论文摘要
研究目的:Tim-1是Tim（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein,Tim）家族中第一个被发现的成员,最早发现其表达在激活的CD4+T细胞表面,尤其在Th2型细胞表面有高水平的表达。Tim-1在正常肾脏不表达或低表达,但在肾缺血或急性肾损伤后,Tim-1高表达于肾小管上皮细胞。我们此前利用系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Eythematosus SLE）模型鼠NZB×NZW F1小鼠,将小鼠狼疮性肾炎易感基因定位于11号染色体长臂20cM附近,此处存在Tim-1、Tim-3和Tim-4等免疫相关基因。我们的研究发现,新西兰白鼠（NZW）和新西兰黑鼠（NZB）的Tim-1的cDNA序列存在多态性,生物信息学研究提示,NZB型Tim-1编码蛋白的胞浆区丢失了酪氨酸磷酸化位点,而酪氨酸磷酸化位点在Tim-1的信号转导中发挥重要作用。该位点的缺失是否影响小鼠狼疮肾炎的易感性成为我们研究的主要目的。有文献报道在猪肾小管上皮LLC-PK1细胞系中过表达小鼠Tim-1基因使细胞因子IL-6和MCP-1显著增多。因此,本实验拟构建带有NZB、NZW及C57BL/6型小鼠Tim-1基因的慢病毒表达载体,建立稳定表达小鼠Tim-1的LLC-PK1细胞系,通过检测上述不同小鼠Tim-1分子过表达对LLC-PK1细胞分泌IL-6、MCP-1等细胞因子水平的影响,研究NZB型小鼠Tim-1基因对肾小管上皮细胞功能的影响。研究方法:1、NZB、NZW及C57BL/6小鼠Tim-1 cDNA慢病毒表达载体构建;2、NZB、NZW及C57BL/6小鼠Tim-1慢病毒包装及滴度测定;3、NZB、NZW及C57BL/6小鼠Tim-1慢病毒表达:NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1慢病毒转染LLC-PK1细胞后,嘌呤霉素筛选10-14天荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式检测各组Tim-1的表达情况;4、NZB、NZW及C57BL/6小鼠Tim-1过表达细胞系的细胞因子检测:抗小鼠Tim-1单克隆抗体（RMT1-4）5μg/ml刺激24h,提取细胞总mRNA,Realtime PCR检测过表达Tim-1的LLC-PK1细胞中细胞因子MCP-1、IL-6 mRNA相对表达量;5、统计学处理:使用Prism7.0软件对数据进行处理,标本采用方差分析和Bonferroni校正法对数据做统计分析,P<0.05代表差异具有统计学意义。研究结果:1、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1 cDNA慢病毒表达载体构建成功;2、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1慢病毒包装滴度分别为NZB:1.09×108TU/ml;NZW:7.96×107TU/ml;C57BL/6:1.09×108TU/ml;3、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1慢病毒转染LLC-PK1细胞获得稳定表达,流式检测3组转染细胞结果显示绿色荧光蛋白表达均达到98%以上,阴性对照组和空病毒组没有Tim-1表达,而NZB、NZW及C57BL/6组有不同程度的Tim-1表达;4、用抗小鼠Tim-1单克隆抗体（RMT1-4）刺激过表达Tim-1的LLC-PK1细胞,24小时后检测细胞因子MCP-1和IL-6 mRNA表达水平。抗小鼠Tim-1抗体（RMT1-4）能上调Tim-1+LLC-PK1细胞中MCP-1（NZB、NZW组）以及IL-6（NZB、C57BL/6组）mRNA表达水平（P<0.01）;与Tim-1抗体（RMT1-4）结合后,NZB型Tim-1+LLC-PK1细胞中MCP-1及IL-6 mRNA表达水平显著高于NZW型及C57BL/6型Tim-1+LLC-PK1细胞（P<0.05）。结论:1、抗Tim-1单克隆抗体（RMT1-4）能促进Tim-1+LLC-PK1细胞中趋化因子和炎症因子的产生。2、NZB型Tim-1胞内区丢失的酪氨酸磷酸化位点导致肾上皮细胞炎症因子分泌增加。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张毅
导师: 祁赞梅
关键词: 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子,系统性红斑狼疮,单核细胞趋化蛋白,白细胞介素,猪肾上皮细胞
来源: 中国医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,生物学,内分泌腺及全身性疾病,泌尿科学
单位: 中国医科大学
分类号: Q78;R593.242
DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.000430
总页数: 46
文件大小: 1535K
下载量: 61
相关论文文献
标签：细胞免疫球蛋白黏蛋白分子论文; 系统性红斑狼疮论文; 单核细胞趋化蛋白论文; 白细胞介素论文; 猪肾上皮细胞论文;