基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

论文摘要

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA （Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV）,并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a（+）中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为（2.57±0.12）×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23<F0.05 （9,20）,证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 姚琳,逄凤娇,张奇,庞倩倩,李风铃,江艳华,王联珠,翟毓秀

关键词: 甲肝病毒,噬菌体,装甲,标准参考样品,实时荧光

来源: 微生物学通报 2019年01期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室农业部水产品质量安全风险评估实验室(青岛),山东华宇工学院

基金: 国家科技基础性工作专项(2013FY113300),中国水产科学研究院基本科研业务费专项(2016HY-ZD11),国家贝类产业技术体系(CARS-47)~~

分类号: R373

DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180146

页码: 209-216

总页数: 8

文件大小: 767K

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