郝永杰[1]2008年在《脐带血造血干/祖细胞与脂肪干细胞共培养时作用距离的研究》文中研究指明造血干/祖细胞(hematopoietic stem progenitor cells,HSPCs)在治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病人的造血重建、基因治疗和免疫治疗等方面有极重要的临床应用价值,因此多年来一直得到科研工作者和临床医生的高度重视和关注。虽然前人对HSPCs的体外扩增已经做了大量的实验研究,但由于培养条件对HSPCs体外扩增的影响非常复杂,在不同的培养条件下,扩增效果差别很大,众多的影响参数均需要深入研究。造血干/祖细胞与基质细胞共培养时的有效作用距离还是一个悬而未决的问题,为此,本文采用修正的transwell改变脐带血来源的造血干/祖细胞(HSPCs)和人脂肪组织来源的脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)的作用距离,获得最佳的细胞共培养距离。采用的方法是在无菌条件下采集正常足月产妇脐带血,与PBS缓冲液1:1等体积混合,利用Ficoll分离液(1.077g/ml)密度梯度离心(2500rpm,25min)收获单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。共培养时先将ADSCs以2×10~5cells/ml密度接种到六孔板中,然后将收获的MNCs以1×10~6cells/ml密度接种到transwell小室内,所用的培养基是添加12.5%胎牛血清FBS和12.5%马血清HS的IMDM,最后将transwell小室放到调节好HSPCs和ADSCs之间的作用距离的六孔板中进行7天的共培养。其间每24小时进行细胞计数,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,并对扩增的细胞进行流式细胞仪分析及多向诱导分化检测。实验结果显示,通过transwell共培养扩增细胞,细胞之间存在最佳的作用距离约为350μm,在这个作用距离下,造血干/祖细胞的扩增效果最好,MNCs扩增了15.1±0.2倍,CD34~+扩增了5.0±0.1倍。
刘会兰[2]2003年在《脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究》文中研究指明目的：探讨人脐血(Umbilical cord blood，UCB)造血干／祖细胞(Hematopoietic stem／progenitor cells，HSC／HPC)在适合临床移植条件下体外扩增以获得理想的造血干／祖细胞数量的最佳细胞因子组合及扩增时间，为UCB经体外扩增后成为高体重受者克服脐血移植(Umbilical cord blood transplantation，UCBT)细胞数量不足及缩短植入时间提供客观指标。方法：采集UCB10份，分离单个核细胞(mononuclear，MNC)，免疫磁珠分选(MiniMACS)CD34~+细胞，4份UCB CD34~+细胞分别在在细胞因子组合为A：SCF+FL+TPO、B：SCF+FL+TPO+IL-3及C：SCF+FL+TPO+G-CSF支持的无血清、无基质的液体培养基中扩增培养14天，收集扩增前、扩增后7天及14天的细胞进行细胞表型分析、半固体集落培养及端粒酶活性分析。结果：在含细胞因子IL-3组扩增培养第7天及第14天，均获得了总有核细胞数(Total nucleated cells，TNC)及集落形成细胞(colony-forming cell，CFC)最大的扩增倍数。扩增第7天，IL-3组的CD34~+细胞扩增倍数为(10.11±7.21)倍，较其它两组稍低，但无统计学意义：叁组CD_(33)~+细胞、CD_(41)~+细胞、CD_(71)~+细胞也得到了较大程度的扩增，IL-3组高于其它两组；叁组扩增后的细胞端粒酶活性均上调，其OD值达最高，含IL-3组低于含G-CSF组(P=0.008)。随着扩增时间的延长，扩增后的细胞端粒酶活性均下降；CD34~+细胞占TNC的比例也明显下降，其它定向祖细胞的比例也出现先升高后下降的现象。结论：在SCF、FL、TPO及IL-3存在下，单份UCB的部分体外扩增7天内，可获得较大量的TNC及HPC，同时定向祖细胞的比例得以提高，与以配合支持长期植入的非扩增的UCB细胞共同组成移植物，从而加速移植早期的植入，又不影响长期植入的能力以满足成人移植的需要。扩增时间以7天内为宜。在SCF、FL、TPO存在下，IL-3的促分化能力大于G-CSF。
王建伟[3]2004年在《人参总皂甙对CD34～+造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用及机制研究》文中提出造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）工程是利用造血干/祖细胞（HSC/HPC）的高度增殖能力和多向分化潜能的生物学特性，通过细胞工程的技术，在体外模拟和部分模拟体内的造血过程（包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等），对分离纯化的HSC/HPC进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而在短时间内大量扩增早期造血祖细胞及各阶段的前体细胞，以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞（Dendritic Cells，DC）、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能细胞和免疫活性细胞，并可对部分细胞的功能进行激活和调控，对缺陷性基因进行靶向性转染，最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域。造血干细胞工程是目前国内外生命科学研究的热点和前沿课题，其研究现状展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用潜力，同时也为中医药现代化研究带来了新的切入点。中药有效成分对造血干细胞生物学影响的研究结果证实：许多中草药可以作用于不同周期的造血干细胞，并从蛋白质和分子水平影响造血干细胞的增殖与分化，从而达到重建恢复骨髓造血机能的目的，提示开展中药及有效成分对干细胞影响及机制的研究，有助于提高中药研究的科技含量，有效发挥中药的优势，建立疑难疾病治疗的新技术。人参是祖国传统医学的“补气”要药，人参皂甙是人参中主要的有效药物成基金项目：本课题为国家自然科学基金资助项目（No.38670880）；重庆市科委重点攻关课题（渝科委计[2000]25）<WP=9>分。我室着力于人参总皂甙（total saponins of panax ginseng，TSPG）对血发生的影响及机制研究已有二十余年，研究表明：TSPG是人参促进血细胞生成的有效成分。TSPG在体内外均能刺激造血干细胞（CFU-S）和造血祖细胞（CFU-GEMM、CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK）的增殖分化。为了进一步研究TSPG在分离纯化的造血干/祖细胞体外操作过程中的作用，挖掘TSPG应用于造血干细胞工程中的潜在价值，我们进行了以下研究：1、建立了人骨髓、脐血CD34+HSC/HPC体外分离纯化技术；2、以CD34+HSC/HPC为模型，研究TSPG协同造血生长因子诱导造血干/祖细胞体外扩增和定向分化的作用；3、采用低温生物学技术，探讨TSPG降低冷冻损伤、提高冷冻复苏后造血细胞的增殖能力；4、应用研究造血生长因子信号转导途径的方法，选择EpoR介导的JAK2/STAT5 信号传导途径，分析TSPG定向诱导红系血细胞发生的分子机制；5、以转染GM-CSF基因的人胚真皮成纤维细胞为滋养层，支持脐血CD34+HSC/HPC增殖和分化，以期在造血干细胞移植的基因治疗方面作出一些有益探索。现将各部分简介如下：1、人骨髓、脐血CD34+造血干/祖细胞的分离、纯化及鉴定：采用阴性分选策略，以StemsepTM系统建立CD34+HSC/HPC的免疫磁珠无菌分选术，对人骨髓、脐血单个核细胞中的CD34+HSC/HPC进行分选、纯化及免疫细胞化学与流式细胞术鉴定。结果显示：骨髓、脐血单个核细胞（MNC）的CD34+HSC/HPC为0.5%~3.5%，经分选后纯度高达92.8~98%, 分选的细胞台盼蓝拒染率为99%~100%，分选细胞的造血细胞集落产率为MNC的19倍。表明免疫磁珠阴性分选法可有效地分选CD34+HSC/HPC，并保持细胞活性良好，为深入研究HSC/HPC的生物学特征与功能奠定了基础。2、人参总皂甙对CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用：通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG协同造血生长因子诱导CD34+HSC/HPC形成CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E、CFU-GM的能力；经不同剂量TSPG加入造血细胞因子不同组合培养体系通过液体培养，检测细胞总数，CD34+细胞、CD71+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数（CFCs）、红系祖细胞和粒系祖细胞数量变化。结果显示：一定剂量的TSPG能够协同造血细胞因子提高CD34+细胞形成各种造血祖细胞集落产率；能够提高细胞总数，CD34+细胞、CD71+细胞和CD33+细胞比例以及各种造血祖细胞的数量。提示合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与<WP=10>定向诱导分化。 3、人参总皂甙对骨髓造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究：以5%二甲基亚砜（DMSO）为冷冻保护剂，采用逐步降温法将骨髓造血细胞在液氮中保存3~5 个月，复苏后应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、CD34+及细胞总数回收率等，测定骨髓造血细胞生物学活性的变化；将不同剂量的TSPG与复苏的骨髓造血细胞共培养，应用集落形成试验、MTT 比色分析法及流式细胞术等方法检测TSPG对骨髓造血细胞冷冻损伤可恢复性的影响。结果显示：细胞复苏后，加入合适剂量的TSPG（25μg/ml），可明显提高冻存骨髓造血细胞的集落产率；TSPG在一定浓度内（25~50μg/ml）能促进冻存骨髓造血细胞的增殖；TSPG（25μg/ml）能促进冻存骨髓造血细胞进入细胞增殖周期。研究表明，人参总皂甙能促进冷冻骨髓细胞的复苏、增殖，提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢复性，对应用冻存骨髓细胞作造血移植有一定意义。4、人参总皂甙诱导红系血细胞增殖的信号传递研究：采用半固体集落培养的方法检测TSPG对脐血BFU-E、CFU-E增殖的影响，通过细胞增?
徐莉敏[4]2003年在《脐血造血干细胞体外扩增实验研究》文中研究说明脐血中富含造血干／祖细胞(HSC／HPC)，且来源广、容易获得，可用于造血干细胞移植，其移植物抗宿主病(GvHD)发生率低、症状亦较轻。但单份脐血中所含的造血干细胞数量有限，而且脐血在分离、冻存、复融等过程中都会不同程度地丢失HSC／HPC，这大大限制了脐血在成人移植的应用。因此为了增加脐血中造血干细胞的数量，有效的方法之一是进行脐血干细胞的体外扩增。 本研究以脐血CD34表达阳性的细胞作为目的细胞，研究其在分离纯化中的丢失情况；在系特异性细胞因子的作用下，CD34~+细胞的分化情况；在不同组合的细胞因子作用下，有核细胞(NC)和CD34~+细胞的扩增情况。 脐血经3％明胶+淋巴细胞分离液分离后，脐血单个核细胞的回收率达54.51±14.19％；单个核细胞经贴壁2小时，MACS纯化后，CD34~+细胞富集倍数达36.22倍。 脐血CD34~+细胞在系特异性细胞因子作用下，向各系方向分化。CD7、CD10的表达随着扩增时间延长，分别从8.84％、1.38％下降到0.96％、0.72％；以第7天作比较，CD13、CD41和Gly-A的表达则分别从6.28％、5.35％、4.57％上升到35.86％、25.66％、34.68％。 不同细胞因子组合以脐血CD34~+细胞的扩增效果不同。NC扩增效果最佳的细胞因子组合为FL+TPO+SCF+G-CSF+IL-6+GM-CSF+EPO+IL-3，培养14天后扩增倍数达328.93±6.59倍，但CD34~+细胞扩增效果最佳的细胞因子组合为FL+TPO+SCF+G-CSF+IL-6+GM-CSF，在第7天扩增倍数最高达25.23±8.46倍。 研究结果表明，3％明胶+淋巴细胞分离液的分离方法能提高脐血单个核细胞的回收率，贴壁2小时再用MACS纯化能提高CD34~+细胞的纯化率。细胞因子组合以FL+TPO+SCF+G-CSF+IL-6+GM-CSF+EPO+IL-3对NC的扩增效果最好，但细胞因子组合FL十TP于SCI:+G毛SF+IL.6十GM毛sI:对CD34+细胞的扩增效果最佳。
葛剑云[5]2010年在《体外扩增过程中造血细胞生理状态和遗传稳定性研究》文中提出体外扩增技术是解决新鲜脐血中造血干/祖细胞数量稀少问题的有效策略,而扩增后细胞的质量和安全性是影响其临床应用的重要因素。本文以脐血CD34+细胞为对象,分别采用有或无血清培养体系,对体外培养细胞的生理状态、遗传稳定性、染色体核型和克隆形成能力进行了系统的分析,获得下列结果：(1)无论细胞培养基有无血清,细胞的比生长速率、S/G2/M期细胞比例、以及细胞内端粒酶活性均有相似的变化趋势,存在一定的相关性；(2)与CD34-细胞相比,在培养过程中CD34+细胞的凋亡率始终维持在较低水平上,低于新鲜分离的CD34+细胞中的凋亡率,表明CD34+细胞具有很强的抗凋亡特性；(3)在细胞培养过程中,与遗传稳定性相关基因Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达水平随培养时间延长均有不同程度的上调,但与K562细胞中的稳定高表达不同,提示细胞培养没有产生细胞恶化的信号;(4)6个脐血样本用含血清培养体系扩增,染色体核型异常比例较高,达2/3。但是这些异常的发生不具有定向性和稳定遗传性,且未表现出异常增殖的特征,提示有血清培养体系扩增的脐血造血干/祖细胞可能有临床安全性风险,但没有足够证据显示培养细胞出现了恶性转化。这些研究对确保培养细胞移植的安全性与有效性具有重要意义。
胡嘉波[6]2008年在《脐血造血干/祖细胞分离、纯化、生物学特性及B细胞分化发育研究》文中指出研究目的:探讨密度分离脐血造血干/祖细胞体外扩增和体内重建造血的潜能;胎儿骨髓间质干细胞对CD34+细胞体外扩增的造血支持作用;体外诱导脐血造血干/祖细胞向B细胞分化发育的规律。研究内容:(1)利用造血干/祖细胞培养、体外扩增、移植动物模型等技术,研究不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血造血干/祖细胞的造血活性。(2)体外分离、纯化胎儿骨髓间质干细胞;Mini-MACS免疫磁珠分离脐血CD34+细胞;建立胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子与CD34+细胞共培养体系,用液体培养方法扩增细胞;实时定量RT-PCR技术分析培养细胞的nucleostemin基因表达。(3)体外免疫磁珠分离纯化脐血造血干/祖细胞;在小鼠S-17基质细胞支持下,脐血造血干/祖细胞、T3、IL7共培养建立体外B细胞分化发育培养体系,诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化;用流式细胞仪、PCR、RT-PCR技术检测不同培养时间分化的B细胞。研究方法:(1)密度分离脐血细胞配制不同密度Ficoll-泛影葡胺细胞分离液,分别应用密度为1.054 g/ml、1.064g/ml、1.072g/ml、1.077g/ml、1.084g/mlFicoll-泛影葡胺不连续密度梯度离心分离脐血有核细胞成分。(2)造血祖细胞集落培养五种不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离的脐血细胞,在甲基纤维素体系中培养测定其集落形成能力。CFU-GM体系含有细胞2×10~5/ml,20%FBS,20ng/ml GM-CSF,0.9%甲基纤维素。BFU-E体系含有细胞2×10~5/ml,10~(-5)M 2-巯基乙醇,3mM L-谷氨酰胺,马血清25%,白细胞条件培养液20%,EPO 2U/ml,0.9%甲基纤维素。充分混匀以每孔0.25ml加入24孔培养板中,重复2孔,置37℃,5%CO_2培养箱培养,CFU-GM培养7天,BFU-E培养14天,倒置显微镜下观察计数CFU-GM,BFU-E。鉴别标准:CFU-GM每个集落至少含有40个细胞;BFU-E集落呈多中心状,橘红色,至少含有100个细胞。(3)密度分离细胞的生物学特性分析BALB/c照射小鼠体内输注不同比密Ficoll-泛影葡胺分离液分离的脐血细胞,观察其造血潜能。Ficoll-泛影葡胺分离液分离的细胞,用无菌生理盐水洗涤二次后,计数并调整细胞浓度为2×10~6/ml,小鼠经致死剂量(8.5Gy)照射后随机分为3组,照射后2小时完成输注。Ⅰ组6只,输注无菌生理盐水0.2ml;Ⅱ组6只,输注经1.077g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离洗涤后的脐血MNC(1.077细胞)0.2ml;Ⅲ组6只,输注经1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离洗涤后的脐血MNC(1.064细胞)0.2ml。所有小鼠均采用尾静脉输注。(4)脐血造血干/祖细胞体外扩增取经鉴定的MSCs接种于24孔板中,当细胞生长达80%汇合度时,接种MiniMACS分选的CD34+细胞(4000/孔),总体积为1ml,共分4组(每组3孔):①CD34+细胞组;②胎儿骨髓MSCs+CD34+细胞组;③细胞因子+CD34+细胞组,细胞因子浓度为50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、50ng/ml FL、50ng/ml TPO;④胎儿骨髓MSCs+细胞因子+CD34+细胞组。培养体系为含10%FBS的DMEM,置5%CO_2、饱和湿度37℃培养。每7天半量换液1次并补充新的细胞因子,浓度同前。(5)脐血造血干/祖细胞B细胞分化培养接种Dynal beads分选的CD34+CD19-细胞或细胞仪分选的CD34+CD19-CD38-细胞于预铺S-17基质细胞的96孔培养板中。培养体系为α-MEM培养液,含3%FBS,50μM2-巯基乙醇,1%L-谷氨酰胺、T3及细胞因子组合,每孔总体积100μl。置5%CO_2,饱和湿度,37℃培养。每7天半量换液1次并补充新的细胞因子,浓度同前。(6)流式细胞分析术分选或培养的1×10~6细胞标记前用含1%牛血清白蛋白(HAS)的PBS洗涤1次,用荧光标记小鼠抗人单克隆抗体标记,置4℃条件下30 min,用含1%HAS的PBS洗涤1次,加0.4 ml含0.1%迭氮钠的PBS,流式细胞仪检测。分析软件为Cellquest。(7) CD34+细胞nucleostemin基因表达的分析定量PCR反应用于nucleostemin基因分析。反应体系为25μl,包括:1μlcDNA模板和24μl反应混合液[其中含2.5mM MgCl_2,20pmol引物,0.1μl Syber greenⅠ(1:1000)]。PCR循环参数为:95℃预变性2min,(94℃30s;58℃30s,72℃30s),40个循环。以GAPDH为内参照,扩增长度为205 bp,GAPDH基因连于pMD-18T载体定量稀释,作为标准曲线的模板。每个DNA样品做2个平行管,重复3次实验,反应结束后使用定量PCR仪的分析软件对实验结果进行分析,计算各样本基因的原始拷贝数,单位为拷贝/μlcDNA。Nucleostemin PCR扩增产物与相应GAPDH的扩增产物原始拷贝数的比值能反映转录水平的差异。此外,采取上述方法(PCR或RT-PCR)分析T3Rα1、T3Rα2、hT3Rβ1、Iμ、Cμ、IgLL、DQ52(D7-27)、DXP1(D3-9)、DQ52/DXP1等基因的表达、重组情况。研究结果:(1) 1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血细胞中,CFU-GM集落数为373±289/1×10~5MNC,BFU-E为121±70/1×10~5MNC;在细胞因子刺激下,1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血MNC在体外扩增14天时CFU-GM的扩增倍数达52.2倍;1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离的造血干/祖细胞可在8.5Gy致死剂量照射小鼠体内植入,输注1.064g/ml Ficoll分离脐血MNC产生的脾结节数是输注1.077g/ml Ficoll-泛影葡胺分离液分离脐血MNC的2.2倍。(2)胎儿骨髓间质干细胞表达CD29、CD44;免疫磁珠分选CD34+细胞的平均纯度为97.4%;胎儿骨髓间质干细胞+CD34+细胞共培养28天,CD34+细胞仍占有核细胞的6.43%;CD34+细胞在胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子作用下培养28天,有核细胞总数、CD34+细胞数分别被扩增1.65×10~5倍、788倍。(3) T3诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化,在我们选用的实验条件下,T3、IL-7与小鼠S-17基质细胞共培养是诱导CD34+CD19-造血干/祖细胞向B细胞分化的最佳条件,诱导的CD19+B部分细胞表达CD21,还表达CD10、CD20、CD24抗原,弱表达CD23抗原、HSL11、HSL96,不表达CD3、CD33、CD34、IgM抗原,B细胞向成熟方向发育;在小鼠S-17基质细胞支持下,单纯T3诱导的CD19+B细胞大多数体积较小,CD19+B细胞几乎不表达CD21,B细胞发育停留在较原始阶段;34+CD19-CD38-造血干/祖细胞B细胞分化的扩增倍数明显高于34+CD19-造血干/祖细胞,持续扩增的时间也延长;新鲜脐血与冻存脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化的纯度、扩增倍数无明显差异;小鼠S-17基质细胞高表达T3Rα1,传代20代以上小鼠S-17基质细胞,失去支持脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞B细胞分化的能力。(4)纯化的脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞检测到胚系DQ52基因,未发生DH-JH基因重排;诱导分化的B细胞优先选择DQ52-JH4、DQ52-JH3、DQ52-JH5基因重排,未检测到DQ52-JH1、DQ52-JH2、DQ52-JH6基因重排;在整个B细胞分化发育过程中,我们检测到持续的Iμ、Cμ、IgLL转录。研究结论:(1) 1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分离的造血干/祖细胞在体外具有较高的增殖、持续造血的能力及较强的体内造血重建潜能。(2)胎儿骨髓间质干细胞可有效扩增脐血造血干/祖细胞。(3) T3、IL7与小鼠S-17基质细胞体外能诱导脐血造血干/祖细胞B细胞分化,免疫球蛋白重链基因优势选择DH-JH4、DH-JH3、DH-JH5重排。脐血冻存叁年对造血干/祖细胞活性、B细胞分化能力无影响。
解纯刚[7]2006年在《转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干/祖细胞的体外扩增研究》文中认为造血干细胞(HSCs)是指那些具有自我更新能力并能分化为所有血系细胞的干细胞。造血干细胞移植(HSCT)常被用来治疗血液系统疾病和作为血液系统恶性疾病高剂量化疗后的支持治疗。骨髓、外周血和脐带血是人类的主要造血干细胞源。由于脐带血中含有比骨髓和外周血更高比例的原始造血干细胞,目前认为脐带血是比骨髓和细胞因子动员的外周血更有前途的造血干细胞源。同时研究发现接受脐带血移植的病人的移植物抗宿主病(GVHD)的频率明显减小。单份脐带血中的造血干细胞对于重建儿童和体重较轻的成人的造血系统是足够的,但是,对于体重较大的成年人是不够的。为了解决这个问题,必须对脐带血造血干细胞进行体外扩增。本研究利用基因工程技术发展了一种独特的转双基因骨髓间充质干细胞,并利用该转基因骨髓间充质干细胞联合细胞因子对脐带血造血干细胞进行体外扩增。 骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的具有很强的自我更新和多向分化能力的干细胞。本研究成功地分离纯化了骨髓间充质干细胞,并研究了骨髓间充质干细胞的体外生长特性。这些骨髓间充质干细胞在表型上呈典型的梭形纤维状,原代培养时间大约为14d。生长动力学分析表明,骨髓间充质干细胞呈典型的“S”型生长曲线。传代培养后细胞增殖能力增强,P_2—P_(20)代之间每代持续时间大约为6d:但P_(20)—P_(30)代之间细胞活力下降,每代持续时间大约为9d。在200d的培养期内,群体倍增时间在30—59h之间。在1—125d的培养期内,群体倍增时间缓慢维持在30—40h之间;在125—200d的培养期内,群体倍增时间急速从40h上升到59h。81.5%的骨髓间充质干细胞处于G_0/G_1期,呈典型的干细胞特性。流式细胞术分析表明,骨髓间充质干细胞表面抗原CD166、CD29和CD44为阳性,CD45、CD34和HLA-DR为阴性。 血小板生成素(THPO)和Flt-3配体(FL)是两个重要的早期造血刺激因子。本研究利用RT-PCR技术成功地从含有高丰度THPO和FL mRNA的胎肝细胞中克隆了THPO和FL膜外区基因。序列分析表明,THPO基因除了在蛋白信号肽序列中有一个碱基与Genebank中序列不同外,其他序列一致;FL膜外区序列与Genebank中序列完全一致。为了将THPO和FL膜外区基因导入骨髓间充质干细胞,我们利用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建了双顺反子共表达逆转录病毒载体pLXPFIT。利用前刺激+离心沉淀+多轮转染的转染方法将逆转录病毒载体pLXPFIT导入骨髓间充质干细胞。RT-PCR和western blotting分析表明,转基因骨髓间充质干细胞中THPO和FL膜外区mRNA和蛋白表达水平明显高于原代骨髓间充质干细胞。酶联免疫吸附实验(ELISA)分析证明在8代的转基因骨髓间充质干细胞培
曲琦[8]2016年在《脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究》文中提出一.脐血源内皮祖细胞(cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC)的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将MNCs接种于纤连蛋白(Fibronectin,Fn)包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2(EGM-2),其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β(rh FGF-β),recombinant human epidermal growth factor(rh EGF),R3-insulin-like growth factor(IGF)-1,vascular endothelial growth factor(VEGF),ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时(hour,h)后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage(P)1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45(EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236)及CD14(EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054);EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达(26.12%±4.56%),而HUVEC无此抗原表达(0.13%±0.11%)(P=0.001);CD31(EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472)和KDR(EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524),在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高(EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018)。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代EPC之间成管数无明显差异(P=0.749)。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数叁个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代之间迁移能力无统计学差异(P=0.925)。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍(P=0.025),VWF增高4.49±0.50倍(P=0.000),VEGF增高1.76±0.12倍(P=0.008),TIE1增高2.08±0.28倍(P=0.021),TIE2增高2.25±0.26倍(P=0.014),SELE增高7.34±0.61倍(P=0.000)。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植(hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT)因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice)NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异(P=0.003);间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显着性优势(P=0.001);但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异(P=0.239)。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异(P=0.003);间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异(P=0.025),与直接接触共培养之间无统计学差异(P=0.124),表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高(P=0.010);在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高(P=0.026);接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异(P=0.392);而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养(P=0.004)及直接接触共培养(P=0.002)条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在叁种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降(60.67%±1.68%,P=0.000),S期细胞比例的升高(31.40%±3.50%,P=0.000),而G2/M期细胞比例相当(5.94%±0.17%,P=0.120);经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降(59.77%±1.94%,P=0.000),S期细胞比例上升(35.17%±2.75%,P=0.000),但有相当的G2/M期细胞比例(5.62%±0.39%,P=0.851),尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多(446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000),且比单纯培养后的HSPC总数多(446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000)。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异(P=0.892)。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%(P=0.750)。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6(4.24±1.42倍,P=0.017)、ANGPT1(7.75±0.90倍,P=0.000)及CXCL12(8.25±2.03倍,P=0.025)基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高(11.76±2.11倍,P=0.013);且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调(3.49±0.54倍,P=0.001)。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。叁.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植(EPC+HSC)模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠(n=10)的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠(n=10)的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异(P=0.314)。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为(13.27%±6.36%),共移植组骨髓中人CD45比例为(18.21%±10.57%),无统计学差异(P=0.308);在单纯移植组脾脏中的嵌合比为(4.91%±7.56%),共移植组中该比例为(5.14%±2.97%),无统计学差异(P=0.840)。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和(或)弓背姿势和(或)活动度下降和(或)耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和(或)轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原(HLA-ABC)的阳性率为(27.97%±3.60%),MSC的HLA-I类抗原阳性率为(44.46%±7.18%)(P=0.024);EPC表面HLAⅡ类抗原(HLA-DR)的阳性率为(6.37%±2.73%),同样较MSC该类抗原(14.77%±1.96%)表达低(P=0.012);与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。
邓婷芬[9]2009年在《脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨》文中研究说明脐血作为一种造血干细胞资源越来越受到广泛重视,但由于单份脐血中造血干细胞数量不足,不能满足大多数成人和高体重儿童造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要,故限制了其广泛应用。体外扩增虽然可以增加造血细胞数量,但可能导致造血干细胞分化并降低其归巢和长期造血重建能力,因此提高脐血造血干细胞体外扩增质量仍是脐血移植中亟待解决的问题。间充质干细胞作为造血微环境主要细胞成分基质细胞的前体细胞,可以分泌与造血干细胞生长发育相关的黏附分子、细胞外基质和多种细胞因子,为造血干细胞体外扩增提供适宜的微环境。随着培养技术的提高,脐血间充质干细胞有着与其他来源的间充质干细胞所无法比拟的优势。本实验研究脐血间充质干细胞对人脐血单个核细胞体外扩增的支持作用。目的探讨脐血来源间充质干细胞(UCB-MSCs)体外分离、培养和初步鉴定的方法,以及UCB-MSCs联合外源性细胞因子对人脐血单个核细胞(UCB-MNCs)体外扩增的支持作用和最佳收获时间,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验方法。方法用羟乙基淀粉(HES)和人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用贴壁筛选法以MesencultTM专用培养基培养出脐血间充质干细胞,并通过流式细胞仪检测其细胞表面抗原。将新鲜脐血标本分离出的脐血单个核细胞接种于无血清培养体系(Stem spanTM)中培养18天,实验分叁组,A组:为空白对照组(培养体系中无外源性细胞因子和UCB-MSCs滋养层);B组:为因子组(培养体系中有外源性细胞因子但无UCB-MSCs滋养层);C组:为实验组(培养体系中既有外源性细胞因子又有UCB-MSCs滋养层)。在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数(MNCs)、CD34+细胞数、CD133+细胞数、集落形成单位数(CFU)和细胞在周期(G2+M+S期)含量的变化。结果①从脐血中分离、培养的出间充质干细胞,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。②在体外培养过程中,外源性细胞因子及UCB-MSCs均对脐血单个核细胞的扩增起支持作用,但以UCB-MSCs联合外源性细胞因子组效果最好,该组各项指标在同一时间点较其它两组高,有统计学意义(P﹤0.05),且维持造血至少达18天。③以UCB-MSCs联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞扩增,第10天上述各项指标达到最高峰,有统计学意义(P﹤0.05)。结论①采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞检测技术,可以成功地实现从脐血中分离、培养出间充质干细胞,并完成其细胞表型的初步鉴定。②UCB-MSCs联合外源性细胞因子可有效扩增脐血单个核细胞。③UCB-MSCs联合外源性细胞因子体外扩增脐血单个核细胞细胞收获的最佳时间为第10-14天。
高蕾, 陈幸华, 张曦, 孔佩艳, 彭贤贵[10]2007年在《VCAM-1修饰人脐血基质细胞对造血干/祖细胞扩增作用的实验研究》文中研究说明目的:初步研究VCAM-1修饰的hUCBSCs促进造血干/祖细胞体外扩增的作用。方法:在成功构建VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体的基础上,转染原代培养的人脐血基质细胞,采用半定量RT-PCR法和免疫细胞化学技术检测转染前后hUCBSCs VCAM-1的表达情况;以VCAM-1修饰的人脐血基质细胞为滋养层,体外扩增脐血CD34+细胞,并对扩增后的脐血CD34+细胞进行CFU-GM、CFU-E、CFU-Mg半固体培养。结果:脂质体介导VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体成功转染人脐血基质细胞;RT-PCR和免疫细胞化学从mRNA水平和蛋白质水平均证明转染后VCAM-1表达明显高于转染前(P<0.05);VCAM-1修饰的人脐血基质细胞能够有效支持脐血CD34+细胞的体外扩增(P<0.01),其中对CFU-Mg的扩增作用强于未转染组(S组,P<0.05)。结论:VCAM-1修饰的人脐血基质细胞能够有效地支持造血干/祖细胞的体外扩增,显示其在造血重建方面潜在的应用价值。
参考文献：
[1]. 脐带血造血干/祖细胞与脂肪干细胞共培养时作用距离的研究[D]. 郝永杰. 大连理工大学. 2008
[2]. 脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究[D]. 刘会兰. 安徽医科大学. 2003
[3]. 人参总皂甙对CD34～+造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用及机制研究[D]. 王建伟. 重庆医科大学. 2004
[4]. 脐血造血干细胞体外扩增实验研究[D]. 徐莉敏. 福建医科大学. 2003
[5]. 体外扩增过程中造血细胞生理状态和遗传稳定性研究[D]. 葛剑云. 华东理工大学. 2010
[6]. 脐血造血干/祖细胞分离、纯化、生物学特性及B细胞分化发育研究[D]. 胡嘉波. 江苏大学. 2008
[7]. 转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干/祖细胞的体外扩增研究[D]. 解纯刚. 浙江大学. 2006
[8]. 脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究[D]. 曲琦. 苏州大学. 2016
[9]. 脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨[D]. 邓婷芬. 广州医学院. 2009
[10]. VCAM-1修饰人脐血基质细胞对造血干/祖细胞扩增作用的实验研究[J]. 高蕾, 陈幸华, 张曦, 孔佩艳, 彭贤贵. 中国病理生理杂志. 2007