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酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

论文摘要

目前关于环境雌激素（environmental estrogens,EEs）的效应评估大多数是基于人的雌激素受体（estrogen receptor,ER）的离体检测,缺乏EEs对鱼类ER影响的研究。本研究利用酵母双杂交技术构建模式生物稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母,用以快速检测EEs的雌激素活性并研究不同ER亚型对17β-雌二醇（E2）敏感度的差异。采用反转录多聚酶链反应法获取稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2的配体结合域（LBD）序列,构建并鉴别诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、p GBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD。将诱饵质粒和猎物质粒pGAD424-GRIP1同时转化荧光酵母Y187-Luc,分别构建3株稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母,并考察了E2、双氢睾酮（DHT）、9-顺维甲酸（9-cis RA）、三碘甲状腺原氨酸（T3）和孕酮（PG）对荧光素酶的诱导情况。结果显示:ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母能够专一性地被E2诱导产生荧光素酶,并存在显著的剂量-效应关系,半数效应浓度(EC50)值分别为1.98×10-9、1.77×10-10、和3.52×10-10mol·L-1,对E2的敏感程度排序为:ERβ1-GRIP1>ERβ2-GRIP1>ERα-GRIP1。研究表明,稀有鮈鲫不同ER亚型对E2的响应具有差异,3株重组荧光双杂交酵母不仅可以应用于快速识别内分泌干扰物中的类雌激素物质,分析稀有鮈鲫不同ER亚型对EEs的敏感性,解析雌激素污染物对稀有鮈鲫的作用机制,评估鱼类接触EEs的潜在风险,以期为水质保障和污染治理提供重要依据。

论文目录

  • 1 材料与方法（Materials and methods）
  •   1.1 实验仪器
  •   1.2 试剂材料
  •   1.3 稀有鮈鲫ER-LBD序列的获取
  •   1.4 靶质粒的提取纯化与鉴定
  •   1.5 构建双杂交荧光酵母
  •   1.6 荧光素酶活性的测定
  •   1.7 数据处理
  • 2 结果与讨论（Results and discussion）
  •   2.1 pGBKT7-ER-LBD诱饵质粒的鉴定
  •   2.2 稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母剂量-效应关系的建立
  •   2.3 稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母专一性的检测

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 季晓亚,杨明嘉,黄超,袁圣武,周小红,饶凯锋,马梅,王子健

    关键词: 雌激素,雌二醇,稀有鮈鲫,酵母双杂交,雌激素受体,荧光酵母,雌激素效应

    来源: 生态毒理学报 2019年05期

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 环境科学与资源利用

    单位: 中国科学院生态环境研究中心中国科学院饮用水科学与技术重点实验室,中国科学院大学资源与环境学院,清华大学环境学院环境与健康传感技术中心ESPC国家重点联合实验室

    基金: 中国科学院前沿科学重点项目(QYZDY-SSW-DQC004),自然科学基金重点项目(21437006),广东省省级科技计划项目(2016B0202),环境模拟与污染控制国家重点联合实验室联合基金项目(17L04ESPC)

    分类号: X503.225

    页码: 108-113

    总页数: 6

    文件大小: 1536K

    下载量: 71

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/262f6771d7a29697d75b8454.html