可能参与了大肠癌的发展及转移的过程。2. WWOX蛋白在大肠癌组织中低表达,且与肿瘤的分化、淋巴结转移及浆膜浸润相关,提示wwox蛋白的低表达可能在大肠癌的发展及转移过程中起着重要的作用。3.KLF6和wwox蛋白在大肠癌组织中的表达呈正相关,提示wwox可能通过某种机制来上调KLF6的表达,两者的低表达共同促进大肠癌的发展及侵袭转移,联合检测两者可能对大肠癌的诊断及恶性程度判断具有重要意义。
武丽萍[8]2016年在《p85β在p110α E545K结直肠癌发生中的作用机制及肿瘤标志物分析方法的研究》文中进行了进一步梳理研究目的癌症仍然是困扰人类的世界性医学问题,探讨癌症发生发展的分子机制对于认清癌症本质、攻克癌症难题具有非常重要的意义。同时,建立与肿瘤相关的生物标志物的检测方法,能为癌症的早期筛查提供重要的方法学基础。因此,本论文的研究目的有以下几个方面:(1)研究结直肠癌细胞IRS1和p110αE545K的特征及其对下游信号的影响,探究这两种蛋白在结直肠癌发生发展过程中的作用;(2)研究PI3K调节亚基p85β,在含有p110αE545K突变的结直肠癌中可能存在的新的生物学功能及其分子机制;(3)发掘发挥该生物学功能的关键基因信息,并探讨其与p85β生物功能的相关性;(4)建立检测与癌症发生相关的DNA氧化性损伤生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)和肿瘤标志物叶酸受体(FR1)的简便准确的分析方法,为癌症的早期诊断和筛查提供方法学基础。研究方法1.在人结直肠癌DLD1细胞和p110α只含有E545K突变型等位基因的DLD1细胞(以下简称DLD1 Mut-only细胞)的基础上,分别将IRS1基因敲除。利用蛋白印迹和表型分析的方法,比较敲除IRS1前后,细胞相关蛋白的表达水平变化及细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成的能力,探究IRS1对癌细胞的重要性。2.在DLD1 Mut-only细胞的基础上,构建p110αD933A突变及p110αE545K基因敲除细胞系。利用蛋白印迹和表型分析的方法,比较突变及敲除p110α前后,细胞相关蛋白的表达水平变化及细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成的能力,探究p110α对癌细胞的重要性。3.在人结直肠癌DLD1细胞、只含有野生型p110α等位基因的DLD1细胞(以下简称DLD1 WT-only细胞)、DLD1 Mut-only细胞、HCT116细胞、RKO细胞以及SW480细胞中,利用免疫共沉淀的方法,探讨p110α、IRS1、p85a及p85β的相互作用关系。4.在DLD1 Mut-only细胞基础上,将p85β基因敲除,构建p85βKO细胞系。通过表型分析(包括细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成、裸鼠异种移植瘤模型)研究p85β基因敲除前后细胞表型的变化,从而确定p85β的生物学功能。在此基础上,通过蛋白印迹技术研究与p85β生物学功能相关的分子机制。5.在DLD1 WT-only细胞、DLD1 Mut-only细胞、HCT116 WT-only细胞(p110α只含有野生型等位基因的HCT116细胞)、HCT116 Mut-only细胞(p110α只含有H1047R突变型等位基因的HCT116细胞)中,利用免疫荧光染色及激光共聚焦技术,确定p85β的细胞定位情况。6.利用“c NLS Mapper”预测p85β的关键核定位信息,在p85βKO细胞的基础上,构建HA标记的野生型p85β及HA标记的关键核定位信号突变的p85β过表达细胞系。通过免疫荧光染色及激光共聚焦技术,对预测得到的p85β的关键核定位信息进行验证。7.在DLD1基础上,利用CRISPR-Cas9技术构建关键核定位信号突变的p85β基因敲入细胞系。通过裸鼠异种移植瘤模型,在人结直肠癌DLD1亲代细胞上,验证与p85β致癌功能相关的关键基因信息。8.利用抗原抗体的特异性反应及免疫胶体金技术,通过吸光光度法建立与肿瘤相关的生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)的分析方法。9.利用抗原抗体的特异性反应及免疫胶体金技术,通过共振瑞利散射法建立肿瘤标志物叶酸受体(FR)的检测方法。研究结果在DLD1或DLD1 Mut-only细胞基础上,将IRS1基因敲除后,p110αE545K的蛋白表达也随之降低,而p85β的表达量不受影响。IRS1基因敲除后,下游p AKT表达量下降,而对MAPK信号通路无影响。敲除IRS1基因可以促进癌细胞发生自主性凋亡,抑制癌细胞的平板集落和软琼脂集落的形成能力,从而降低癌细胞的恶性程度。p110αE545K基因突变及敲除后,IRS1和p85β的表达量均不会受到影响,下游p AKT表达量下降,而对MAPK信号通路无影响。从表型分析结果看出,p110αE545K基因敲除也可以降低癌细胞的恶性程度。在DLD1 WT-only和DLD1 Mut-only两种癌细胞系中,p85a均结合在p110α上。在DLD1 WT-only癌细胞系中,p85β同时与p110α及IRS1相结合,发挥其调节亚基的作用。而在DLD1 Mut-only癌细胞系中,p85β从p110αE545K中解离下来,且解离下来的p85β也不再与IRS1发生相互结合。p85β从p110α解离下来的事实只特异于含有p110αE545K突变的细胞系,在其他人结直肠癌细胞中没有该现象。为研究p85β的生物学功能,我们在含有p110αE545K突变的人结直肠癌细胞系中构建了p85β基因敲除细胞系。p85β基因敲除后,癌细胞的凋亡数增加、平板集落和软琼脂集落数下降、在裸鼠两侧接种的异种移植瘤的形成能力降低。这些结果表明游离的p85β在含有p110αE545K突变的肿瘤细胞中也具有了一定的致癌活性。分子机制研究显示,p85β的该项功能可能与JNK/c-jun信号通路有关。通过免疫荧光染色对p85β进行细胞定位时发现,只有在含有p110αE545K突变的人结直肠癌细胞系中,解离下来的p85β进入了细胞核,而在其他细胞中,p85β均位于胞浆。对p85β的关键核定位信息分析显示,位于整个p85β氨基酸序列第477和478位的赖氨酸和精氨酸“KR”对p85β在p110αE545K突变型癌细胞中入核的行为非常关键。将这两个关键氨基酸突变成“AA”(两个丙氨酸),然后在p85βKO细胞基础上分别过表达野生型p85β和突变型p85β,发现野生型p85β质粒稳转后,p85β仍然入核;而突变型p85β质粒稳转后,p85β则在胞浆。裸鼠异种移植瘤模型结果表明,在人结直肠癌DLD1细胞基础上,将p85β基因的“KR”突变成“AA”后,癌细胞的成瘤能力明显减弱。以上结果说明,“KR”序列确实是p85β的关键入核信号,且该信号对p85β的致癌性能关系重大。另一方面,对与肿瘤相关的生物标志物8-OHd G的检测结果显示,免疫胶体金吸收波长红移的波长数和8-OHd G的浓度呈很好的线性关系,检测范围0.25-5.00mg/m L,最低检出限25 ng/m L。且随着8-OHd G的浓度的增大,胶体金的颜色从红逐渐变紫甚至变蓝,根据颜色的变化实现了8-OHd G的半定量可视化检测。透射电镜结果显示,波长的移动和颜色的变化与胶体金聚集状态有关。通过共振瑞利散射的信号增强和浓度之间的线性关系实现了对叶酸受体FR1的简单快速定量测定。线性范围0.50-37.50 ng/m L,最低检出限0.05 ng/m L。利用共振瑞利散射作为响应信号,大大提高了检测方法的灵敏度。结论在结直肠癌分子机制的研究中,我们发现IRS1及p110αE545K对于DLD1癌细胞形成的肿瘤的发生发展至关重要,二者通过AKT信号通路发挥致癌作用。在含有p110αE545K突变的人结直肠癌DLD1细胞中,p85其中的一种亚型p85β从p110αE545K蛋白上特异性地解离下来,解离下来的p85β也不再与IRS1结合。游离的p85β特异性的进入了含有p110αE545K突变的DLD1癌细胞的细胞核中。入核后的p85β本身也具有了一定的致癌活性,且p85β的入核行为及致癌活性与其序列中位于第477位和478位的“KR”具有重要相关性。在与肿瘤相关的生物标志物的分析方法方面,我们成功建立了两种标志物(8-OHd G和FR1)的检测方法,该方法具有快速方便,操作简单,选择性好等优点。本论文的创新性(1)发现了不与p110α结合的独立的p85β的新的生物学功能,并揭示了发挥该新生物学功能的关键基因信息,为肿瘤药物设计筛选和临床治疗提供一个极具前景的新靶点。(2)建立了两种与肿瘤相关的生物标志物的简单快速的分析检测方法,为癌症的早期诊断提供重要的方法学理论依据。局限性及未来计划本文仍存在局限性,表现在:(1)对基于DLD1构建的p85βKR突变基因敲入细胞的表型分析不够全面;(2)对可能影响p85β生物学功能的分子机制的研究不够深入明晰;(3)实验建立的对8-OHd G的检测方法的灵敏度有待进一步提高。针对以上不足,未来将对实验进行完善和优化。(1)对p85βKR突变基因敲入细胞进行多种表型分析,如细胞凋亡、集落形成及软琼脂等实验;(2)查阅文献,进一步分析研究影响p85β生物学功能的下游信号通路,找到能合理解释p85β致癌活性的分子机制;(3)尝试对纳米材料进行其他修饰表征,提高检测指标的灵敏度。
李晓玲[9]2003年在《大肠癌、胃癌PTEN基因编码蛋白表达及其相关因素的研究》文中认为前言 胃癌、大肠癌是消化道发病率很高的两个恶性肿瘤，且发病率和死亡率呈上升趋势。肿瘤细胞生长的无限性和浸润转移是肿瘤的最重要特征，是胃癌、大肠癌治疗失败导致死亡的主要原因。而肿瘤细胞的生长及浸润转移受多种癌基因和抑癌基因的调控。 PTEN是近年来发现的肿瘤抑制基因，编码一种具有蛋白磷酸酶和磷酸酯酶双特异性功能的蛋白质。其磷酸酯酶功能是使PIP3去磷酸化，而PIP3是胰岛素和表皮生长因子等细胞生长因子及其受体在细胞内的第二信使。PTEN通过降低PIP3水平，抑制AKT活性，从而抑制细胞生长、促进细胞凋亡。PTEN的蛋白磷酸酶活性是使FAK去磷酸化，FAK是整合蛋白介导的信号传导和细胞周期进展的关键分子，PTEN通过抑制FAK介导的细胞浸润、转移及生长，从而抑制肿瘤的浸润和转移。有研究显示PTEN在大肠癌及胃癌中均有不同程度的表达降低或缺失。 EGFR/erbB-1、HER2/erbB-2是Ⅰ型RTKs成员，具有内源性酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，这种激酶活性决定细胞多种生物学功能如细胞生长、分化、运动及生存等。EGFR家族的主要信号传导通道是Ras-raf-MAP-kinase通道，另一个重要通道是通过PI-3-Kinase和其下游的蛋白激酶Akt(PKB)通道。当受体与高亲和性的配体结合后，EGFR形成同二聚体或与EGFR家族其它成员形成异二聚体，导致内源性酪氨酸蛋白激酶激活，酪氨酸自磷酸化，最终引起一系列反应，将信息传递给细胞内的转录因子从而影响相关基因的功能。由于表皮生长因子受体家族是细胞信号传导的中心环节，认识到针对信号传导异常环节进行治疗的重要性及可行性。目前，一些针对1型受体酪氨酸激酶的靶向治疗已应用于临床，因而确定癌组织酪氨酸激酶受体表达及基因状况，筛选适于该项治疗的病例，实施个体化的治疗显得尤为重要。 ECD是介导同质细胞间黏附的一组跨膜糖蛋白，主要分布在上皮细胞，是建立与保持上皮细胞极性和细胞间紧密连接的关键分子。钙粘蛋白表达增高，癌细胞间连接紧密，使癌细胞不易脱落转移，当其表达下调或缺失时将使同型细胞无法相互粘连，这有利于肿瘤浸润性生长与转移。已有研究表明ECD异常表达与胃癌的进展有关。目的 观察大肠癌刊飞N基因编码蛋白产物表达以及EGFR、C一erbB一2蛋白表达及其基因扩增状态。比较分析大肠癌PTEN蛋白表达与EGFR、C-ethB一2表达的关系，探讨基因扩增在预测大肠癌靶向治疗的意义。另外对参与浸润转移的重要细胞毅附因子ECD及川下N蛋白在胃癌组织中表达的研究，探讨其在胃癌浸润转移中的作用及与胃癌生物学行为和预后的关系，期望发现预测胃癌浸润转移的分子生物学指标，为临床治疗提供科学依据。方法 收集122例大肠癌术后病例资料及常规石腊包埋标本，采用SABC方法检测大肠癌组织中PTEN、EGFR、C一ethB一2蛋白的表达。应用双色标记的FISH方法对EGFR、C一erbB一2免疫组化染色阳性的20例大肠癌标本进行基因扩增检测，随机选择10例阴性病例做为对照进行EGFR、C-erbB一2的FISH分析。另收集100例外科手术切除胃癌石腊包埋标本，采用SABC方法检测胃癌组织PTEN蛋白及ECD的表达。结果 1.PTEN蛋白在正常大肠粘膜上皮细胞中均呈阳性表达。癌细胞中表达部位一般在细胞核及细胞核膜上，少数病例同时有细胞浆的阳性表达，PTEN异常表达率为65.57%，其中表达下调率为58.20%，表达缺失率为7.38%。这种异常表达与大肠癌组织学类型、Dukes分期及淋巴结转移密切相关(p<0.05)。 2.在大肠癌组织中，EGFR蛋白可在细胞浆及细胞膜中表达，阳性表达率为44.26%，膜表达率为n.48%。多数阳性表达的癌细胞常呈巢状分布，EGFR表达与肿瘤组织学类型密切相关(P<0.05)，但与PTEN蛋白表达无密切相关关系(P>0.05)。而只有3例C一ethB一2呈阳性表达，阳性率为2.46%。其中2例为高水平表达，且伴PTEN蛋白表达明显下调。 3.对17例大肠癌IHC检测EGFR呈膜表达及部分胞浆表达的病例进行FISH分析，在仅有的一例IHC3+病人癌组织中，可见EGFR基因扩增，且DM、HSR两种不同形式的扩增同时存在;9例IHCZ+病例中，有两例可见核内多倍染色体信号，无基因扩增。其余7例同正常粘膜上皮细胞，未见基因扩增。 另外，对C一erbB一2免疫组化结果阳性的叁例进行FISH分析后，显示强阳性表达的2例均呈HSR形式基因扩增，IHCI十者无基因扩增。 4.PTEN蛋白、ECD在非癌胃戮膜中均呈阳性表达。胃癌组织中lyTEN蛋白低于周围正常胃豁膜，蛋白缺失率为59.0%。弥漫型胃癌PTEN蛋白缺失率(65.71%)明显高于肠型胃癌(43.33%)(P<0.05);伴有淋巴结转移的胃癌组织中的缺失率(64.47%)明显高于无淋巴结转移的胃癌(41.67%)(P<0.05);盯EN蛋白缺失患者比阳性表达患者预后差(P二0.0066)。 ECD在胃癌组织中异常表达率为42 .0%，弥漫型胃癌ECD异常表达率(48 .57%)明显高于肠型胃癌(26 .67%)(P<0.05);ECD异常与胃壁浸润深度有关(P<0.05)。结论 1.盯EN蛋白异常表达与大肠癌发生、发展密切相关，可做为大肠癌预后判断的一个重要分子生物学?
常争艳[10]2014年在《全外显子测序筛选及验证结肠癌相关基因突变》文中提出目的：通过全外显子捕获测序技术整体、动态、定量地筛选与结肠癌发生发展相关的基因种类及其突变位点,依托高通量测序和Sanger测序技术,结合功能基因组的研究、蛋白质互相作用及信号通路数据库的分析,以期待找到在结肠癌进程中起关键作用的基因及基因所在信号通路,从而可系统地揭示结肠癌发生发展的机制,为结肠癌的早期诊断、个性化治疗和预后预测奠定理论基础。方法：1.收集外科手术切除的结肠癌组织和配对的正常结肠组织标本,利用DNApurification kit提取组织基因组DNA,并用极微量分光光度计测定DNA质量和浓度；利用美国哈佛大学医学院Illumina二代测序平台,对于每个捕获文库进行了独立测序并通过生物医学应用软件分析找出二样本之间的差异基因突变位点；2.基于相应的基因突变位点根据NCBI的基因库基因序列信息和Primer5引物设计软件进行引物设计；再优化PCR扩增条件,进行PCR扩增,电泳鉴定PCR扩增产物大小,将合格的产物进行Sanger测序；将测序结果采用mutation survary和Chromas软件读取图谱碱基序列,结合相应位点对应的氨基酸编码序列与高通量测序结果比对,确定基因点突变的情况；3.对筛查出的差异基因进行David基因功能分析、KEGG信号转导通路分析和String蛋白之间互相作用分析,找寻找出与结肠癌发生发展相关的关键基因及其所在信号通路。结果：1.高通量全外显子测序的结肠癌组织和配对的正常结肠组织的基因进行相关生物医学软件的分析后,筛选出851个无义突变和错义突变位点；2.在验证出的215个突变位点所在的基因中,PIK2B、CACNA1D、CAMK2A、 FSHB、ITPR1、ITPF2、ITPR3、MAP2K2、PLCB3九个基因分布在GnRH signaling pathway中；而APC2、AXIN2、TCF7、TCF7L2、TGFBR2、TP53等十四个基因分别分布在colon cancer pathway的七个主要的信号转导通路中。结论：应用David、KEGG、String网络软件对基于Sanger测序及下一代测序检测出突变基因的初步筛选与结肠癌潜在相关基因进行功能、pathway、蛋白之间互相作用分析,初步揭示了结肠癌的发生发展的可能机制,为结肠癌早期诊断、个体化治疗和预后预测奠定了理论基础。
参考文献：
[1]. PTEN基因突变在散发性大肠癌发生发展中的作用[D]. 张静. 青岛大学. 2003
[2]. 散发性结直肠癌PTEN基因突变与微卫星改变间的关系[J]. 张静, 滕蕾, 战玉竹. 癌变.畸变.突变. 2006
[3]. 抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及其意义[D]. 郑国宝. 第二军医大学. 2002
[4]. 散发性胃癌BRCA1抑癌基因突变的研究[D]. 朱宏伟. 内蒙古科技大学包头医学院. 2008
[5]. 基于通路的大肠癌预后标志物寻找及SPARCL1抑制转移的研究[D]. 虞舒静. 浙江大学. 2009
[6]. 抑癌基因PTEN及其与肠肿瘤的研究现状[J]. 张阳德, 陈辉. 中国现代医学杂志. 2002
[7]. KLF6和WWOX蛋白在大肠癌组织中的表达及意义[D]. 万晓娟. 郑州大学. 2011
[8]. p85β在p110α E545K结直肠癌发生中的作用机制及肿瘤标志物分析方法的研究[D]. 武丽萍. 第叁军医大学. 2016
[9]. 大肠癌、胃癌PTEN基因编码蛋白表达及其相关因素的研究[D]. 李晓玲. 中国医科大学. 2003
[10]. 全外显子测序筛选及验证结肠癌相关基因突变[D]. 常争艳. 湖南农业大学. 2014
标签：肿瘤学论文; 大肠癌论文; 基因突变论文; 癌症论文; 癌细胞论文; 肿瘤论文; 胃癌论文; 抑癌基因论文; pten基因论文;