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CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

论文摘要

目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白（MGP）基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA（gRNA）,人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293-T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qPCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）验证MGP m RNA及蛋白表达水平。q PCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP-gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调（P<0.05）。q PCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3（2.29±0.17）、Acp5（2.86±0.15）、Ctsk（2.07±0.13）的mRNA水平均显著上调（P<0.05）。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 细胞
  •     1.1.2 试剂
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 gRNA设计和寡核苷酸链合成
  •     1.2.2 gRNA表达载体构建
  •     1.2.3 包装重组慢病毒
  •     1.2.4 感染RAW264.7细胞及筛选稳定细胞株
  •     1.2.5 实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qPCR）检测MGP基因敲除效率
  •     1.2.6 蛋白质印迹法（Western Blot）检测MGP基因敲除效率
  •     1.2.7 q PCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况
  •   1.3统计学方法
  • 2 结果
  •   2.1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒的构建与鉴定
  •   2.2 MGP基因敲除效果鉴定
  •     2.2.1 MGP基因敲除效果qPCR鉴定
  •     2.2.2 MGP基因敲除效果蛋白质印迹法鉴定
  •     2.2.3 MGP基因敲除后对破骨细胞分化的影响
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 赵俐婷,王乃宁,贺芳,张燕

    关键词: 基因敲除技术,骨钙素,破骨细胞,转染

    来源: 安徽医药 2019年12期

    年度: 2019

    分类: 医药卫生科技,基础科学

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 西安交通大学第一附属医院转化医学中心,西安交通大学生命学院

    基金: 国家自然科学基金项目(81670806,81972133,81300716),中央高校基本科研业务费(xzy01201909),陕西省自然科学基础研究计划(2017JM8015)

    分类号: R329.2

    页码: 2361-2365

    总页数: 5

    文件大小: 2012K

    下载量: 183

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/88f306c711a0dad6026d4df5.html