重组单增李斯特菌TatD-like DNase蛋白的核酸酶活性分析

论文摘要

为研究单增李斯特菌TatD-like DNase蛋白的序列结构与表达纯化后蛋白的酶学特性。本研究应用PCR扩增得到单增李斯特菌10403s株的Tat D-like DNase基因,利用生物信息学系统性预测分析其序列结构特征。然后将目的基因亚克隆至原核表达载体p ET32a构建重组表达质粒（p ET32a-Tat D-like DNase）,转入大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导表达、亲和层析法纯化后采用SDS-PAGE和Western blot进行分析,将纯化的蛋白透析后进行酶学特性分析。单增李斯特菌10403s株Tat D-like DNase蛋白由265个氨基酸组成,理论蛋白分子量为30.16 k D,其氨基酸序列与其它34种微生物的Tat D-like DNase及其类似物的同源性较低。Tat D-like DNase为亲水性蛋白,含有5个优势B细胞抗抗原表位。二级结构分析,Tat D-like DNase蛋白主要由29.81%的无规则卷曲、49.43%的α-螺旋、16.6%的β-折叠和4.15%的β-转角构成。SDS-PAGE和Western blot结果显示Tat D-like DNase重组蛋白约55 k D,主要以包涵体形式表达。Tat D-like DNase蛋白具有核酸酶活性,并且酶学活性的发挥具有一定的蛋白浓度依赖性,受到温度和PH的影响。本实验对单增李斯特菌Tat D-like DNase蛋白进行了序列分析,同时得到了纯化后的重组原核表达蛋白,并检测了该蛋白的功能特性。为进一步研究Tat D-like DNase在单增李斯特菌感染中的作用奠定基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒载体

1.2 主要试剂

1.3 引物设计与合成

1.4 TatD基因的克隆与鉴定

1.5 同源性分析

1.6 理化性质分析

1.7 结构分析

1.8 重组表达质粒p ET-32a-TatD-like DNase的构建与鉴定

1.9 TatD-like DNase的表达纯化后的SDS-PAGE与Western-blot分析

1.1 0 TatD-like DNase蛋白的酶学特性分析

1.1 0. 1 TatD-like DNase蛋白的酶学活性检测

1.1 0. 2 不同量的TatD-like DNase蛋白对其酶活的影响

1.1 0. 3 不同PH环境对Tat D蛋白酶活的影响

1.1 0. 4 不同温度对TatD蛋白酶活的影响

2 结果

2.1 TatD-like DNase基因的克隆与鉴定

2.2 同源性分析

2.3 理化性质分析

2.4 抗原表位预测

2.5 重组表达质粒的构建与鉴定

2.6 TatD-like DNase的表达纯化后SDS-PAGE和Western-blot分析

2.7 TatD-like DNase的活性检测

2.7 不同量的TatD-like DNase对活性的影响

2.8 不同PH对TatD-like DNase活性的影响

2.9 不同温度对TatD-like DNase活性的影响

3 讨论

文章来源

类型: 国内会议

作者: 毛福超,张梦珂,廖成水,贾艳艳,王晓利,郁川,余祖华,何雷,李静,张春杰,李银聚,吴庭才,程相朝

关键词: 单增李斯特菌,表达纯化,酶学特性

来源: 中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会 2019-07-27

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南科技大学动物科技学院/洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南科技大学医学院洛阳职业技术学院

分类号: S852.61

页码: 491-506

总页数: 16

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