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真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN 和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建

论文摘要

目的:构建人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法:根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果:PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论:成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料与试剂
  •   1.2 引物设计及基因扩增
  •   1.3 融合质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和pGEX-6P-1-GST-PTEN的构建和鉴定
  •   1.4 真核重组质粒p CDNA3.1-Flag-PTEN转染HEK 293细胞中的表达与蛋白纯化
  •   1.5 原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN转化E.coli BL-21中表达与蛋白纯化
  •   1.6 Western blotting检测真核融合质粒表达的重组蛋白Flag-PTEN水平
  •   1.7 考马斯亮蓝染色脱色法检测原核融合质粒表达的重组蛋白GST-PTEN水平
  • 2 结果
  •   2.1 PTEN基因克隆的鉴定
  •   2.2 Western blotting检测真核融合质粒在HEK293 细胞中的表达
  •   2.3 重组蛋白GST-PTEN-C（AA350-403）的纯化和鉴定
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 柴云,于明,朱颖

    关键词: 抑癌蛋白,人第号染色体缺失的磷酸酶,真核,原核,克隆构建,重组表达

    来源: 蚌埠医学院学报 2019年11期

    年度: 2019

    分类: 医药卫生科技

    专业: 神经病学

    单位: 江苏大学附属医院神经内科

    基金: 国家自然科学基金资助项目(81601043),镇江市重点研发计划项目(SH2018037)

    分类号: R742.5

    DOI: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.11.001

    页码: 1437-1440

    总页数: 4

    文件大小: 722K

    下载量: 203

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/7431b3fb496da660d816f5a6.html