张月梅[1]2014年在《绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白与绵羊透明质酸酶2相互作用初探》文中提出研究背景：绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis, OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病。JSRV为p反转录病毒属成员,其env基因主要编码囊膜蛋白(JSRV-Env),包括表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)两个亚基。有研究表明,绵羊透明质酸酶2(hyaluronidase2, Hyal-2)在绵羊体内作为内、外源性JSRV细胞受体起作用。但有关绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基之间相互作用的研究资料尚比较缺乏。研究目的：绵羊Hyal-2作为JSRV进入绵羊机体细胞的受体起作用,因此,深入研究绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基(SU、TM)之间的相互作用,对于揭不JSRV侵染细胞及致瘤机理具有重要意义。研究方法：(1)运用重迭PCR方法扩增绵羊透明质酸酶2基因(hyal-2),并运用生物信息学软件对其表达蛋白结构进行预测。(2)构建绵羊透明质酸酶2(Hyal-2)的真核表达载体,为后期建立相关稳定表达细胞系及进行病毒感染性试验提供实验平台。(3)构建JSRV-Env及其亚基(SU、TM)真核表达载体,通过瞬时转染及测序验证真核表达载体的构建是否成功；通过激光共聚焦方法观察细胞内蛋白之间的共定位情况；用免疫共沉淀法及双分子荧光互补系统对受体与Env结合亚基进行验证。(4)运用重迭PCR方法扩增缺失型su基因,然后构建一系列表达缺失型SU蛋白的真核表达载体,通过瞬时转染及测序验证真核表达载体的构建是否成功；通过激光共聚焦方法观察细胞内蛋白之间的共定位情况：运用免疫共沉淀法及双分子荧光互补系统对Hyal2与SU亚基可能结合区域进行预测,为进一步揭示JSRV致瘤机制奠定基础。(5)用荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中单独转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)载体后pik3ca基因和ras基因表达量的变化；用荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中分别共转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)载体和pDsRed-monomer-N1-hyal2载体后pik3ca基因和ras基因表达量的变化。研究结果：(1)运用重迭PCR方法成功扩增出hyal-2基因,并对其结构进行了预测。(2)成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的表达绵羊Hyal-2蛋白的真核表达载体。(3)运用免疫共沉淀法和双分子荧光互补系统验证了Hyal-2蛋白与Env及SU亚基蛋白的结合；运用激光共聚焦显微镜确定了Env和SU与Hyal-2蛋白之间存在共定位情况,TM与Hyal-2蛋白之间不存在共定位。(4)成功构建了一系列缺失型PEGFP-C1-(sul-su5)真核表达载体,并与pDsRed-monomer-N1-hyal-2共转染,实现其在真核细胞中与Hyal-2蛋白的共表达。运用激光共聚焦方法确定了缺失型SU.蛋白蛋白与Hyal-2蛋白之间存在共定位情况；免疫共沉淀方法及双分子荧光互补系统对受体与SU蛋白可能结合区域进行了预测,结果表明SU1-SU5缺失型蛋白均不与绵羊Hyal-2蛋白结合,证明SU1-SU5蛋白所缺失的区域对于绵羊Hyal-2蛋白与Env的结合及相互作用都是非常重要的。这为进一步确定绵羊Hyal-2蛋白与SU蛋白结合位点奠定了基础。(5)荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中单独转染pEGFP-Cl-(env、 su、tm)后,pik3ca基因和ras基因表达量与对照组相比显着升高。分别共转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)和pDsRed-monomer-N1-hyal2后,pik3ca基因和ras基因表达量与对照组相比显着降低。研究结论：(1)扩增出绵羊hyal2基因并对Hyal-2蛋白结构进行了预测,成功构建了Hyal2真核表达载体且在293T细胞中获得表达,Hyal2是分子质量为54.190kD的一种亲水性蛋白。(2)构建了JSRV-Env及其亚基SU、TM的真核表达载体并实现其在293T细胞中的表达。(3)用构建的pEGFP-Cl-(env、su、tm)真核表达表达载体与hyal-2真核表达载体pDsRed-monomer-N1-hyal2共转染293T细胞,实现其在293T细胞内的共表达,证实Env、SU与Hyal2存在相互作用,TM与Hyal2未发生相互作用。(4)缺失型sul-suS基因表达产物影响与Hyal-2蛋白的结合,其中su基因的238bp-867bp域对这种结合是必须的。(5)分别转染构建的pEGFP Cl-(env、su、tm)真核表达载体的NIH3T3细胞中,pik3ca和ras基因表达量显着升高；而共转染构建的pEGFPC1-(env、su、tm)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2真核表达载体的NIH3T3细胞中, pik3ca和ras基因表达量显着降低。
葛金英[2]2003年在《绵羊肺腺瘤病毒ENV基因的克隆、序列分析与原位杂交检测》文中提出绵羊肺腺瘤病(Sheep Pulmonary Adenomatosis SPA)是一种传染性肺癌，并可实验复制。SPA与人的支气管上皮细胞癌(Bronchioloalveolar carcinoma BAC)极为相似，是研究BAC的天然动物模型。D型反转录病毒(JSRV)是SPA的真正病原。 我们对四例被检绵羊进行病理学检查，初步诊断为SPA，进一步进行分子水平研究，根据国外报道的外源性绵羊肺腺瘤病毒env基因序列，设计外源性病毒特异引物，以绵羊总DNA内的exJSRV前病毒DNA为模板，PCR扩增，确诊被检绵羊为SPA。将PCR产物纯化，并与pueM-T载体相连，转化大肠杆菌，经PCR，酶切鉴定及序列测定，得知所得env片段与Ⅰ型JSRV同源性为88％，与Ⅱ型JSRV同源性为87％，证明所克隆基因为外源性目的基因，至此，我们在国内首次获得了env阳性克隆。 Env基因编码的囊膜蛋白包括亲水性的表面蛋白(SU)和疏水性的跨膜蛋白(TM)，TM决定病毒粒子和细胞膜受体之间的相互作用，而SU是高变异基因元件，含有受体结合位点和主要的抗原决定簇。 用地高辛随机引物法标记exJSRV特异的env片段，制备探针，原位杂交检测SPA肺组织中的RNA及前病毒DNA，结果表明SPA患羊肺组织内有JSRVenv基因mRNA的表达，同时也检测到了前病毒DNA，而相应的阴性对照却无阳性信号，证实外源性病毒特异的DNA探针在致瘤性前病毒的整合位点和整合的外源性前病毒的检测中具有可信度。
苏佳[3]2011年在《内源性绵羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表达》文中指出研究背景:内源性绵羊肺腺瘤病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovirus ,enJSRV)序列与外源性绵羊肺腺瘤病毒序列密切相关。在绵羊肺腺瘤病的发病过程中,虽然enJSRV不对OPC的发生有直接地致瘤作用,但是在正常羊的个体发育过程中,enJSRV的表达可能会对exJSRV的感染和OPA(Ovine pulmonary adenomatosis)疾病的发生有影响。实验目的:克隆内源性绵羊肺腺瘤病毒的env基因,将内源性env基因重组进入原核表达体系中,尝试诱导内源性env基因进行原核表达。为制备内源性env基因多克隆抗体奠定基础。研究方法:参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与3’长末端重复序列保守区序列设计引物,以正常地绵羊肺脏基因组为模板,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤env基因与3’长末端重复序列;将克隆的内源性env基因通过相应的酶切位点,亚克隆到原核表达载体pET-32a中,再转化入大肠杆菌BL21中后用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE分析内源性env基因编码的蛋白表达并应用Western-Blotting鉴定。用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白并应用Western Bloting鉴定。实验结果表明:利用PCR成功扩增内源性env基因与3’长末端重复序列,测序得目的片段长度为2249bp,与预期片段长度一致;内源性env基因在原核表达体系中可以少量表达,其原核表达蛋白的表观分子量为89kDa;对内源性env基因编码表达的蛋白质经Western-Blotting鉴定,实验成功表达内源性env基因编码的蛋白;用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白,通过Western Bloting鉴定表明纯化结果仅有一条带。综上所述,在我国,此次实验首次克隆了内源性env基因,并将内源性和外源性env基因进行比较。尝试表达内源性env基因编码的蛋白质,为进一步研究env基因在绵羊肺腺瘤疾病的感染,疾病发生、发展中,以及内源性env基因在正常动物体内的生理功能与所起作用奠定小小的基础。
参考文献：
[1]. 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白与绵羊透明质酸酶2相互作用初探[D]. 张月梅. 内蒙古农业大学. 2014
[2]. 绵羊肺腺瘤病毒ENV基因的克隆、序列分析与原位杂交检测[D]. 葛金英. 内蒙古农业大学. 2003
[3]. 内源性绵羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表达[D]. 苏佳. 内蒙古农业大学. 2011