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异源表达猫爪草酰基-Δ9脱氢酶促进烟草及小球藻ω-7脂肪酸合成

2020-12-02阅读(926)

异源表达猫爪草酰基-Δ9脱氢酶促进烟草及小球藻ω-7脂肪酸合成

论文摘要

ω-7脂肪酸（ω-7 FA）是一类非常珍稀的单不饱和脂肪酸,因其双键位于从甲基端起第七个碳原子故又称为n-7或ω-7脂肪酸。ω-7脂肪酸主要包括棕桐油酸（C16:1Δ9）、顺式-11-十八碳烯酸（C18:1Δ11）和顺式-13-二十碳烯酸（C20:1Δ13）,在食品营养、医药保健、生物燃油和油脂化工等领域具有独特的功能和应用价值。ω-7脂肪酸仅在一些野生植物种子中高量合成和积累,而大豆和油菜等普通油料作物种子ω-7脂肪酸含量极低（<2%）。猫爪草（Macfadyena uniguis-cat等富集ω-7脂肪酸的野生作物因其种子产量低、地理条件限制和农艺性状比较差等缺点,目前还不能像普通的油料作物那样大规模种植和商业化生产油脂。近年来,利用代谢工程技术,在普通油料作物发育种子中组装ω-7脂肪酸生物合成途径以期商业化生产ω-7脂肪酸油脂已成为一个极具前景的热点研究领域。本文以高生物量烟草（Nicotiana benthamiana）和已商业化养殖的小球藻（Chlorella,CS-SX08株系）为受体,进行遗传转化和超表达催化棕桐油酸（C16:1Δ9）合成的酰基-ACP-A9脱氢酶基因,以期培育植物营养器官富集ω-7脂肪酸的新种质和高水平合成ω-7脂肪酸的小球藻工程株系,为建立ω-7脂肪酸商业化生产新途径提供科学依据。主要研究结果如下:（1）建立小球藻（Chlorella,CS-SX08）优化培养条件和生长曲线,并确定小球藻细胞最佳活力期。系统测试小球藻对多种抗生素敏感性,确定了可用于遗传转化体检测的小球藻筛选标记基因为潮霉素抗性基因,筛选压力为固体培养基潮霉素80 μg.mL-1,液体培养基潮霉素200 μg·mL-1。（2）先期研究已从猫爪草发育种子分离到编码催化棕榈酸（16:0-ACP）生成棕桐油酸（16:1A9-ACP）的酰基-ACP-A9脱氢酶cDNA克隆（MucACP-Δ9D）,本文成功构建了用于小球藻遗传转化和烟草瞬时表达的MucACP-Δ9D-pCAMBIA1 303组成型表达载体,该载体含有GFP报告基因和潮霉素抗性筛选标记基因。（3）利用农杆菌介导法将MucACP-Δ9D基因在本氏烟草（N.benthamiana）叶组织中瞬时表达。用气相色谱（GC）检测烟叶脂肪酸成分显示,野生型及空载体对照的ω-7 FA总含量仅为0.4%。然而,MucACP-Δ9D）瞬时表达的烟叶组织ω-7 FA总含量提高到14.2%,其中C16:1Δ9和C18:1Δ11含量分别达8.8%和5.4%,而棕榈酸C16:0的含量显著下降,由对照的24%减少至18.7%。这表明来源于富含ω-7 FA的猫爪草McA CP-Δ9d在烟草叶组织表达亦具有催化棕桐油酸合成的酶活性,可异源表达用于对其他高等植物脂肪酸合成途径的遗传修饰。另外,MUcACP-Δ8D瞬时表达的烟叶亚油酸（C18:2）含量由对照的22.5%下降至19.3%,亚麻酸（C18:3）由对照含量的27.4%平均下降至22%,而饱和的硬脂酸（C18:0）和单不饱和的油酸（C18:1Δ9）的含量变化均不明显。这种脂肪酸组成的变化可能是宿主本身作为单烯酸含量增加的一种相应的补偿反应,其机制有待深入研究。（4）利用基因枪将MucACP-Δ9D基因转入小球藻,以潮霉素抗性基因作为筛选标记筛选到阳性转化子。报告基因GFP和藻细胞DNA,RNA分子鉴定表明,MUcACP-Δ9D已经成功整合到小球藻基因组,并且有效表达。（5）通过对野生型和转基因小球藻的生长曲线和蛋白含量的鉴定,结果表明转MYcACP-Δ9D表达并未对小球藻生长和蛋白合成积累造成显著影响。（6）用气相色谱（GC）检测转基因小球藻细胞脂肪酸成分显示,与野生型相比,转基因小球藻细胞ω-7脂肪酸含量由极低水平增加至15.1%。其中,棕桐油酸C16:1A9增加了 8.4%,其延伸产物C18:1Δ11含量增加至6.7%。相应地,棕榈酸C16:0含量显著减低,从野生型的22.8%下降到18.7%。这说明MucACP-Δ9D在小球藻细胞内可正常行使催化棕榈酸生成棕桐油酸的酶功能。总之,本研究证明在单细胞微藻和高等植物营养器官可组装ω-7 FA生物合成途径。来源于高等植物的酰基-ACP-A9脱氢酶也可在单细胞小球藻正常行使催化功能。模式植物烟草的叶片营养器官亦可作为生物反应器生产ω-7 FA。

论文目录

  • 摘要
  • 第一章 绪论
  •   1.1 ω-7脂肪酸生物合成及其相关酶
  •     1.1.1 ω-7脂肪酸
  •     1.1.2 棕榈油酸合成积累的相关酶
  •     1.1.3 棕榈油酸合成积累的遗传修饰
  •   1.2 微藻及小球藻的商业化应用
  •     1.2.1 微藻的概述
  •     1.2.2 小球藻的概述
  •   1.3 小球藻基因工程的进展
  •     1.3.1 选择标记基因
  •     1.3.2 用于小球藻基因工程的启动子
  •     1.3.3 小球藻的遗传改良
  •   1.4 小球藻遗传转化的方法
  •     1.4.1 电击法
  •     1.4.2 PEG介导法
  •     1.4.3 农杆菌介导法
  •     1.4.4 基因枪法
  •   1.5 烟草生物反应器的研究进展
  •   1.6 本研究的目的意义
  •   1.7 本论文的主要研究内容
  •   1.8 技术路线
  • 第二章 小球藻抗性筛选标记的确定
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料
  •     2.2.1 藻种及培养
  •     2.2.2 试剂与仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 藻种的培养及纯化
  •     2.3.2 藻细胞对三种抗生素的敏感性测试
  •   2.4 结果
  •     2.4.1 小球藻的生长曲线
  •     2.4.2 固体培养基中小球藻对抗生素的敏感性
  •     2.4.3 液体培养基中小球藻对抗生素的敏感性
  •   2.5 讨论
  • 第三章 猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及烟草瞬时表达研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与试剂
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 菌液的扩繁和质粒的提取
  •     3.3.2 DNA的回收纯化
  •     3.3.3 目的基因MucACP-Δ9D与pCAMBIA1303载体的连接
  •     3.3.4 酶连产物的转化及阳性克隆的鉴定
  •     3.3.5 载体MucACP-Δ9D-pCAMBIA1303双酶切鉴定
  •     3.3.6 农杆菌感受态的制备与转化
  •     3.3.7 农杆菌侵染烟草叶组织
  •     3.3.8 烟草叶片的RNA提取和RT-PCR
  •     3.3.9 烟草叶片脂肪酸提取
  •   3.4 结果
  •     3.4.1 猫爪草MucACP-Δ9D植物表达载体的构建
  •     3.4.2 猫爪草MucACP-Δ9D植物表达载体的鉴定
  •     3.4.3 阳性农杆菌菌落PCR鉴定
  •     3.4.4 MucACP-Δ9D在烟叶组织中瞬时表达的鉴定
  •     3.4.5 MucACP-Δ9D瞬时表达烟叶脂肪酸成分分析
  •   3.5 讨论
  • 第四章 小球藻遗传转化及分子检测
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与试剂
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 材料准备
  •     4.3.2 基因枪法转化小球藻
  •     4.3.3 筛选阳性转MucACP-Δ9D小球藻细胞
  •     4.3.4 转MucACP-Δ9D小球藻的绿色荧光蛋白的检测
  •     4.3.5 转MucACP-Δ9D小球藻的靶基因整合的分子检测
  •   4.4 结果
  •     4.4.1 转MucACP-Δ9D小球藻的绿色荧光蛋白的鉴定
  •     4.4.2 转MucACP-Δ9D小球藻的DNA鉴定
  •     4.4.3 转MucACP-Δ9D小球藻RNA鉴定
  •   4.5 讨论
  • 第五章 超表达MucACP-Δ9D小球藻的表型分析
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与试剂
  •     5.2.1 藻种
  •     5.2.2 试剂
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 转MucACP-Δ9D小球藻生物量测定
  •     5.3.2 转MucACP-Δ9D小球藻脂肪酸提取及测定
  •     5.3.3 转MucACP-Δ9D小球藻蛋白质含量测定
  •   5.4 结果
  •     5.4.1 MucACP-Δ9D表达对小球藻生物量影响
  •     5.4.2 MucACP-Δ9D表达对小球藻总油脂及脂肪酸成分影响
  •     5.4.3 MucACP-Δ9D表达对小球藻蛋白质含量影响
  •   5.5 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • Abstract
  • 硕士期间发表的论文
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 岳敏

    导师: 李润植

    关键词: 脂肪酸,酰基脱氢酶,本氏烟草,小球藻,猫爪草克隆,基因枪法遗传转化,瞬时表达

    来源: 山西农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 山西农业大学

    基金: 国家农业部“948”项目(#2014-Z39),国家自然科学基金(#31401430),国家自然科学基金(#30971806),国家自然科学基金(#31201266)山西省煤基重点科技攻关项目(#FT-2014-01),山西省重点研发计划重点项目(#201603D312005)

    分类号: Q943.2

    DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000275

    总页数: 55

    文件大小: 2855K

    下载量: 33

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