Print

构建钙荧光探针细胞用于探究胞浆和线粒体钙对ATP刺激的响应

论文摘要

目的:构建表达基因编辑钙探针（GECIs）的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24 h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时（3～6 s）升至10倍,200 s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值（4倍）的时间稍滞后（5～8 s）,并且回落更慢,300 s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •   1.2 细胞培养
  •   1.3 腺病毒感染
  •   1.4 倒置荧光显微镜下观察荧光探针表达情况
  •   1.5 钙离子荧光探针动态成像
  •   1.6 ATP刺激下细胞钙离子动态成像
  • 2 结果
  •   2.1 腺病毒感染后荧光探针在相应细胞结构中得到表达
  •   2.2 细胞外ATP刺激HeLa细胞胞浆发生瞬时钙瞬变
  •   2.3 细胞外ATP的加入刺激HeLa细胞线粒体发生瞬时钙瞬变
  •   2.4 HeLa细胞通过细胞膜上的P2X7受体对细胞外ATP刺激进行钙瞬变的响应
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 王恺,赵海鑫,李金亮,夏晴

    关键词: 基因编辑钙探针,钙稳态,钙瞬变,线粒体钙,胞浆钙

    来源: 生物技术通讯 2019年01期

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 国家生物医学分析中心

    基金: 国家科技重大专项(2016ZX08011007),国家自然科学基金面上项目(81472587)

    分类号: Q25

    页码: 93-97

    总页数: 5

    文件大小: 4162K

    下载量: 175

    相关论文文献

    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/536e7ede8d48dc323a1fc194.html