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利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF2基因的稳定敲除及其功能研究

论文摘要

背景与目的:CNC-bZIP是核转录因子E2相关因子2[nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2,NRF2]近羧基端一个亮氨酸拉链结构,该区域是DNA结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉瘤（small masculoaponeurotic fibrosarcoma,sMaf）蛋白结合形成二聚体所必需的区域,随后该区域与抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）结合,激活NRF2下游靶基因的转录表达,从而增加细胞抗氧化应激能力。构建CRISPR/Cas9慢病毒系统,获得了A549细胞中NRF2基因稳定敲除株并进行了功能研究。方法:针对该结构上下游设计一对sgRNA,与pLenti CRISPR v2载体连接,通过包装慢病毒的方式构建A549稳定敲除细胞系。根据测序图谱及蛋白质印迹法（Western blot）验证敲除效果。然后通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）、Western blot检测、克隆形成实验、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）、划痕实验、Transwell实验比较A549细胞株NRF2敲除与不敲除的功能表达。结果:显示A549肺癌细胞中NRF2基因稳定敲除株构建成功;NRF2敲除株下游靶基因m RNA表达及蛋白水平明显减少,且能明显降低A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结论:利用CRISPR/Cas9慢病毒系统获得了高效永久NRF2基因敲除的肺癌细胞系,该基因敲除后A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力都显著降低。

论文目录

  • 1 材料和方法
  •   1.1 材料
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 寡核苷酸序列合成
  •     1.2.2 质粒构建[20]
  •     1.2.3 慢病毒质粒包装[21]
  •     1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测
  •     1.2.5 RTFQ-PCR检测
  •     1.2.6 平板克隆形成实验[21]
  •     1.2.7 细胞划痕实验[21]
  •     1.2.8 细胞Transwell实验[21]
  •     1.2.9 CCK-8检测[22]
  • 2 结果
  •   2.1 重组质粒测序结果
  •   2.2 NRF2纯合子敲除细胞株
  •   2.3 NRF2基因及其下游HO-1蛋白水平
  •   2.4 NRF2及其下游靶基因mRNA表达水平
  •   2.5 NRF2敲除细胞系增殖能力
  •   2.6 NRF2敲除细胞系增殖能力
  •   2.7 NRF2敲除细胞系迁移能力
  •   2.8 NRF2敲除细胞系侵袭能力
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 龚美玲,张琳琳,郑翠侠

    关键词: 细胞系,基因,敲除

    来源: 中国癌症杂志 2019年11期

    年度: 2019

    分类: 医药卫生科技

    专业: 肿瘤学

    单位: 同济大学附属杨浦医院呼吸内科

    基金: 国家自然科学基金（8177100416）

    分类号: R734.2

    DOI: 10.19401/j.cnki.1007-3639.2019.11.003

    页码: 855-861

    总页数: 7

    文件大小: 3106K

    下载量: 353

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/7ceee892dd566f7820209c1d.html