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耐热赖氨酸氨肽酶的原核表达及特性表征

论文摘要

铜绿假单胞菌NJ-814 （Pseudomonas aeruginosa NJ-814）所产氨肽酶具有良好的热稳定性。克隆出该氨肽酶编码基因（lap）,测序得知该基因长度为1 461 bp,编码486个氨基酸。将lap与表达载体p ET-42a（+）连接构建重组基因pET-42a-lap,重组基因转化进入原核表达宿主E.coil BL21（DE3）构建重组菌BLAP,BLAP在16℃低温诱导下成功表达出重组氨肽酶。通过镍柱（Ni-NTA）亲和层析对重组酶进行分离纯化,得到电泳纯的重组酶酶液,纯化倍数和回收率分别为4.7和83.5%。考察该重组氨肽酶的酶学特性,发现该酶的最适pH为8.3,在pH 6.5～9.5之间具有较好的稳定性;最适反应温度为80℃,经过70℃热处理1 h仍能保留60%以上的酶活性;底物特异性研究表明该重组酶能够水解Arg-p NA、Leu-p NA和Lys-p NA,对Lys-p NA的水解能力分别是其他2种的6.6倍和2.4倍,通过酶动力学分析证实了该酶对赖氨酸底物具有最强的亲和力,与野生菌所产的酶一致属于一种赖氨酸氨肽酶。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 实验材料
  •     1.1.1 菌株和质粒
  •     1.1.2 主要试剂
  •     1.1.3 培养基
  •   1.2 赖氨酸氨肽酶基因的获取
  •     1.2.1 P.aeruginosa基因组的提取
  •     1.2.2 编码基因的克隆
  •   1.3 重组菌的构建与表达
  •     1.3.1 基因的连接与转化
  •     1.3.2 重组酶的诱导表达与检测
  •   1.4 重组酶的纯化与酶学性质
  •   1.5 酶活定义
  • 2 结果与讨论
  •   2.1 重组菌的构建
  •   2.2 重组酶的表达
  •   2.3 重组酶的纯化
  •   2.4 重组酶的酶学性质
  •     2.4.1 最适反应pH和pH稳定性
  •     2.4.2 最适反应温度和温度稳定性
  •     2.4.3 底物特异性、动力学分析
  • 3 结语

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 黄浩,周楠迪,田亚平

    关键词: 赖氨酸氨肽酶,热稳定性,原核表达,酶学特性

    来源: 食品与生物技术学报 2019年12期

    年度: 2019

    分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

    专业: 生物学

    单位: 江南大学生物工程学院,江南大学工业生物技术教育部重点实验室

    基金: 江苏省产学研前瞻性联合研究项目（BY2014023-22）

    分类号: Q936

    页码: 110-115

    总页数: 6

    文件大小: 1831K

    下载量: 18

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/b901e8f61b61cdbbc5bb377a.html