张静波[1]2004年在《慢性持续性乙肝病毒感染表位特异性CTL的功能研究》文中研究表明尽管预防性乙肝病毒(1aepatitis B virus,HBV)疫苗已经在全球广泛应用,慢性持续性感染仍然是重要的健康问题。目前全世界慢性HBV感染已经超过3.6亿人,乙肝相关的肝硬化和肝癌的死亡率正逐年增加。因此,明确:HBV感染的慢性化机制,设计更为有效的治疗性疫苗是当前刻不容缓的问题。 HBV病毒作为嗜肝的DNA病毒,本身对肝细胞并没有损害。MHC—I类分子限制性的CD8 T细胞即细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在清除胞内乙肝病毒和肝细胞的损伤中均起关键作用。CTL通过对病毒相关抗原表位的识别、活化,经穿孔素/颗粒酶依赖的途径杀伤靶细胞,或通过Fas/FasL 途径启动靶细胞的凋亡;以及通过细胞因子释放的非细胞毒途径如IFN.Y等抑制病毒的复制。近年来研究发现细胞因子释放的非细胞毒途径在清除HBV中可能起更为重要的作用,使传统的细胞毒途径占主导地位的学说受到了挑战。 现代技术的发展尤其是MHC-I类分子限制性表位肽/四聚体复合物(Tetramericcomplex)即tetramer技术的产生,可以将表位特异性的CTL进行精确定量,为我们探讨CTL 与肝损害及控制病毒复制之间的关系提供了可能性。 Fetramer技术结合胞内因子染色和表型分子的检测,近年来使人们对CTL 的认识迅速达到单个细胞水平,并从T细胞分化的角度对慢性持续性病毒感染的发生机制有了全新的认识。目前T细胞分化有两种模式:(1)基于CCR7等归巢到淋巴组织相关受体分子的表达,分中心性记忆细胞(central memory T cell,’rcM)和效应性记忆细胞(effector memory T cell,TEM)。TcM表达CCR7,缺乏迅速反应的效应功能,但能对细胞因子或病原进行快速的反应并成熟为TEM,失去CCR7的表达,获得组织归巢受体,并大量分泌细胞因子。 (2)基于共刺激分子CD27和CD28的表达,结合CD45RA,将是否表达CD27、CD28划分为早期、中期及晚期分化状态。表现为初始型(CD45RA CD27 CD28 )、 记忆型(CD45RA—CD27 CD28 )、 效应型(CD45RA’本项目受国家重点撼础研究发展规划项目(973计划)一抗原结构特征与免疫应答的关系(No.2001CB510001)、国家自然科学基金重人项目一基于表位免疫识别结构信息研(No。llllIIlI)的资助。
张蓓[2]2007年在《CD4～+CD25～（high）调节性T细胞在慢性持续性乙肝病毒感染中的作用临床研究》文中研究表明尽管预防性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)疫苗已经在全球广泛应用,但慢性持续性乙肝病毒的感染率仍居高不下,目前全世界慢性HBV感染者已经超过3.7亿人,乙肝相关的肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加,严重威胁着人类的健康。目前,由于尚不清楚HBV感染后慢性化的确切机制,所以无法制定出行之有效的治疗方法和方案。因此,明确HBV感染的慢性化机制,可为乙肝的临床治疗提供新的线索和可靠的理论依据。关于乙型肝炎病毒感染后的慢性化假说很多,既往的研究提示可能与T细胞的无能或耗竭,树突状细胞的数量和功能的下降及机体对病毒的免疫耐受有关。但具体何种机制在肝脏的免疫耐受中占主导地位,尚不明确。以往人们认为维持体内免疫耐受的主要机制是中枢免疫器官发生克隆清除,在外周诱导自身潜能细胞进入免疫无能状态,及部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视。Treg的发现使人们对免疫调节及免疫耐受有了全新的认识,自Sakaguchi等人于1995年在未免疫小鼠外周血循环中发现了CD4+CD25+T细胞(Treg)后,大量实验证据表明,机体可能更主要的是通过Treg以“主动”的方式维持自身免疫耐受。这在对白色念珠菌,利什曼原虫感染慢性化的研究中已得到证实,从而为我们对乙肝病毒慢性持续存在的研究提供了线索。在HBV感染中,HBV病毒作为嗜肝的DNA病毒,本身对肝细胞并没有损害;而在清除胞内乙肝病毒和肝细胞的损伤中均起关键作用的是MHC-I类分子限制性的CD8+ T细胞即细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)。在急性乙肝病毒感染中,可激发强烈的、多克隆的表位特异性CTL反应;而在慢性感染中,这些反应是微弱的甚至缺失的,造成CTL反应低下的原因仍有待于研究。近年来的研究表明,Treg可通过与T细胞的相互作用发挥免疫调节机制。在此基础上我们提出了假设,在慢性感染中,Treg是否就是造成表位特异性CTL免疫反应低下的元凶?基于此研究目的,我们首先系统全面的对乙肝患者外周血中的Treg进行定量检测和功能分析。研究发现其Treg的频率及CD4~+CD25~(high)Foxp3~+T细胞频率均增高,并有功能性表型分子的表达,提示Treg可能在乙肝慢性感染中担负着重要的免疫调节效应。在鉴定表型的过程中,发现CD4~+CD25~(high)CD127low T细胞与CD4~+CD25~(high)Foxp3~+T细胞呈显着正相关,故CD127可作为一种替代Foxp3作为Treg新的特征性表型。因CD127在细胞表面表达,易于检测,染色时不会对细胞造成损害,故可作为一种于Treg鉴定和分选的最佳表型。在同时进行的表位特异性CTL的定量检测及功能分析中发现,在乙肝慢性感染中,表位特异性CTL虽与急性乙肝病毒感染中相比频率较低,但还是可以被检测到的,只是存在一定的功能缺陷。在穿孔素,颗粒酶B的检测中发现穿孔素和颗粒酶B阳性的细胞主要分布在特异性CTL以外的细胞群,包括CD8~+T细胞群和CD8?T细胞群。相反,在特异性CTL中,穿孔素或颗粒酶B阳性的细胞均处于低水平分布状态。这些实验结果提示可能有非特异性具有细胞毒性功能的细胞参与了肝脏的损伤。以上研究表明:当体内存在高病毒载量时,CTL不足以控制病毒的复制,只有通过募集非特异性旁立活化的细胞来清除病毒,但同时也造成了肝细胞的破坏。目前,这种旁观者效应所造成的肝脏损害已越来越受到研究者的重视。同样在IFN-γ的检测中亦发现,大多数CTL无IFN-γ的表达或仅仅是很微量的表达,即使在体外肽刺激扩增后,这些细胞分泌IFN-γ的能力仍相当低。这表明尽管在慢性乙肝患者外周血能检测到表位特异性的CTL,但其免疫监视作用已经丧失,呈现一种病毒持续性复制状态。值得注意的是,我们发现在慢性乙肝患者外周血中Treg频率明显增高且与表位特异性CTL的频率呈现负相关,这种现象给了我们新的提示,为此我们用磁珠分选出Treg后在体外作不同细胞亚群共孵育,从而研究Treg与表位特异性CTL的相互作用机制。结果表明Treg可抑制表位特异性CTL的增殖和IFN-γ的分泌,提示前期现象的发现并非偶然,Treg确实可以通过T-T接触和细胞因子分泌的方式下调表位特异性CTL的免疫学效应从而影响病毒的清除,这可能是造成乙肝病毒在患者体内慢性持续存在的重要原因之一。在乙肝病毒被发现的近叁十年来,很多研究者一直致力于抗病毒药物的研发,但到目前为止还没有一种药物可以使乙肝患者完全治愈。模拟抗原(mimogen)的出现为乙肝治疗提供了新的策略,它是通过在对天然抗原的免疫识别研究得到的抗原的表位图谱及其精细结构-功能关系的基础上,观察了表位特异性T细胞应答与HBV感染的相关性后,提出的“通过mimogen克服免疫耐受从而进行免疫治疗”的治疗性疫苗研制新策略。其目的在于激发机体特异性主动的免疫反应,它的应用可以使乙肝患者体内的表位特异性CTL的数量和功能增强。我们追踪观察了部分应用mimogen的病例,在改善其体内表位特异性CTL的功能状态后,以期待观察Treg发生的变化。结果显示注射mimogen的患者在表位特异性CTL频率升高的同时,Treg的频率降低。这表明在体内Treg与CTL之间确实存在一种相关性,而这种相关性是因为Treg下调表位特异性CTL的免疫效应造成的。我们的研究结论为乙肝病毒慢性持续存在提供了新的理论依据,同时通过控制Treg的作用,提高表位特异性CTL的免疫效应来清除病毒可望成为乙肝治疗的新的策略。
张宇[3]2013年在《B、C型HBV核心蛋白细胞毒T细胞表位筛选以及功能意义研究》文中研究说明乙肝病毒(HBV)为一类嗜肝性病毒,在世界范围内广泛流行,在中国HBV感染情况更为严重。HBV感染对人类健康具有极大的威胁,也给人类社会造成重大的损失。研究认为特异性细胞毒T细胞(CTL)反应在清除HBV感染的过程中发挥着极其重要的作用。HBV感染后引起的CTL反应是一把双刃剑,既起着病毒清除的作用,但同时又造成了肝损伤。而病毒为了维护自身的生存会通过产生各种突变体来对抗机体的清除作用,且HBV突变被证明与乙肝疾病发展有着一定的关系。因此,HBV感染中CTL反应相关研究具有重要的理论及实际意义。目前已报道的CTL表位主要是由西方学者发现的,但西方国家与亚洲国家主要流行的HBV基因型并不相同。基于这个情况,我们选取中国分布最多的B型和C型HBV作为研究对象,并选择了HBV组成成分中保守性最好且免疫原性最强的核心蛋白(HBc)作为研究目标。通过总结分析NCBI上171条B型HBc序列和159条C型HBc序列,利用overlapping方法合成涵盖HBcl-150全序列的九肽(每条多肽与相邻多肽有8个氨基酸的重复),若某一氨基酸的突变率超过10%,覆盖该突变氨基酸的一系列多肽也被包括在合成的范围内,合计共191条九肽。首先通过T2细胞结合实验,筛选到四条HLA-A2高结合力的多肽(HBc60-68*,HBc123-131,HBc123-13l*,HBc141-149).随后通过晶体结构学研究显示这四条多肽具有典型的HLA-A*0201表位的结构特点,但同时也具有一些新的特点,从而拓展了人们对MHC-多肽复合物结构特点上的认识。其中HBc第60位突变(L60V)产生的新CTL表位(HBc60-68*,V60),引起我们极大的兴趣,并对这一突变位点进行了深入的研究。通过晶体学方法和功能学实验相结合的策略,证明V60具有典型的HLA-A*0201表位多肽的结构特征,在小鼠体中可以产生很强的特异性CTL反应,而其野生型多肽L60并不可以。通过分析HBV感染患者的临床资料,观察到HBc L60V突变与临床更强的肝损伤,更高病毒水平以及不良预后相关。随后通过在HLA-A2.1/HBV杂交小鼠中进行V60多肽免疫,我们证明V60刺激起的多肽特异性CTL反应在杂交小鼠中造成了一定的肝损伤。另一方面,我们在野生型HBV质粒中引入HBc L60V突变,在质粒转染Huh7细胞后检测发现,突变型质粒的HBV复制水平明显高于野生型质粒,高压尾脉注射野生型HBV质粒与突变型质粒进入小鼠体内也得到了同样的实验结果。我们进一步通过细胞内和原核表达野生型及突变型HBc蛋白,发现在同等HBc蛋白表达量的情况下,突变型HBc蛋白包装成核心颗粒的水平要明显高于野生型蛋白,这就说明了HBc L60V突变可能通过促进HBc核衣壳的包装来促进HBV复制,而这个结果也解释了含有HBcL60V突变的慢肝病人中HBV DNA水平更高的现象。本实验中我们展示了一种新型HBV突变行为,该突变以产生一个新HLA-A2限制性CTL表位的代价而促进了HBV复制。我们的实验结果表明HBc L60V突变影响了T细胞反应,HBV复制以及艺肝疾病发展,有助于人们对临床乙肝疾病发生机制的了解。
谢谆怡[4]2008年在《PD-1/PD-L信号参与慢性乙肝病毒感染特异性CTL功能衰竭的研究》文中提出乙型肝炎是严重的肝脏感染性疾病。目前全世界慢性HBV感染者已经超过4亿,乙肝相关肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加,严重威胁着人类健康。由于目前HBV感染后慢性化的确切机制尚不清楚,所以无法制定出行之有效的治疗方法和方案。HBV作为嗜肝性DNA病毒,本身对肝细胞并没有损害,在清除病毒和造成肝细胞损伤中起关键作用的是CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)。急性乙肝病毒感染可激发强烈的多表位特异性CTL应答;但慢性感染时,特异性CTL增殖、细胞因子分泌及细胞毒效应功能均发生不同程度损伤,与HBV感染持续不能清除直接相关,其原因仍待研究。T细胞的分化、活化及发挥效应功能除了需要来自TCR的第一信号,还需要来自共刺激分子的辅助调节信号。PD-1是CD28家族的共刺激分子,与配体PD-L结合后可阻断TCR信号的传递。众多研究表明,PD-1/PD-L共刺激信号通路在T细胞活化、增殖和细胞因子分泌等各个过程中均发挥重要的负性调节作用。2006年,Barber小组的研究工作发现,在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染小鼠体内,功能衰竭的T细胞表达PD-1上调,阻断PD-1与其配体之间的相互作用能使衰竭的T细胞恢复活力并显着降低病毒载量。此后,在HIV,HCV等慢性病毒感染性中也相继发现PD-1/PD-L1通路与病毒特异性CD8+T细胞功能障碍有关,该通路在慢性HBV感染中的研究也已初见报道。但是, PD-1/PD-L通路对HBV特异性CTL分化、活化过程的影响目前仍不清楚,而特异性CTL的分化和活化是其发挥效应功能的基础。另一方面,PD-1/PD-L通路在HBV的感染的靶器官——肝脏中的表达及其与疾病发展的关系仍未见报道。因此,为更全面地认识PD-1/PD-L共刺激信号通路在乙型肝肝炎病毒慢性感染中对特异性CTL功能的调节作用,我们开展了以下研究:首先,利用多色流式细胞仪结合pentamer技术检测了PD-1分子在HBV特异性CTL的表达情况。结果显示,慢性乙肝患者HBV特异性CTL表达PD-1百分率显着增高,显着高于作为对照的CMV特异性CTL及外周血总CD8+T细胞。而分析PD-1的表达水平与患者血浆病毒载量及性别、年龄和ALT水平之间关系显示, PD-1的表达水平与血浆中HBV病毒的载量正相关,与其他指标无显着相关性。以上结果提示,可能是患者体内高载荷的HBV病毒引起了PD-1表达的上调。那么PD-1表达的上调对特异性CTL的分化、活化及多种抗病毒效应功能是否发生影响呢?结合表面分化抗原CD27、CD45RA和趋化因子受体CCR7的表达,我们观察了在T细胞不同分化阶段PD-1表达的变化,我们发现在CTL细胞分化的不同阶段,PD-1表达存在显着差异。CCR7+ CD27+CD45RA+初始CD8+T细胞PD-1表达极少,在遭遇抗原后(CD45RA-) PD-1表达上调。在分化中期CCR7-CD27+CD45RA-T细胞上PD-1表达达到最高。而分化至终末阶段的CCR7-CD27-CD45RA+T细胞中,PD-1表达又复下调。PD-1表达与CTL分化之间存在明显关联。而慢性乙肝感染患者特异性CTL多集中于分化中后阶段,高表达PD-1分子;但作为对照的CMV特异性CTL大多高分化,PD-1表达水平较低的。因此,分化与PD-1表达的差异使HBV特异性CTL可能接收更强的抑制信号。通过表面活化标志检测,我们发现慢性乙肝患者体内PD-1+ CTL高表达活化标志CD38和HLA-DR。接着利用胞内因子染色法检测抗病毒效应分子的表达,我们发现PD-1+特异性CTL胞内仍有较高的GrB的表达,但perforin表达低下、IFN-γ表达极低。以上表型提示慢性乙肝患者PD-1+特异性CTL虽然高度活化,但实际处于功能受损状态。PD-1/PD-L通路的抑制效应不仅取决于PD-1的表达量,还取决于PD-1与其配体配接的程度,因此慢性HBV感染时PD-L的表达量也至关重要。于是我们检测了外周血淋巴和单核细胞中PD-1配体PD- L1和PD-L2的表达。结果显示,慢性乙肝患者外周血单核细胞表面PD-L1表达显着上调,而T和B淋巴细胞群体表面PD-L1的表达无显着变化,同时PD-L2在单核和淋巴细胞中的表达也没有显着变化。结合患者临床信息分析发现,外周血单核细胞PD-L1的表达量与血浆ALT水平显着正相关。这可能提示,在肝脏炎症增加的同时机体也开始上调免疫抑制因子以控制炎症损伤程度。慢性乙肝感染时单核细胞上调PD-L1表达是否抑制特异性T细胞的应答?阻断PD-1/PD-L1通路又是否能够恢复特异性T细胞的功能?为回答上述问题,我们进行了PD-1/PD-L1通路阻断实验:分离慢性乙肝感染患者外周血PBMC进行体外培养,其中加入特异性表位肽刺激特异性CTL发生活化和增殖,在以上体系中利用PD-L1的阻断性抗体阻断PD-1/PD-L通路后观察特异性CTL增殖和效应功能的变化。结果显示,加入阻断性抗体以后,特异性CTL的增殖能力显着增强,清除病毒的重要效应因子IFN-γ的分泌能力显著提高。上述结果提示,在慢性HBV感染患者外周血中,PD-1/PD-L1通路参与特异性CTL的功能障碍的调节,阻断该通路能使功能受损的特异性CTL的增殖和细胞因子分泌效应功能恢复。肝脏是HBV特异性感染的靶器官,且有研究表明PD-1/PD-L1通路参与肝内T细胞免疫耐受的调节。因此,为阐述PD-1/PD-L这一重要的免疫调节通路在慢性乙肝感染肝脏的表达及其在疾病进程中的可能作用,我们进行了以下研究:首先,利用免疫组织化学方法检测了PD-1在慢性乙肝感染患者肝活检组织中的表达情况。结果显示,慢性乙肝感染肝组织中PD-1阳性细胞显着增加,且PD-1分子主要表达在汇管区和肝小叶中浸润单个核细胞上。免疫双荧光染色实验提示,PD-1表达在CD4+和CD8+T淋巴细胞以及少量CD20+B淋巴细胞上。这提示,在慢性乙肝感染肝脏中浸润着大量活化的淋巴细胞,它们表达PD-1分子上调。接着我们检测了PD-1的两个配体在慢性乙肝感染肝脏中的表达。结果显示,PD-L1的表达在HBV慢性感染肝脏中显着上调,除了浸润炎症细胞以外,Kupffer’s细胞、血窦内皮细胞及DC细胞等大量肝脏原位抗原递呈细胞均上调PD-L1的表达。而另一个配体PD-L2的表达则没有显着变化。比较炎症损伤程度不同及炎症细胞浸润程度不同的肝组织中原位抗原递呈细胞上PD-L1的表达,我们发现PD-L1的表达与肝组织炎症损伤和炎症细胞浸润程度均密切相关。上述结果提示,肝组织的炎症损伤和免疫应答上调了肝脏原位抗原递呈细胞表面PD-L1的表达,这可能起到控制免疫反应强度,保护肝组织的作用。因此,PD-1/PD-L1抑制性通路在慢性乙肝感染肝脏中上调可能起着双重作用:一方面保护肝组织免受免疫病理损伤,另一方面也导致特异性免疫应答下调、病毒持续不能清除。本研究发现,慢性乙肝感染患者外周血及肝组织中抑制性共刺激分子PD-1/PD-L1通路均上调,阻断该通路能缓解特异性CTL的功能低下状态。这对于认识HBV感染的慢性化机制有着重要意义,PD-1/PD-L1通路的精确调控可能为慢性乙型肝炎的治疗提供新的线索和思路。
孙成刚[5]2005年在《HLA等位基因和MHC-多肽特异性CTL在乙型病毒性肝炎的作用机制》文中指出[目的] 探讨山东地区慢性乙型肝炎、乙肝病毒携带者、乙肝病毒感染后自然恢复者与HLA-DRB1等位基因之间的相关性,了解HBV感染后各种预后的遗传背景。 [方法] 乙肝病毒相关抗原抗体系统采用酶联免疫法进行检测;HBV-DNA定量用Roche light-cycler荧光PCR检测仪进行检测;肝功能(包括转氨酶、血浆白蛋白、球蛋白等)使用全自动生化分析仪检测;HLA-DRB1等位基因采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR/SSP)技术进行检测。 [结果] ①、依据乙肝病毒相关抗原抗体指标和HBV DNA定量结果,分为HBV高复制状态和HBV低复制状态,进行二者之间的HLA-DRB1等位基因频率的比较,发现等位基因HLA-DRB1*0701在HBV高复制状态组中出现频率比低复制状态组明显升高(45% vs 12.5%,P<0.05),其余等位基因未发现具有显着性差异(P值>0.05)。②、在慢性乙型肝炎组中,四个等位基因HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1201和HLA-DRB1*1501出现的频率明显高于正常对照(分别是23.3% vs 4%、16.7% vs 2%、60% vs 4%、56.7% vs 12%,P值分别<0.05、<0.05、<0.01、<0.01),把此组再细分为乙肝肝硬化组和原发性肝癌组,发现在乙肝肝硬化组中,等位基因HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1201出现的频率远比正常对照高(30% vs 2%、50% vs 4%,P值分别为0.01、0.04),在原发性肝癌组中,等位基因HLA-DRB1*1501明显高于正常对照(60% vs 12%,P值为0.002)。③、在乙肝病毒携带组中,等位基因HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1201、HLA-DRB*1501出现的频率明显高于正常对
杨新星[6]2009年在《HBV感染者中抗原特异性CTL免疫应答状况的研究》文中进行了进一步梳理目的1．建立体外分析抗原特异性T细胞的检测方法--四聚体染色技术，为深入探讨表位特异性CTL的生物学功能以及更全面理解HBV特异CTL在HBV感染中的致病机理奠定实验基础；2．应用四聚体染色技术和流式染色分析抗原特异性CTL在自限性和慢性HBV感染中频率和生物学功能；3．分析HBV慢性感染者抗原特异性CTL细胞功能耗竭可能机制，为慢性感染免疫调节治疗提供可能途径和新的治疗靶点。方法1．应用基因工程技术原核高效表达HLA-A~*0201-BSP、HLA-A~*2402-BSP、HLA-A~*1101-BSP和β2m蛋白后，分别与常见的HBV抗原肽在体外复性折迭成可溶性的抗原肽复合物单体；经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体；分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例(5：1)耦合构建成四聚体。2．Dot blotting方法检测HLA-A~*0201-β2m-抗原肽、HLA-A~*2402-p2m-抗原肽、HLA-A~*1101-β2m-抗原肽复合物单体正确构象和生物素化；四聚体染色流式检测四聚体特异性。3．采用淋巴细胞分离液分离抗凝血的外周血单个核细胞(PBMC)；序列特异性引物聚合酶链反应(Sequence Specific Primer Polymerase Chain Reaction，SSP-PCR)分型技术确定HLA分型。4．入选病例用ELISA检测乙肝五项指标，Realtime-PCR定量检测HBV DNA。ELISA检测排除入选病例HAV、HCV、HDV、HEV、HIV病毒感染。5．应用四聚体染色技术检测表位特异性CTL的频率，借助流式细胞仪检测多肽体外刺激淋巴细胞产生IFN-γ的能力；流式染色检测细胞表面CD分子的表达；结合四聚体染色和细胞内细胞因子染色检测细胞因子(IL-10、TGF-β)的分泌。6．Sigmaplot软件作图，SPSS13．0对数据进行统计分析。结果1．构建了HLA-A~*0201 core18-27、pol575-583、env335-343；HLA-A~*2402 core117-125、pol756-764；HLA-A~*1101 core88-96、preS1 10-17抗原肽四聚体，所构建的七种四聚体都具有较好的特异性。2．抗原特异性CTL在自限性和慢性HBV感染者中频率和生物学功能：(1)自限性HBV感染患者外周循环中抗原特异性CTL的频率、增殖能力和分泌IFN-γ的能力明显高于慢性HBV感染者；自限性HBV感染者外周血中core特异性CTL的频率高于pol、env特异性CTL频率。(2)在慢性HBV感染者中只有一小部分低病毒滴度的患者抗原特异性CTL能够增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者几乎丧失了抗原特异性CTL细胞增殖和分泌IFN-γ的能力；统计学分析结果显示：慢性HBV感染者外周血中HBV特异性CTL的频率同HBV DNA及ALT并没有显着相关性(p＞0．05)。(3)HLA-A~*0201／HLA-A~*2402，HLA-A~*0201／HLA-A~*1101，HLA-A~*1101／HLA-A~*2402限制性自限性HBV感染患者外周循环中抗原特异性CTL的频率均高于慢性HBV感染者，慢性HBV感染者外周血抗原特异性CTL频率很低，而且和HLA型别没有显着相关性。3．自限性和慢性HBV感染者CD8~+T细胞上CD127的表达频率没有显着性差异，而在慢性HBV感染者特异性CTL上CD127的表达要高于自限性感染组，统计学分析有显着性差异(p＜0．05)。4．自限性、慢性HBV感染者和未感染HBV者外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞的频率和CD4~+／CD8~+的比值统计学分析没有显着性差异(p＞0．05)。5．外周血中CD4~+T细胞、CD8~+T细胞分泌IL-10、TGF-β、IFN-γ能力在自限性或慢性HBV感染中均无显着性差异(p＞0．05)。6．在自限性和慢性HBV感染中，阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用后，抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力均增加，特别是阻断TGF-β／TGF-βR相互作用后，抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力增加较强。结论1．构建的七种四聚体都具有较好的特异性，能够检测到表位特异性CTL。2．在自限性HBV感染者外周血中这七种抗原特异性CTL的频率、体外抗原肽刺激后的增殖能力及分泌IFN-γ的能力均较慢性感染者高；慢性HBV感染患者外周血中抗原特异性CTL频率一般较低，甚至检测不到；只有一小部分低病毒滴度的患者外周血中抗原特异性CD8~+T能够增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者几乎丧失了抗原特异性CD8~+T细胞增殖和分泌IFN-γ的能力。3．细胞因子IL-10和TGF-β在HBV感染者T细胞应答低下、抗原特异性CTL功能耗竭中起作用。体外阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用可以提高抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力。本研究的创新点1．应用现有文献报道的表位，结合四聚体技术对不同HLA限制性表位特异CTL在中国自限性和慢性HBV感染者中频率和生物学功能进行了初步研究，特别对在中国具有较高频率HLA-A~*2402和HLA-A~*1101限制性CTL的研究。并分析了HLA-A~*0201／HLA-A~*2402，HLA-A~*0201／HLA-A~*1101，HLA-A~*1101／HLA-A~*2402限制性自限性和慢性HBV感染者体内抗原特异CTL频率和优势表位。2．对IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子在HBV特异性CTL功能耗竭机制进行了初步研究，并通过体外实验阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用可以提高病毒特异性CTL的频率和功能，为慢性感染免疫治疗提供新的治疗靶点。本研究的意义1．应用四聚体染色技术系统分析了不同HLA限制性不同表位肽特异性CTL在自限性和慢性HBV感染者的频率及生物学功能，有助于我们更全面理解HBV特异CTL在HBV致病机理中的作用，也有利于HBV治疗性疫苗的研制。2．对HBV感染中抗原特异性T细胞功能失能可能机制研究，为慢性感染免疫治疗提供新的治疗靶点。
张亚丽[7]2008年在《小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究》文中认为感染HBV能导致急性、慢性肝炎,与肝硬化及肝细胞癌有密切关系。目前,控制HBV感染的有效方法是接种乙肝疫苗。基因疫苗的兴起和发展为乙型肝炎病毒感染的防治提供了新的途径。基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,在乙型肝炎病毒的清除方面具有较好的应用前景,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗。核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱,难以诱导有效的T、B细胞免疫应答,提高核酸疫苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用,从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。LIGHT是TNF配体家族的成员,可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体,LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用,参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。本研究对小鼠LIGHT作为乙肝核酸疫苗的基因佐剂方面进行了初步研究。在克隆小鼠LIGHT基因的基础上,构建其胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达并对其表达条件进行了初步的探索;构建LIGHT全长基因的真核表达质粒并在体外转染细胞,检测结果表明真核表达质粒中的LIGHT基因可在哺乳动物细胞中进行表达;混合淋巴细胞反应中LIGHT转染的树突状细胞可显着增强同种异体T淋巴细胞增殖;将LIGHT真核表达质粒与乙肝核酸疫苗质粒联合免疫Balb/c小鼠,细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明LIGHT可以增强小鼠体内的特异性免疫应答,从而发挥免疫佐剂的作用。
黄金凤[8]2016年在《补肾清毒法对慢性乙型肝炎患者外周血特异性CTL影响的实验研究》文中认为研究目的大量研究表明,中医药在治疗慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Viral Hepatitis B,CHB)方面有着独特优势。补肾清毒法源于中医伏气理论“肾虚疫毒内伏肝血”。通过检测补肾清毒法治疗CHB患者前后外周血HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的数量和功能,探讨补肾清毒法对CHB患者外周血特异性CTL的影响,部分阐明补肾清毒法抗HBV可能的作用靶点和免疫活化机制,探析慢性乙型肝炎肾虚邪伏理论的现代科学内涵,为补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎提供较为全面的科学依据。研究方法1.收集广州中医药大学第一附属医院门诊随访的CHB患者,应用HLA-A2作为过筛指标,经流式细胞术直接荧光免疫法筛选HLA-A2阳性CHB患者共32例,所有入选的HLA-A2阳性CHB患者随机分为西药组15例和中西药组17例。另设10例HLA-A2阳性健康献血者为正常对照组。西药组予拉米夫定治疗,中西药组在拉米夫定治疗基础上加用补肾清毒法。2.采集正常组、中西药组、西药组入组时和治疗6个月后外周静脉血20ml,用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC),并冻存于液氮中。3.细胞复苏培养后,采用MHC I-五聚体(Pentamer)染色流式检测技术直接检测HBcAg18-27表位特异性CTL的细胞数量。4.细胞复苏培养后,采用MHC I-五聚体(Pentamer)结合胞内细胞因子(ICS)染色流式检测技术,检测HBcAg18-27表位特异性CTL细胞毒效应分子穿孔素(Perforin)、颗粒酶B (Granzyme B)和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的表达。5.细胞复苏培养后,采用酶联免疫吸附斑点试验(Enzyme Linked Immunologic Spot Assay, ELISPOT)技术测定经HBcAg18-27I肽段诱导特异性CTL分泌IFN-γ的应答频率和平均反应强度。研究结果1.补肾清毒法对外周血HBcAg18-27表位特异性CTL细胞数量的影响治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞的频率(Pentamer+细胞数占CD3+CD8+双阳性细胞总数比例)较正常组高(P<0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞的频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞的频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。2.补肾清毒法对外周血HBcAg18-27表位特异性CTL细胞功能的影响(1) Pentamer结合ICS染色流式检测细胞毒效应分子Perfori、Granzyme B和细胞因子IFN-γ的表达Perforin:治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞Perforin表达频率(Pentamer+Perforin+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)较正常组高(P<0.05),但两治疗组总体频率偏低；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞Perforin表达的频率上升,差异有统计学意义(P<0.05),但总体表达频率仍偏低;‘治疗后,西药组和中西药组特异性CTL细胞Perforin的表达频率相近,差异无统计学意义。Granzyme B:治疗前,中西药组、西药组和正常组特异性CTL细胞Granzyme B表达频率(Pentamer+Granzyme B+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)均偏低；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞Granzyme B表达的频率上升,差异有统计学意义(P<0.05),但总体表达频率仍偏低；治疗后,西药组和中西药组特异性CTL细胞Granzyme B的表达频率相近,差异无统计学意义。IFN-γ:治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率(Pentamer+IFN-γ+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)较正常组高(P<0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率较高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) ELISPOT法测定经HBcAg18-27I肽诱导特异性CTL分泌IFN-γ的应答频率和平均反应强度治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的应答频率和平均反应强度较低,两组间差异比较无统计学意义(P>0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的的应答频率和平均反应强度有所上升,但差异均无统计学意义(P>0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的的应答频率和平均反应强度均较高,但差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.治疗前,中西药组和西药组CHB患者特异性CTL细胞的数量和表达细胞因子水平偏低,我们认为,这与CHB患者特异性CTL免疫功能障碍有关。正常健康人群特异性CTL水平也较低,这可能由于健康人循环血中不存在HBV特异性抗原的持续刺激,导致HBV特异性CTL水平偏低。2.补肾清毒法治疗后CHB患者外周血特异性CTL细胞数量明显上升。Perforin、 Granzyme B虽有上升,但总体表达频率仍偏低,而IFN-γ则总体表达频率升高明显,表明HBV特异性CTL的非胞毒途径可能在清除病毒中发挥更重要作用。补肾清毒法通过增加特异性CTL细胞数量和改善活化CTL分泌IFN-γ的能力使特异性T细胞免疫功能增强。3. Perforn、Granzyme B、IFN-γ在Pentamer-CD3+CD8+细胞群中表达水平也较高,我们认为,补肾清毒法对非特异性CTL或非HBcAg18-27表位的特异性CTL也有一定程度的影响。补肾清毒法可能通过多靶点、多环节影响免疫系统中多种免疫细胞及细胞因子,发挥免疫调节作用。
李卡[9]2007年在《肝细胞癌相关分子的基础和应用研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌是我国致死率居第二位的恶性肿瘤，侵袭力强，易转移，预后差。尽管人们做出巨大努力，但对其发病机制仍了解不多。在亚洲乙肝病毒感染是HCC的最主要相关因素。AFP是目前唯一的HCC诊断标志物，但是特异性和敏感性都有不足。大约有25％的HCC病人AFP阴性，急需发展新的肿瘤标志物。Annexin家族是一种结构高度保守的钙依赖磷脂结合蛋白，几乎参与所有的膜事件。很多研究表明annexin表达的改变和肿瘤发生发展相关，但在HCC中只报道了叁个annexin表达的变化。考虑到它的保守性，我们用实时定量PCR技术系统调查了所有12个annexin成员和AFP在肝癌、癌旁组织及7种常见HCC细胞系中mRNA的表达。以期了解annexins家族整体和HCC的关联以及作为HCC生物标志物的可能。结果表明annexin在肿瘤组织和癌旁组织中的表达有很好的相关性；5个在肿瘤中表达显着上调，2个显着下降，部分结果得到免疫组化验证；多个基因的表达显着相关。聚类分析提示联合检测AFP和多个annexin表达水平可能有助于提高HCC的预测能力。另外细胞系HepG2和PLC／PRF／5具有和肿瘤组织相似的表达谱，可以作为研究annexin在HCC中生物学功能的细胞模型。CTL是清除病毒、肿瘤和外源移植物的主要效应细胞，了解CTL的数量和功能状态有重要意义。四聚体染色技术是目前最灵敏和便捷的抗原特异性CTL定量检测方法，是研究病毒CTL表位的重要工具。常规的四聚体制备方法是利用基因工程在MHC重链HLA分子胞外区C端连上15氨基酸的BSP得到重组HLA-BSP分子，分别以包涵体形式表达MHC轻链β2 m和HLA-BSP，在HLA限制性表位肽存在下重折迭得到MHC-肽复合物，生物素化后利用亲合素和生物素的特异性结合，用荧光标记的亲合素螯合四个复合物分子而得到可用流式细胞仪检测的四聚体。因为CTL识别抗原有MHC限制性，而HLA是人类多态性最丰富的基因座，当针对不同人群需要频繁构建含不同HLA的MHC复合物时，这种方法暴露出很大的缺点。由于HLA基因的胞外区两端GC含量很高，加上附带长序列的影响，需要巢式PCR的方法才能从反转录产物中克隆得到重组HLA-BSP。而且需要分别表达纯化两种包涵体蛋白，分别加入重折迭缓冲液，操作繁琐，重折迭效率较低。我们根据融合蛋白linker的设计原理，结合中国人群出现频率最高的13种HLAⅠ等位基因的结构特点，设计了一种用于Ⅰ型四聚体构建的通用单链重组人MHC原核表达系统，提高了构建重组MHC分子的效率。分别用一段3’端含酶切位点的柔性多肽linker编码序列连接β2m和HLA，一段5’端含酶切位点的linker编码序列连接HLA和BSP，两种酶切位点不存在于中国人群出现频率最高的13种HLAⅠ等位基因和β2m中。构建四聚体的通用部分β2m和BSP可以被固定在原核表达载体上，当需要更换不同HLA等位基因时，可以一步从反转录产物中克隆到HLA胞外区，通过简单的酶切连接反应即可得到重组MHC。并且单链MHC分子的表达、纯化和重折迭工作量都大大减少。经常规方法构建的四聚体检测对照，验证了这一设计的有效性。乙肝病毒感染是HCC发生最重要的相关因素。HBX为病毒基因组转录所必需，并能够抑制细胞调亡，改变细胞周期，抑制DNA修复，削弱细胞间粘附，被认为是重要的致癌因子。研究表明HBX在慢性乙肝病人中的检出率高于其它乙肝抗原，而在HCC病人中检出率高于80％，可以认为HBX是乙肝病毒阳性HCC的肿瘤特异性抗原。由于HCC的发展迅速，恶性程度高，除了部分病人可以早期手术外没有很好的治疗手段。如果HBX能诱导特异性CTL，则可以通过过继免疫或表位疫苗策略达到治疗HCC的目的。为了覆盖最大人群，我们选择报道的8株中国人群流行的HBV基因型，和中国人群出现频率最高的HLA A0201基因型，通过计算机筛选得到四个潜在的HLA A0201限制的存在于所有入选基因型的X蛋白CTL表位，经过体内外生物学功能实验验证，其中HBX_(115-123)(CLFKDWEEL)能诱导出特异的CTL。在此基础上，我们构建含该表位及HBC_(18-27)的四聚体检测了4例HLA-A2+慢性活动性乙肝病人和6例感染HBV的HLA-A2+肝癌病人外周血中相应特异性CTL的数量。结果在所有病人外周血中检出HBC特异性CTL；在所有慢性活动性乙肝病人和4例肝癌病人外周血中检出HBX特异性CTL，但数量少于HBC特异性CTL；肝癌病人外周血中测出的两种特异性CTL数量均少于慢性活动性乙肝病人外周血中相应CTL数量。提示肝癌病人多处于免疫抑制状态，HBX的免疫原性相比HBC弱，可能HLAA0201限制性HBX表位不是免疫优势表位，但HCC病人体内确实存在HBX特异的CTL。HBX特异的CTL能否发展成为HCC免疫治疗手段需进一步研究。
胡凤霞[10]2012年在《乙肝相关慢加亚急性肝衰竭患者外周血Th17、Treg及CTL细胞的变化及临床意义的初步探讨》文中指出背景我国慢加亚急性肝衰竭病死率高达60％-80％。其发病机制复杂，目前认为宿主免疫调节的紊乱是造成肝脏病变的重要原因。其中T细胞亚群介导的细胞免疫以及细胞因子网络的调控异常起着重要的作用。最近，一种新的效应CD4+T细胞亚群Th17被广泛关注，具有很强的促炎症作用，以分泌白介素17(IL-17)为特征。调节性T细胞(Treg)是体内重要的具有免疫调节功能的CD4+T细胞亚群，具有免疫无能和免疫抑制两大功能特征，可通过细胞间的直接接触、分泌抑制性细胞因子等多种方式发挥抑制作用，具有抗炎症作用。细胞毒性T细胞(CD8+CD28+即CTL)在抗病毒、自身免疫等方面起重要作用，主要是通过细胞毒机制、非细胞毒机制两种途径特异性地杀伤靶细胞。Th17、Treg及CTL在慢性乙型病毒性肝炎中的研究已见报道，但上述叁者是否参与了乙肝相关慢加亚急性肝衰竭(HBV-SACLF)发病的过程及在肝衰竭不同阶段的动态变化、叁者之间的相关性研究尚未见报道。目的探讨HBV-SACLF患者外周血Th17、Treg、CTL细胞的动态变化趋势、叁者之间的相关性及与预后的关系。方法采用流式细胞仪检测39例HBV-SACLF患者、20例慢性乙型肝炎患者(CHB)、15例正常人，外周全血标本中Th17、Treg及CTL的比例，比较叁组之间上述指标的差异；动态观察HBV-SACLF患者早期、中期、晚期Th17、Treg、CTL的变化趋势；分析Th17、Treg、CTL细胞亚群间是否具有相关性；比较存活组与非存活组Th17、Treg、CTL比例与预后的关系。同时采用ELISA技术检测上述叁组血清中IL-17的表达水平，并分析HBV-SACLF患者早期、中期、晚期IL-17的动态变化。结果1.HBV-SACLF组、CHB组及正常对照组Th17、Treg、CTL比例分别为：1)Th17：(4.04±1.22)%、(1.94±0.43)%、(1.01±0.25)%；Th17比例在HBV-SACLF组与CHB组及正常对照组比较，CHB组与正常组比较，均明显升高，差异均具有显着性(p1=0.03，p2<0.001，p3=0.034)。2)Treg：(3.79±1.49)%、(8.25±1.23)%、(5.76±1.15)%；Treg比例在HBV-SACLF组较CHB组及正常组均明显下降，CHB组较正常组明显升高，差异均具有显着性(p1<0.001，p2=0.006，p3=0.007)。3)CTL：(21.12±5.35)%、(13.61±1.41)%、(16.73±1.20)%；CTL比例在HBV-SACLF组较CHB组及正常组均明显上升，CHB组较正常组明显下降，两组之间比较差异均具有显着性(p1<0.001，p2=0.012，p3=0.009)。2.HBV-SACLF早期、中期、晚期Th17、Treg、CTL的比例分别为：1)Th17：(3.05±0.71)%、(4.07±0.90)%、(5.18±1.10)%；Th17比例在HBV-SACLF早期与中期，中期与晚期相比逐渐升高，两组之间比较差异均具有显着性(p1=0.003，p2=0.009)。2)Treg：(5.18±0.68)%、(3.99±0.72)%、(1.87±0.64)%；Treg比例在HBV-SACLF早期与中期，中期与晚期比较逐渐下降，差异均具有显着性(p1=0.001，p2=0.000)。3)CTL：(22.62±4.99)%、(19.08±3.63)%、(14.48±4.39)%；CTL比例在HBV-SACLF早期与中期，中期与晚期比较逐渐下降，差异均具有显着性(p1=0.046，p2=0.003)。3.HBV-SACLF存活组与非存活组Th17比例分别为：(3.44±0.97)%、(4.56±1.20)%；两组之间比较差异具有显着性(P=0.003)。且Th17与预后具有明显正相关性(r=0.501，P=0.029)。4.对HBV-SACLF患者中Th17、Treg及CTL进行相关性分析发现：Th17与Treg存在明显的负相关性(r=-0.532，P<0.001)；Treg与CTL存在显着的正相关性(r=0.339，P=0.035)；Th17与CTL无相关关系(r=-0.246，P=0.131)。5.HBV-SACLF组、CHB组及正常对照组IL-17细胞因子的表达水平分别为：289.2±83.3、153.3±79.6、62.5±28.5(pg/ml)，HBV-SACLF组与CHB组及正常对照组之间差异均有显着性意义(p1=0.019，p2=0.000)。6.HBV-SACLF早期、中期、晚期IL-17细胞因子的表达水平分别为：214.7±47.5、267.7±56.8、317.4±88.1(pg/ml)，在早期与中期、中期与晚期之间差异均有显着性(p1=0.011，p2=0.007)。结论HBV-SACLF患者外周血Th17细胞比例和IL-17水平明显升高，且在肝衰竭的进展过程中持续升高，与预后具有明显的正相关性；Treg细胞比例在HBV-SACLF时下降，且在肝衰竭进展过程中持续下降，与Th17之间具有明显的负相关性；CTL细胞比例在HBV-SACLF时上升，在肝衰竭进展过程中持续下降，与Treg之间具有明显的正相关性。表明机体内Thl7、Treg及CTL细胞比例紊乱可能是导致HBV-SACLF发生和发展的关键因素，其在外周血中的动态变化可以判断机体的免疫状态，对于指导临床治疗和判断预后具有一定的价值。
参考文献：
[1]. 慢性持续性乙肝病毒感染表位特异性CTL的功能研究[D]. 张静波. 第叁军医大学. 2004
[2]. CD4～+CD25～（high）调节性T细胞在慢性持续性乙肝病毒感染中的作用临床研究[D]. 张蓓. 第叁军医大学. 2007
[3]. B、C型HBV核心蛋白细胞毒T细胞表位筛选以及功能意义研究[D]. 张宇. 中国科学技术大学. 2013
[4]. PD-1/PD-L信号参与慢性乙肝病毒感染特异性CTL功能衰竭的研究[D]. 谢谆怡. 第叁军医大学. 2008
[5]. HLA等位基因和MHC-多肽特异性CTL在乙型病毒性肝炎的作用机制[D]. 孙成刚. 山东大学. 2005
[6]. HBV感染者中抗原特异性CTL免疫应答状况的研究[D]. 杨新星. 华中科技大学. 2009
[7]. 小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究[D]. 张亚丽. 华东师范大学. 2008
[8]. 补肾清毒法对慢性乙型肝炎患者外周血特异性CTL影响的实验研究[D]. 黄金凤. 广州中医药大学. 2016
[9]. 肝细胞癌相关分子的基础和应用研究[D]. 李卡. 第二军医大学. 2007
[10]. 乙肝相关慢加亚急性肝衰竭患者外周血Th17、Treg及CTL细胞的变化及临床意义的初步探讨[D]. 胡凤霞. 苏州大学. 2012
标签：生物学论文; 基础医学论文; 特异性论文; pd-1论文; 细胞免疫论文; 抗原表位论文; 细胞分化论文; 抗原抗体反应论文; 乙肝论文; 科普论文; tl论文; 效应t细胞论文; ifn-γ论文;