董毅1徐哲2
（1大连大学附属新华医院辽宁大连116021；2辽宁省大连市中心医院辽宁大连116031）
【中图分类号】R259【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2010）34-0429-02
【摘要】目的观察炉栗散对糖尿病难愈性创面愈合的影响。方法建立家兔糖尿病缺血创面模型，随机分成两组，分别使用炉栗散和凡士林纱条外敷，观察3、7、14天创面组织成纤维细胞数量、血清TGF-β1水平变化和创面大小的变化。结果在3、7、14天炉栗散组TGF-β1水平变化和成纤维细胞数量变化均与与对照组有显著性差异，7、14天创面大小变化与对照组有显著性差异（P＜0.05）。结论炉栗散组方能有效促进创面的愈合，值得在临床推广使用。
【关键词】创面TGF-β1成纤维细胞
糖尿病难愈性创面在临床中屡见不鲜，不但严重影响生活质量，甚至可以造成截肢等严重后果，目前对其治疗尚缺乏有效的方法。炉栗散是本人在经典方剂的基础上加减制备而成的外敷粉剂，在临床应用中能有效促进创面的愈合，通过本实验来证实其疗效，为临床应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验动物大耳白兔20只，由大连医科大学提供，体重2.5kg±100g，平静饲养一周后，依据随机表格法，分为2组，每组10只，即实验组和对照组。
1.2实验药物炉栗散组方：炉甘石、黄柏、煅石膏、片栗粉、冰片等。由辽宁中医药大学制剂室制备成超微粉剂。
1.3主要实验试剂和实验仪器0.1%盐酸氯胺酮（福建古田制药股份有限公司）；四氧嘧啶，试剂编号：2244-11-5，瑞士FULKA公司产品，（由太阳生物有限公司提供）；Caresens血糖仪，编号：CSPI5F01611；Caresens试纸，编号：GA13CC95C，韩国i-SENS公司产品；转化生长因子多克隆抗体TGF-β1，二抗抗体，工作浓度1：200，均由太阳生物有限公司提供；手动打孔仪，大连泛邦公司产品；BX51/52系统显微镜，日本Olympus产品。SX-100计算机图像分析仪，美国IBM公司产品。
1.4方法
1.4.1实验动物
造模前均测定血糖和尿糖含量，超出正常剔除。于造模前一周按150mg/kg腹腔注射3%四氧嘧啶，一周后查血糖浓度大于11mmol/L以及尿糖为+++至++++时认为糖尿病模型制作成功。同时结扎兔耳单侧中央动脉及头侧动脉总干造成缺血模型，使用活检打孔器在各组兔耳腹侧面中央制成直径1.8cm的圆形皮肤缺损创面，其中心位置距离耳尖4cm。刮除软骨膜，暴露软骨，双层油纱覆盖，双层X光片固定兔耳。创面均为单侧，每天生理盐水清洁创面后对照组外敷凡士林油纱条，炉栗散组外敷炉栗散纱条，范围以能够覆盖创面即可。正常饮食水每天检查血糖浓度，低于11mmol/L时补注四氧嘧啶，使血糖浓度控制在11-16mmol/L之间。
1.4.2研究方法
分别于第3、7、14天取创面边缘组织，每次每只各两块，同时抽取耳缘静脉血1ml，处理及观察方法如下：
①成纤维细胞观察方法
取一块组织置于4%多聚甲醛中固定，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤后，制成组织切片，H-E染色，在40倍光镜下观察4个不同视野，并记数。
②创面大小观察方法
分别于取组织时候测量创面的大小（mm），并记录。
③TGF-β1血清浓度的观察
均采取双抗夹心ELISA法，将抽取的血液3000r/m离心，提取血清，至于-20℃冰箱中保存。抗兔TGF-β1单抗包被于酶标板上，兔血清中的TGF-β1会与单抗结合，加入生物素化的抗兔TGF-β1二抗，它将与结合在单抗上的兔TGF-β1结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，多余的物质将被洗去，加入TMB染色。根据OD值查找出TGF-β1（EGF）的浓度。兔的TGF-β1（EGF）浓度与OD（450nm）成正比。
2结果
各组不同阶段TGF-β1水平变化见表1，炉栗散组和对照组相比在3、7、14天TGF-β1水平变化有显著性差异；不同时期成纤维细胞数量变化见表2，炉栗散组和对照组相比在3、7、14天均有显著性差异；创面大小变化见表3，显示炉栗散组和对照组相比在3天无显著性差异，7、14天均有显著性差异。
3讨论
糖尿病难愈性创面也称糖尿病溃疡，因多发生在足部故称糖尿病足，是糖尿病患者常见的并发症之一。造成糖尿病溃疡难以愈合的原因很多，可能和局部生长因子的缺乏、成纤维细胞数量减少或者微循环障碍等有关[1]。其中对生长因子的研究是目前热点之一。有研究表明[2]：难愈性创面通常表现为修复不足，缺少生长因子的分泌可能和TGF-β1水平下降有关。TGF-β1是一种多功能的多肽生长因子，近年发现在创面愈合过程中起重要作用，能直接刺激成纤维细胞外基质、胶原、氨基葡糖等的合成，并对新生细胞基质的降解有明显的抑制作用，另外，TGF-β1可以促进肉芽组织的形成，但以促进胶原的形成和沉淀为主要特征，体外实验表明，TGF-β1对上皮细胞具有趋化作用，对角质细胞的增生有抑制作用，在不同创面中，TGF-β1的表达时间和方式是不同的[3]。KimBC[4]等观察在下肢静脉性溃疡中，TGF-β1的表达明显受到抑制，与该病在临床中的表现相吻合。JudeEB[5]等研究糖尿病足创面中TGF-β1的表达，并与正常组合对比，发现糖尿病足创面中的表达明显延迟和降低；WuL[6]等局部应用TGF-β1治疗下肢糖尿病缺血性溃疡，取得了满意的效果，表明TGF-β1的缺乏是导致创面难以愈合的原因之一。炉栗散能促进创面的愈合可能和刺激TGF-β1的分泌有关。通过本实验显示：炉栗散对糖尿病缺血难愈性创面具有促进创面愈合的作用，在3、7、14天炉栗散组TGF-β1水平变化和成纤维细胞数量变化均与与对照组有显著性差异，7、14天创面大小变化与对照组有显著性差异（P＜0.05）。但其具体作用机制尚不清楚，有待以后实验中不断完善。
参考文献
[1][2]周岗，李海红，付小兵.糖尿病足溃疡的研究现状（J）.中国临床康复杂志，2004，33（8）：540.
[3]王雪，牛星焘，陈东明.PDGF、TGF-β1在人体断层皮片供区创面愈合过程中的基因表达及意义.中华整形烧伤外科杂志，1998，14（5）：358-360.
[4]KimBC,KimHT,ParkSH,ChaJS,YufitT,KimSJ,FalangaV.FibroblastsfromchronicwoundshowalteredTGF-beta-signalinganddecreasedTGF-betatypeⅡreceptorexpression.JCellPhysiol.2003Jun;195(3):311-6.
[5]JudeEB;BlakytnyR;BulmerJ;Transformingfactor-beta1,2,3andreceptortypeⅠandⅡindiabeticfootulcers.DoabetMed.2002Jun:19(6):440-7.
[6]WuL;XiaYP;RothSI;GruskinE.Transforminggrowthfator-beta1failstostimulatewoundhealingandimpairsitssignaltransductioninanagedischemiculcermodel:importanceofoxygenandage.AmJPathol.1999Jan:154(1):301-9.