徐文瑜李洁招达文徐业梅（湛江市妇幼保健院广东湛江524000）
【中图分类号】R722.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)32-0015-02
【摘要】目的提高新生儿外周血染色体细胞培养成功率。方法本文共收集42例新生儿样本。用经适当改良法培养：离心沉淀法获取富集T淋巴细胞全血层；接种量减至0.1ml/每5ml1640培养基；延时培养至96h实施阻断（其中前20份样本同时作常规法培养对比)。计算淋巴细胞转化率、有丝分裂相比率对培养效果进行评估。结果常规组淋巴细胞转化率为71.95%，分裂相比率为6.92%；改良组淋巴细胞转化率为86.95%，分裂相比率为9.59%，两种培养效果之间有显著性差异，P<0.05。结论对新生儿外周血染色体细胞培养经过适当的改良，效果满意。
【关键词】新生儿染色体细胞培养改良
来自新生儿染色体细胞培养的不利影响是新生儿常见病本身：高胆红素血症、缺血缺氧、感染、贫血、出凝血障碍及药物治疗等因素。据资料[1、2]显示培养成功率是偏低的。近2年，本文根据新生儿外周血生理特征对外周血染色体培养技术多个环节进行适当改良，为提高培养成功率作了一些探讨。
1材料与方法
1.1对象2007年9月至2009年10月于我院新生儿科住院新生儿40例，门诊2例，年龄在30分钟至1周之间。前20例同时用两种方法进行对比观察，编为常规组和改良组。
1.2方法
1.2.1穿刺部位常规消毒，抽取2ml静（动）脉血经肝素抗凝。常规法（即微量全血法）：0.3ml全血接种于/每5ml1640培养基，每例2瓶，培养72h加秋水仙素阻断。改良法：把2ml全血移入无菌细玻璃试管（加帽），离心沉淀3分钟1000转/分。于酒精灯前弃除血浆，点吸红细胞表面灰层200ul分别接种于2份1640培养基中。火焰前封盖，轻轻摇匀置37℃温箱培养96h(其中前20份标本同时用常规法培养对比)。加秋水仙素0.5ug/ml培养3小时后收获细胞。将2份培养液合倒入一支离心管中，按常规37℃低渗、固定，制成0.5-0.6ml细胞悬液,,滴6张片、老化、消化、染色。
1.2.2通过淋巴细胞转化率和分裂相比率来评估改良法的效果。转化淋巴细胞判别标准：于油镜下，根据淋巴细胞的体积大小、形态、细胞直径、核大小、染色质、核仁等特征进行转化淋巴细胞（母细胞型和过渡型）判别。观察500个淋巴细胞计算淋巴细胞转化率。淋巴细胞转化率=（转化细胞数/转化细胞数+未转化细胞数）×100%。高倍镜下，每份标本随机观察扫描1000个细胞，计算分裂相比率。
1.2.3统计学处理：用t检验两种时间培养效果有显著性差异，P<0.05。
2结果
2.1淋巴细胞转化率改良组为86.95%，常规组为71.95%。两组差异显著。
2.2分裂相比率改良组为9.59%，常规组为6.92%。两组差异显著。
3讨论
3.1目前通用的微量全血法把接种量规定为0.3ml至0.5ml。本文离心沉淀仅采用0.1ml接种量是超微量。超微量接种建立在以下理论根据上：①新生儿WBC计数值在15-25×109/L，淋巴细胞绝对值约为10.5-17.5×109/L。用于染色体培养的T淋巴细胞约占外周血淋巴细胞的70%[3]。②人类外周血中各种血细胞比重有差异：红细胞、多核型细胞比重较大约为1.092，淋巴细胞约为1.07-1.090，血小板为1.032[4]，离心后红细胞、多核型细胞位于淋巴细胞下层，位于红细胞表面灰层区富集着T淋巴细胞和血小板（后者含有刺激细胞分裂的生长因子）[5]。采用超微量富集T淋巴细胞层进行接种，保证了5ml培养基的充足营养能量消耗和细胞生长繁殖空间。0.1ml双瓶培养收获后所得细胞悬液0.5-0.6ml足够滴制成6张染色体标本片。
3.2弃除血浆、红细胞是最大限度降低细胞毒性对培养的影响。对住院新生儿而言，血浆是药物分子转运停留较长时间的场所。血浆中大量的蛋白质在合成过程要消耗氨基酸等原料，补体成份、免疫球蛋白、间接胆红素等血浆物质均对T淋巴细胞繁殖生长不利。新生儿红细胞占全血比积约60-70%，Hb约为170-220g/L，其中抗碱Hb以HbF为主约占50-85%，原代T淋巴细胞培养过程不耐受PH的波动，新生儿较高的红细胞比积和特殊的Hb成份加上诸如药物、间接胆红素等对PH的影响值得关注。
3.3本文在实验过程中发现，培养延时至96h加入秋水仙素进行阻断可提高淋巴细胞转化率、有丝分裂相比率。对20份标本同时作72h和96h培养，进行观察：培养72h的淋巴细胞转化率为71.95%。培养96h的淋巴细胞转化率为86.95%。新生儿外周血细胞培养延时至96h收获，可获得丰富的淋转细胞和分裂相。
3.4关于感染，本文体会到污染并不是影响新生儿外周血染色体细胞培养的主要因素。本文42例共计接种瓶数为124支,仅1例发生污染,发生率为0.8%。采用适当改良法在离心接种过程中有暴露，但只要操作前规范洗手、常规消毒、对接种空间、离心器皿进行相应灭菌、消毒，保持常用器皿的干燥，污染不难避免。
参考文献
[1]叶兹礼,李文典.新生儿外周血淋巴细胞培养中几种影响因素的分析.中国优生与遗传杂志,2000,8(1):33.
[2]吕巍,王昕,王成等.183例胎儿脐血及新生儿外周血染色体核型分析.中国优生与遗传杂志,2006,14(4):46.
[3]丁显平.医学细胞遗传学检验的质量控制.中国优生与遗传杂志,2001,9(1):53.
[4]刘晖,吕世静.临床免疫学和免疫检验实验指导.第2版.2002,10.
[5]李璞.医学遗传学,第1版,人民卫出版社.1989:156.