导读:本文包含了核酸内切酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:核酸,内切,甲基,内质网,结构,嘌呤,特异性。
核酸内切酶论文文献综述
尹紫良,王长丽,葛菁萍[1]（2019）在《酿酒酵母W5核酸内切酶基因HO的克隆及生物信息学分析》一文中研究指出目的:以酿酒酵母W5为出发菌株,对其核酸内切酶基因HO进行克隆及生物信息学分析。方法:首先运用Primer 5.0软件,设计一对扩增HO基因序列的引物,并以酿酒酵母W5全基因组为模板进行PCR扩增,获得酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因片段,利用生物信息学技术对该序列进行验证及分析。结果:测序显示HO基因长度为1760bp,无碱基缺失,且该基因序列具有完整的开放读框。该基因编码的HO蛋白包含586个氨基酸残基,强酸性和强碱性氨基酸残基数量有明显差异;HO蛋白等电点为9.56,存在激酶位点,疏水性最大值为1.722,亚细胞定位预测其位于细胞核内,属于碱性胞内蛋白质,并构建了其空间结构模型。结论:对酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因序列进行了克隆及生物信息学分析,所得数据可为酿酒酵母遗传背景研究提供一定的理论支持。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2019年04期）
白雪娇,鲁理平,康天放[2]（2019）在《基于甲基化核酸内切酶的甲基转移酶活性的电化学检测研究》一文中研究指出由DNA甲基转移酶(DNMT1)催化的DNA甲基化在许多生物过程中起重要作用,包括基因转录,基因组印记和细胞分化~([1])。本文利用特异性酶切法成功开发了一种有效的测定DNMT1的电化学方法。首先,将硫醇修饰的双链DNA(dsDNA)自组装固定在金电极上,随后DNMT1识别dsDNA半甲基化序列并实现完全甲基化,最后通过甲基化特异性限制酶(BSSHⅡ)剪切,未发生完全甲基化的碱基序列将被剪切并移除电极表面。利用差分脉冲伏安法(DPV)分别测定剪切前后的亚甲基蓝(MB)还原电流。在最佳优化条件下,该方法线性范围为0.5 nM～50 nM,检测限为0.5 nM。这种方法可以简单有效地检测DNA甲基化和DNMT1活性,在DNA甲基化快速检测和基因毒理分析方面具有一定的实际意义。(本文来源于《化学研究与应用》期刊2019年06期）
王嘉禹,赵美萍[3]（2019）在《荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性》一文中研究指出目的:开发一种可快速、灵敏地检测生物样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)含量的荧光分析方法。方法:根据APE1所具有的脱碱基核酸内切酶活性,合成了一种用荧光基团与猝灭基团标记的含脱碱基位点的DNA荧光探针。在合适的缓冲体系下,APE1将该DNA探针水解并释放出荧光基团,根据荧光信号上升速率实现对APE1活性的定量检测。在此基础上,本研究改进了检测APE1时溶液缓冲液的条件,使得该荧光探针对APE1的响应更为灵敏,并进一步通过密度梯度离心法从人全血样品提取了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用改进后的荧光探针法定量测定了其蛋白提取液中APE1的含量。最后,使用该荧光探针法测定了临床血液样本中APE1的含量。结果:本研究建立的方法对APE1的最低检测限和功能灵敏度均为0. 005 U/mL(3 pg/mL),线性范围为6 pg/mL～1. 2 ng/mL。利用该方法测定了8份人血液样品中PBMCs蛋白中APE1的含量,测得每微克PBMCs蛋白中APE1的含量分布为0. 061～0. 40 ng,平均含量为0. 16 ng APE1,加标回收率为98%±5%(n=3)。用该方法对102份正常人(男51例、女51例,年龄59～75岁)血清样品中的APE1含量进行了检测,得到这些血清样品中APE1含量的分布范围为0. 13～0. 34 ng/mL,加标回收率为96%±15%(n=3)。结论:本研究发展的荧光分析法操作简便、灵敏度高、所需生物样品量小,能够快速、准确地测定血液等生物样本中的APE1含量,解决了原有方法检测低含量血清样品时误差较大的问题,有良好的临床检验应用前景。(本文来源于《北京大学学报(医学版)》期刊2019年03期）
刘炜圳[4]（2019）在《核酸内切酶Mus81在胃癌侵袭转移中的作用及其调控机制研究》一文中研究指出第一部分Mus81在胃癌中的表达水平及其临床病理学意义目的:研究Mus81在胃癌中的表达情况,并分析其表达水平有临床病理特征的相关性。方法:通过分析TCGA数据库分析Mus81在胃癌组织中的表达水平。收集华中科技大学同济医学院附属协和医院29对胃癌手术标本(包括胃癌组织和癌旁正常粘膜组织),利用Western blot和免疫组织化学方法检测胃癌组织及癌旁组织中Mus81表达水平,并分析Mus81表达水平与临床特征的相关性。通过Kaplan-Meier plotter数据库分析Mus81表达水平与胃癌患者总生存期相关性。利用q RT-PCR和Western blot分别检测胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27和MKN45)和胃粘膜上皮细胞(GES-1)中Mus81 m RNA和蛋白的表达水平。结果:TCGA数据显示相对于正常组织(n=34),胃癌组织(n=415)中Mus81表达水平升高(P=0.003)。Western blot结果显示胃癌组织中Mus81蛋白表达水平高于癌旁正常粘膜组织(P=0.0425)。免疫组织化学显示Mus81主要表达于细胞核。胃癌组织中Mus81染色阳性率为58.62%(17/29),正常粘膜组织为27.58%(8/29)。卡方检验分析发现胃癌组织中Mus81表达水平与淋巴结转移(P=0.024)相关,但与患者性别(P=0.720)、年龄(P=0.216)、肿瘤浸润深度(P=0.453)、远处转移(P=0.527)、TNM分期(P=0.527)无明显相关性,进一步分析发现Mus81表达水平与淋巴结转移数目呈正相关(P=0.0413)。通过Kaplan-Meier分析发现Mus81高表达患者的总生存期显着低于Mus81低表达患者(P=1.6e-06)。在胃癌细胞中,Mus81 m RNA和蛋白表达水平明显高于胃粘膜上皮细胞GES-1。结论:Mus81在胃癌中表达升高,且其表达水平与胃癌淋巴结转移相关。第二部分Mus81调控ZEB1转录对胃癌转移的影响目的:研究Mus81对胃癌转移的影响及其分子机制。方法:通过Transwell实验检测胃癌细胞(AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27和MKN45)和胃粘膜上皮细胞(GES-1)迁移能力,分析Mus81表达水平与细胞迁移能力之间的关系。利用慢病毒质粒载体构建稳定敲除Mus81的SGC7901和BGC823细胞及稳定过表达Mus81的GES-1和MGC803细胞,q RT-PCR验证Mus81敲除和过表达效率。MTT、平板克隆实验检测Mus81对胃癌细胞增殖的影响,PI染色检测Mus81对胃癌细胞周期的影响,划痕实验和Transwell实验检测Mus81对细胞迁移能力的影响。利用q RT-PCR和Western blot分别检测胃癌细胞敲低Mus81后EMT相关分子(E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、ZEB2和Snail1)m RNA和蛋白的变化情况。针对ZEB1启动子设计相应引物,通过染色质免疫共沉淀实验验证Mus81与ZEB1启动子结合进而促进ZEB1转录。皮尔森系数相关性分析胃癌组织中Mus81与ZEB1表达相关性。结果:Transwell实验显示胃癌细胞(AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27)迁移能力显着强于胃粘膜上皮细胞(GES-1),与Mus81表达水平呈现一定相关性。q RT-PCR结果显示Mus81 sh RNA显着下调SGC7901和BGC823细胞中Mus81表达,过表达质粒上调GES-1和MGC803细胞中Mus81表达。MTT和平板克隆实验显示敲低Mus81对胃癌细胞增殖没有影响(P>0.05),PI染色流式检测显示敲低Mus81不影响胃癌细胞周期分布(P>0.05)。划痕实验和Transwell实验显示敲低Mus81明显抑制胃癌细胞SGC7901和BGC823迁移能力,过表达Mus81增强GES-1和MGC803迁移能力。敲低Mus81可增加E-cadherin及降低N-cadherin表达,过表达Mus81则得到相反的结果。同时,敲低Mus81可降低ZEB1 m RNA和蛋白表达,并不影响ZEB2和Snail1表达。染色质免疫共沉淀实验发现Mus81可与ZEB1启动子结合,调控ZEB1转录。皮尔森系数相关性分析显示胃癌组织中Mus81与ZEB1表达呈明显相关性(P=0.0006,r=0.5893)。结论:Mus81通过调控ZEB1转录促进胃癌细胞迁移过程。第叁部分BRD4调控Mus81表达的分子机制研究目的:研究BRD4通过Mus81调控胃癌转移及其具体分子机制。方法:利用小分子抑制剂筛选Mus81上游调控分子。通过BRD4 si RNA或BRD4抑制剂AZD5153靶向BRD4,Transwell实验验证BRD4对胃癌细胞迁移的影响及q RT-PCR、Western blot分析靶向BRD4后Mus81 m RNA和蛋白表达变化情况。通过生物信息学分析筛选介导BRD4调控Mus81表达的中间分子,确定中间分子为Sirt5后设计特异性si RNA,分别转染正常胃癌细胞及Mus81过表达的胃癌细胞,验证Sirt5对胃癌细胞迁移及Mus81表达的影响。进一步Western blot验证靶向BRD4对Sirt5表达的影响。通过构建裸鼠肺转移瘤模型,体内水平分析AZD5153和Mus81对胃癌转移能力的影响。结果:小分子抑制剂筛选显示AZD5153能显着下调Mus81 m RNA表达。q RT-PCR和Western blot显示靶向BRD4能显着抑制Mus81 m RNA和蛋白表达,Transwell实验证实抑制BRD4能降低胃癌细胞迁移能力。在敲低Mus81的胃癌细胞中,抑制BRD4表达并不能改变细胞的迁移能力。生物信息学分析显示Sirt5可能是BRD4调控Mus81表达的中间分子,敲低Sirt5后显着下调Mus81 m RNA和蛋白表达及抑制胃癌细胞迁移能力。同时在Mus81过表达的胃癌细胞中,敲低Sirt5可恢复Mus81表达及细胞迁移能力。Western blot显示靶向BRD4可下调Sirt5表达。裸鼠肺转移瘤模型显示敲除Mus81可抑制肺转移瘤形成,且AZD5153通过下调Mus81表达抑制胃癌细胞转移。结论:BRD4通过Sirt5调控Mus81表达。AZD5153抑制胃癌转移,BRD4是一种靶向抑制胃癌转移的潜在靶点。(本文来源于《华中科技大学》期刊2019-05-01）
刘盈盈[5]（2019）在《耐辐射异常球菌亲水蛋白DohL具有类分子伴侣和核酸内切酶功能并参与氧化胁迫保护》一文中研究指出大量研究发现胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)与非生物胁迫抗性相关。根据蛋白保守结构域特点,LEA分为7个家族,其中LEA3家族含有11个氨基酸组成的保守基序(motifs)。文献报道几乎所有LEA3蛋白为无序蛋白,具有类分子伴侣功能。本论文前期研究发现,耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)中含有3个与LEA同源的蛋白(DR1172,DR0105和DR1372),但其胁迫抗性机制尚不清楚。本研究中,我们鉴定了一个Deinococcus属特有的LEA3蛋白DR1172,该蛋白含有一个由11个氨基酸组成的保守基序的亲水结构域HD(Hydrophilic Domain,HD),为亲水蛋白,二级结构测定为有序结构,因此将其命名为DohL(Deinococcus ordered hydrophilic LEA3,DohL)。为研究DohL作用机制,我们从DohL结构、生理功能展开研究,主要研究结果如下:1.圆二色谱结果表明,DohL是一种具有有序结构的全新的LEA3蛋白,其α-螺旋度为26.9%,远高于已报道的LEA3蛋白。在50%甘油和50%叁氟乙醇(TFE)诱导后,DohL的α-螺旋度分别增加至93.4%和99.8%,二级结构更加有序。氧化胁迫下,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和数字PCR(ddPCR)结果显示,dohL表达量下降;而蛋白质免疫印记(Western Blot)结果显示,DohL表达量增加,推测该蛋白可能在蛋白水平发挥功能。2.表型结果显示,dohL突变后导致菌株氧化抗性减弱,表明DohL的功能与氧化胁迫抗性相关。氧化胁迫下,dohL基因的缺失导致菌体细胞过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达和酶活显着下降,进一步表明DohL蛋白能够增强耐辐射异常球菌的氧化抗性。3.HD亲水结构域均能不同程度回补突变株ΔdohL氧化抗性,尤其是回补株Com-DHD16(含有16个motifs),Com-dohL(含有8个motifs)和Com-HD(含有8个motifs)几乎完全回补突变株氧化抗性,回补株Com-THD4-1(前端4个motifs)和Com-THD4-2(后端4个motifs)回补能力相近。5个重组蛋白过表达菌株能够增强大肠杆菌的氧化胁迫抗性,抗氧化能力强弱与突变株回补实验结果一致。结果表明:HD亲水结构域对DohL发挥氧化功能至关重要,且HD的保守基序数量与抗氧化能力存在相关性。4.蛋白-蛋白互作结果显示,DohL与HD能够结合乳酸脱氢酶(LDH),氧化胁迫后,结合力显着增强。酶活和聚合度实验进一步表明,氧化胁迫下5种HD亲水结构域均能够保护氧化胁迫条件下LDH活性并防止其发生聚集。推测,DohL和HD具有类分子伴侣功能,且HD亲水结构域对DohL类分子伴侣功能的发挥至关重要。5.DohL核酸酶活性结果显示,DohL在不需要ATP的情况下能够切割环状质粒;氧化胁迫条件下,DohL催化活性高于T7核酸内切酶。推测DohL可能在清除氧化胁迫条件下DNA断裂片段中具有重要功能。综上所述,DohL是一个具有类分子伴侣和核酸内切酶功能的有序蛋白,在耐辐射异常球菌适应极端环境过程中可能发挥重要作用。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-05-01）
李玉婷,史昊强,张立奎[6]（2019）在《极端嗜热古菌DNA修复核酸内切酶的研究进展》一文中研究指出极端嗜热古菌由于生活在高温环境,其基因组DNA面临着严重的挑战,因此,它们如何维持其基因组稳定是本研究领域最为关注的科学问题之一。极端嗜热古菌具有与常温微生物相似的自发突变频率,暗示着它们比常温微生物具有更加有效的DNA修复体系进行修复高温所造成的基因组DNA损伤。目前,极端嗜热古菌DNA修复的分子机制尚不清楚。核酸内切酶在DNA修复途径中发挥着重要的作用。基因组序列显示极端嗜热古菌编码多种DNA修复核酸内切酶,但是其研究尚处于初期阶段。本文综述了极端嗜热古菌DNA修复核酸内切酶Nuc S、Endo V、Endo Q、XPF和Hjc的研究进展,并对今后的研究提出了展望。(本文来源于《微生物学报》期刊2019年10期）
陈倩倩[7]（2019）在《IRE1α核糖核酸内切酶特异性抑制剂STF-083010对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的影响》一文中研究指出背景:我国是肝病流行较为严重的国家,肝纤维化是慢性肝病的共同病理改变过程,其主要表现为胶原纤维为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏内过度沉积。肝纤维化若未能得到有效控制,可导致肝硬化,甚至肝癌,最终导致死亡。迄今为止,尚无特效药物逆转肝纤维化过程,因此,阐明肝纤维化发病机理对预防和治疗肝纤维化具有重要意义和临床应用前景。有研究表明内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与肝纤维化的发病机制密切相关。ERS传感器需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1 alpha,IRE1α)在小鼠肝纤维化模型中最早被激活,激活后的IRE1α具有蛋白激酶和核糖核酸内切酶(endoribonuclease,RNase)双重活性,其中,IRE1α寡聚化介导的反式自磷酸化反过来导致IRE1α的RNase激活。IRE1α的RNase激活不仅可以剪切mRNA,而且可特异性剪切微小RNA。另外,具有药理学抑制作用的小分子STF-083010能选择性抑制IRE1α的RNase活性而不影响其激酶活性。但是,IRE1α的RNase特异性抑制剂STF-083010在肝纤维化发病过程中是否发挥作用仍尚未可知。目的:本研究旨在探讨IRE1α的RNase特异性抑制剂STF-083010对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)诱导小鼠肝纤维化的影响。方法:将6-8周的ICR(CD-1)雄性小鼠(24-26 g)随机分成四组:对照组,单纯STF-083010组,CCl_4组,STF-083010+CCl_4组。小鼠腹腔注射CCl_4(0.15 ml/kg,按10%溶于玉米油)每周2次,共8周。在STF-083010+CCl_4组,自第六周开始至末次注射CCl_4前2h给予小鼠腹腔注射STF-083010(30 mg/kg),每周2次。末次注射CCl_4八周后剖杀所有小鼠。采用Western blot及RT-qPCR法检测IRE1α的RNase激活对CCl_4诱导小鼠肝纤维化的影响。通过血清学、病理组织学(HE、Sirius red染色和Masson's trichrome染色)及RT-qPCR检测IRE1α的特异性抑制剂STF-083010对肝纤维化小鼠肝脏坏死和炎症的影响。Western blot及免疫组化法检测STF-083010对小鼠肝脏α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达和分布的影响。另外,RT-qPCR检测STF-083010对小鼠肝脏miR-122及其下游靶基因表达的影响。结果:(1)与模型组比较,Western blot和RT-qPCR检测结果显示IRE1α的RNase特异性抑制剂STF-083010能够选择性抑制小鼠肝脏中IRE1α的RNase激活,但是对IRE1α激酶活性无抑制作用;(2)与单纯CCl_4组相比,HE染色和RT-qPCR检测结果揭示STF-083010显着减轻CCl_4处理的小鼠肝脏的坏死和炎症;(3)与模型组相比,免疫组化结果证实STF-083010明显减少CCl_4处理的小鼠肝脏中α-SMA的表达;(4)与CCl_4组相比,Sirius red和Masson's trichrome染色结果显示STF-083010显着减轻CCl_4诱导的小鼠肝纤维化;(5)机制性探索发现肝脏miR-122在CCl_4处理的小鼠中显着下调,而其靶基因如TGF-β1、MCP1、CTGF、P4HA1、Col1α1、Col1α2和Mmp9在CCl_4处理的小鼠中则被上调;有意义地是,STF-083010逆转了CCl_4诱导小鼠肝脏中miR-122下调,相应地,STF-083010显着抑制CCl_4诱导小鼠肝脏中miR-122靶基因的上调。结论:本研究结果证明了IRE1α的RNase特异性抑制剂STF-083010减轻了CCl_4诱导的小鼠肝纤维化。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-03-01）
马龙,王海月,周津,曹秀琪[8]（2019）在《基于人皮瓣核酸内切酶抗癌策略的研究进展》一文中研究指出人皮瓣内切酶1(human flap endonuclease 1,FEN1)作为一种结构特异型的5′-核酸酶,在DNA复制和修复系统中起着重要的作用.FEN1在多种癌细胞中高表达,与癌症的发生和发展密切相关.癌细胞中某些DNA修复元素的上调是对放化疗策略产生抵抗和耐药的重要原因之一,是癌症治疗的瓶颈.近年来,FEN1的作用机制被逐渐揭示,其在抗肿瘤策略开发中的意义也逐步受到重视.本文综述了FEN1的生物学功能和作用机制以及FEN1在癌症中的作用,从合成致死角度探索FEN1抑制剂抗癌的可能以及FEN1抑制剂的研究进展.(本文来源于《天津科技大学学报》期刊2019年03期）
杨焕[9]（2018）在《嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性分析》一文中研究指出DNA错配修复(Mismatch repair,MMR)是保守的损伤修复系统,能够去除DNA复制过程中由于碱基与碱基之间插入和删除所引起的错配。在原核生物中,MutS蛋白识别并结合在错配位点上,之后招募MutL蛋白形成复合物,激活MutH蛋白的核酸内切酶活性,从而切割错配位点附近无甲基化的含有GATC序列的DNA。核酸外切酶在单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein,SSB)以及UvrD解旋酶的协助作用下,将无甲基化的单链DNA从GATC位点到错配位点全部去除,之后在DNA聚合酶及连接酶的作用下完成修复。真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和哺乳动物细胞中,MutS同源物(MutS homologs,MSHs)通过形成异二聚体识别并结合碱基之间的错配以及插入和删除突变区。MSH复合物与MutL同源物(MutL homologs,MLH)相互作用在新链上产生缺口,招募其他因子促进删除并完成新链的合成。MutL同源蛋白Mlh3具有高度保守性。其C端含有DQHA(X)2E(X)4E motif,这个motif结合金属离子后可促进Mlh3核酸内切酶活性。在多种生物体中,Mlh3不仅参与错配修复过程,还参与减数分裂同源重组过程。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究通过对嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3的研究,获得主要结果如下:1.MLH3基因的序列比对及蛋白结构模拟利用DNAMAN软件对不同模式生物的MLH3基因进行同源性比对发现,与其他模式生物相比,嗜热四膜虫Mlh3氨基酸序列N端没有保守ATP结合模体。但存在DQHA(X)2E(E)4E模体及其他叁个((A/G)Q,ACX,CP/NHGRP)保守模体,共同形成了金属结合位点以及核酸内切酶活性位点。通过Swiss-Model同源建模进行嗜热四膜虫Mlh3蛋白结构的模拟,发现DQHA(X)2E(X)4E模体和C(X)HGR(X)模体空间上相互靠近,表明两个模体可能共同决定了Mlh3的离子结合和核酸内切酶活性。2.MLH3基因的合成及原核表达纯化将MLH3密码子优化为大肠杆菌偏爱的密码子并人工合成MLH3基因,构建了重组表达质粒pGEX-MLH3。定点突变Mlh3模体DQHA(X)2E(X)4E中编码天冬氨酸的CAC为编码天冬酰胺的AAC,突变编码谷氨酸的GAA为编码丙氨酸的GCA,获得重组质粒pGEX-MLH3D117N和pGEX-MLH3D117E123A。进一步通过PCR扩增获得截短CVHGRS的缺失C端84个碱基的MLH3截短突变体,获得重组质粒pGEX-MLH3D117NE123AΔ28。转化大肠杆菌重组表达了含有GST标签的蛋白GST-Mlh3、GST-Mlh3-D117N、GST-Mlh3-D117N-E123A、GST-Mlh3-D117N-E123AΔ28,通过GST亲和层析纯化得到GST-Mlh3蛋白及突变蛋白,通过12%SDS-PAGE分析获得电泳纯蛋白。3.Mlh3具有依赖于金属离子的核酸内切酶活性将Mlh3蛋白与超螺旋DNA共同孵育,琼脂糖凝胶电泳检测Mlh3对超螺旋DNA的切割效率,发现Mlh3具有核酸内切酶活性。金属离子Cu~(2+),Mn~(2+)及Mg~(2+)显着促进其内切酶活性。当加入ATP时,可以进一步促进其内切酶活性。表明ATP和金属离子协同促进了Mlh3的内切酶活性。随着超螺旋DNA片段的增大,GST-Mlh3对DNA的切割作用由产生缺口转变为完全切割为线性DNA。表明Mlh3对片段较大的超螺旋DNA具有显着的切割作用。4.Mlh3核酸内切酶活性位点分析将GST-Mlh3-D117N,GST-Mlh3-D117N-E123A作用于超螺旋DNA,发现GST-Mlh3-D117N,GST-Mlh3-D117N-E123A内切酶活性均降低。进一步将C末端的C(X)HGR(X)结构域截除突变,与GST-Mlh3-D117N和GST-Mlh3-D117N-E123A相比,该突变体内切酶活性进一步降低。表明这两个模体共同决定了Mlh3的离子结合和核酸内切酶活性。5.HA-Tag免疫共沉淀鉴定出多种与Mlh3相互作用的因子通过对HA-Mlh3细胞株减数分裂时期的蛋白样进行免疫共沉淀实验,12%SDS-PAGE电泳银染分析及Western-blotting检测后,将目的蛋白样进行质谱分析。结果显示,存在多种潜在的因子与Mlh3存在相互作用,包括MutS domainⅢ家族蛋白,减数分裂重组蛋白Dmc1,减数分裂DSB修复相关蛋白Mnd1,以及染色体结构维持相关蛋白Smc2,Smc4等蛋白。将嗜热四膜虫DMC1,MND1基因密码子优化为大肠杆菌偏爱的密码子,合成的MND1,DMC1基因进一步构建获得重组质粒且通过原核表达纯化得到His-SUMO-Mnd1,His-SUMO-Dmc1蛋白。将GST-Mlh3分别与His-SUMO-Mnd1,His-SUMO-Dmc1蛋白进行Pull-down检测,发现Mlh3与Mnd1及Dmc1在体外存在直接的相互作用。总之,本研究通过合成MLH3基因并在大肠杆菌重组表达,纯化获得GST-Mlh3蛋白,酶活分析表明Mlh3具有依赖于金属离子的核酸内切酶活性。HA-Mlh3免疫共沉淀鉴定出了多个与其在嗜热四膜虫减数分裂过程中可能存在相互作用的因子。表明Mlh3通过金属离子依赖的核酸内切酶活性及与其他因子相互作用在减数分裂错配修复过程中发挥功能。本研究为进一步研究错配修复蛋白在减数分裂过程中作用机理提供重要数据。(本文来源于《山西大学》期刊2018-06-01）
杨焕,许静,王伟[10]（2018）在《金属离子促进嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性》一文中研究指出嗜热四膜虫有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究人工合成MLH3(TTHERM_001044369)基因,构建重组表达质粒p GEXMLH3,转化大肠杆菌BL21(DE3)并获得重组表达的GST-Mlh3蛋白。纯化的GST-Mlh3蛋白在配位不同的金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)后,有效切割超螺旋质粒DNA。ATP和ADP可进一步促进Mlh3的核酸内切酶活性。突变Mlh3中离子结合模体DQHA(X)2E(E)4E中的D117和E123位点,Mlh3D117N/E123A的核酸内切酶活性降低。进一步删除离子结合和ATP结合位点的C端结构域,突变体的核酸内切酶活性进一步降低,表明Mlh3的核酸内切酶活性是离子依赖型。减数分裂期HA-Mlh3免疫共沉淀鉴定了Mlh3可能的相互作用因子链交换蛋白Dmc1、DSB修复蛋白Mnd1、Mut S、染色体维持蛋白Smc2和Smc4。结果表明,四膜虫的Mlh3通过金属离子依赖的内切酶活性,以及与其他因子相互作用,在减数分裂错配修复和同源重组过程中发挥重要作用。(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2018年05期）
核酸内切酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
由DNA甲基转移酶(DNMT1)催化的DNA甲基化在许多生物过程中起重要作用,包括基因转录,基因组印记和细胞分化~([1])。本文利用特异性酶切法成功开发了一种有效的测定DNMT1的电化学方法。首先,将硫醇修饰的双链DNA(dsDNA)自组装固定在金电极上,随后DNMT1识别dsDNA半甲基化序列并实现完全甲基化,最后通过甲基化特异性限制酶(BSSHⅡ)剪切,未发生完全甲基化的碱基序列将被剪切并移除电极表面。利用差分脉冲伏安法(DPV)分别测定剪切前后的亚甲基蓝(MB)还原电流。在最佳优化条件下,该方法线性范围为0.5 nM～50 nM,检测限为0.5 nM。这种方法可以简单有效地检测DNA甲基化和DNMT1活性,在DNA甲基化快速检测和基因毒理分析方面具有一定的实际意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核酸内切酶论文参考文献
[1].尹紫良,王长丽,葛菁萍.酿酒酵母W5核酸内切酶基因HO的克隆及生物信息学分析[J].生物技术通讯.2019
[2].白雪娇,鲁理平,康天放.基于甲基化核酸内切酶的甲基转移酶活性的电化学检测研究[J].化学研究与应用.2019
[3].王嘉禹,赵美萍.荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性[J].北京大学学报(医学版).2019
[4].刘炜圳.核酸内切酶Mus81在胃癌侵袭转移中的作用及其调控机制研究[D].华中科技大学.2019
[5].刘盈盈.耐辐射异常球菌亲水蛋白DohL具有类分子伴侣和核酸内切酶功能并参与氧化胁迫保护[D].中国农业科学院.2019
[6].李玉婷,史昊强,张立奎.极端嗜热古菌DNA修复核酸内切酶的研究进展[J].微生物学报.2019
[7].陈倩倩.IRE1α核糖核酸内切酶特异性抑制剂STF-083010对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的影响[D].安徽医科大学.2019
[8].马龙,王海月,周津,曹秀琪.基于人皮瓣核酸内切酶抗癌策略的研究进展[J].天津科技大学学报.2019
[9].杨焕.嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性分析[D].山西大学.2018
[10].杨焕,许静,王伟.金属离子促进嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性[J].中国生物化学与分子生物学报.2018
论文知识图
