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载脂蛋白L1在肠道病毒A71复制中作用的初步研究

2020-12-09阅读(504)

载脂蛋白L1在肠道病毒A71复制中作用的初步研究

论文摘要

研究背景和意义载脂蛋白L1是人体内的固有免疫因子,仅在人类和少数哺乳动物体内表达。作为该蛋白家族中唯一可以分泌到血液中的成员,APOLl蛋白是高密度脂蛋白的组成成分,具有溶锥虫作用。2014年,Taylor等阐明细胞内APOL1蛋白具有抗感染作用。细胞内APOLl蛋白可以抑制HIV-1在巨噬细胞内的复制。本课题组前期研究发现,在EV-A71感染引起的手足口病重症患儿血液中APOLl蛋白过高表达。因此本研究通过构建Apol1基因敲除细胞株和过表达细胞株来探究APOLl蛋白对EV-A71在细胞内复制中的作用,不仅有助于理解EV-A71的致病机制,而且可以为EV-A71的重症感染的防治提供新的思路和途径。研究方法（1）针对Apol1基因设计siRNA,敲减HBMEC细胞中APOL1蛋白表达并检测细胞中EV-A71的复制情况。（2）利用CRISPR/Cas9技术构建敲除Apol 1基因的HBMEC稳定细胞株（3）利用Cumate表达载体构建可诱导稳定表达APOLl的293T细胞株（4）EV-A71分别感染以上构建的两种细胞株,探索APOL1与EV-A71复制的关系结果（1）在HBMEC中,转染Apol1 siRNA并感染EV-A71 24h后,细胞内病毒含量相对于未敲减的细胞显著提高（F=170.4,p<0.05）（2）成功构建敲除Apol1的HBMEC细胞,命名为HBMEC-APOL1-KO,同时感染空载病毒的细胞命名为HBMEC-Lenti。（3）成功构建可诱导表达APOLl蛋白的293T细胞,命名为293T-APOLl-GFP,同时感染空载的细胞命名为293T-GFP。经rea1-time PCR和western blot验证,293T-APOL1-GFP细胞表达APOL1的量随着诱导剂浓度的增加而增加,且到50μg/ml和100μg/ml时,APOL1蛋白表达量达到最大（F=537.9,p<0.01）。CCK-8实验证明诱导剂浓度低于200μg/ml时,细胞生长无影响（F=1.082,p=0.2903）。（4）病毒分别感染HBMEC-APOL1-KO和293T-APOL1-GFP细胞株,出现同样的结果,病毒感染12h,细胞内病毒含量比对照组明显提高（F=196.2,p<0.001;F=561.5,p<0.001）。结论在正常情况下,HBMEC细胞内高表达的APOL1可抑制EV-A71的复制;在无APOL1表达HBMEC中,EV-A71的复制增加;在过表达APOL1的293T中,EV-A71的复制也增加。综上所述,本研究初步确定了在EV-A71的复制过程中,APOL1发挥了一定的作用

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 前言
  •   1.1 APOL1研究现状
  •     1.1.1 Apol1基因
  •     1.1.2 APOL1的抗感染作用:抑制病原体的繁殖和限制病原体扩散
  •     1.1.3 APOL1过表达诱发其细胞毒性
  •   1.2 肠道病毒71型研究现状
  •     1.2.1 EV-A71感染中枢神经系统的机制还不明确
  •     1.2.2 宿主内环境对EV-A71感染神经系统的影响
  •     1.2.3 EV-A71的复制
  •   1.3 本研究背景和意义
  • 第二章 沉默APOL1基因表达后对EV-A71复制的影响
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 细胞株和病毒株
  •     2.1.2 主要试剂
  •   2.2 实验步骤
  •     2.2.1 RD细胞培养及EV-A71病毒扩增、滴度测定
  •     2.2.2 HBMEC细胞培养以及EV-A71感染
  •     2.2.3 siRA转染HBMEC细胞及Real-time PCR检测细胞内Apol1的mRNA表达量
  •     2.2.4 EV-A71感染APOL1 siRNA转染后的HBMEC
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 病毒扩增以及病毒滴度滴定
  •     2.3.2 EV-A71感染HBMEC细胞
  •     2.3.3 siRNA筛选结果
  •     2.3.4 病毒感染结果
  •   2.4 讨论
  • 第三章 利用CRISPR/Cas9系统敲除人脑微血管内皮细胞的载脂蛋白L1 基因
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 细胞株和质粒
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 常用试剂配方
  •   3.2 实验步骤
  •     3.2.1 慢病毒载体构建
  •     3.2.2 慢病毒质粒大量提取及慢病毒包装
  •     3.2.3 Apol1基因的敲除
  •     3.2.4 Apol1基因敲除株测序鉴定
  •     3.2.5 蛋白免疫印迹实验验证蛋白敲除
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 lenticrisprV2质粒构建
  •     3.3.2 慢病毒包装
  •     3.3.3 嘌呤霉素杀灭曲线建立
  •     3.3.4 阳性细胞筛选
  •     3.3.5 基因组测序鉴定HBMEC细胞内Apol1基因
  •     3.3.6 Western blot鉴定APOL1蛋白表达
  •   3.4 讨论
  • 第四章 可诱导表达载脂蛋白L1的293T稳定细胞株构建
  •   4.1 材料
  •     4.1.1 细胞株和质粒
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 常用试剂配方
  •   4.2 实验步骤
  •     4.2.1 Apol1基因获取与纯化
  •     4.2.2 重组质粒构建
  •     4.2.3 慢病毒包装以及嘌呤霉素杀灭曲线建立
  •     4.2.4 慢病毒感染以及嘌呤霉素筛选
  •     4.2.5 细胞系鉴定
  •     4.2.6 CCK-8细胞增殖-毒性试验
  •     4.2.7 诱导后real-time RCR和western blot鉴定重组蛋白表达量
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 重组质粒构建
  •     4.3.2 阳性细胞筛选及诱导鉴定
  •     4.3.3 CCK-8细胞增殖-毒性实验
  •     4.3.4 Real-time PCR以及Western Blot鉴定表达量
  •   4.4 讨论
  • 第五章 细胞内APOL1蛋白在EV-A71感染细胞中的作用的初步研究
  •   5.1 材料
  •     5.1.1 细胞株
  •     5.1.2 主要试剂
  •   5.2 实验步骤
  •     5.2.1 EV-A71感染Apol1基因敲除组细胞
  •     5.2.2 EV-A71感染Apol1基因可诱导表达细胞
  •     5.2.3 Real-time PCR检测细胞内病毒VP1基因相对含量
  •   5.3 结果
  •     5.3.1 EV-A71感染Apol1基因敲除细胞
  •     5.3.2 EV-A71感染Apol1基因可诱导表达细胞株
  •   5.4 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 附录1
  • 附录2
  • 研究生期间获得的成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 曹观华

    导师: 李凌,朱利

    关键词: 载脂蛋白,肠道病毒型,基因敲除,可诱导表达

    来源: 南方医科大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 南方医科大学

    基金: 广东省医学科研基金项目(No.A2016357),广东省自然科学基金项目(No.2018A030313767)

    分类号: R373

    总页数: 83

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