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基于PIPE现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价

论文摘要

分子克隆是现代生物学研究的核心技术之一,是基因工程、蛋白质工程中的重要手段。为提高分子克隆实验的操作效率,本研究设计并合成基于聚合酶引物不完全延伸（polymerase incomplete primer extension,PIPE）现象的质粒克隆位点序列。并以此为基础统一相关引物的设计方案,避免传统酶切——连接法中需针对不同载体MCS序列设计不同引物的缺点。该方案利用13 bp定长接头序列,在同一体系中使用2对引物、2种线性化模板同时扩增载体和插入片段,通过20个循环,在1次PCR过程中即合成可供转化使用的带缺口质粒产物。在NEB Q5酶系统中,利用此法将3种荧光素酶序列插入pET-15b及pET-21b（+）载体,均获得成功。且利用商品化感受态细胞（转化效率> 5×108cfu/μg）转化后所获得转化子数量均在300个以上,其中含插入片段的阳性克隆比例可达85%以上。基于本方案的设计及作用原理,可将其应用于10 kb以内载体和插入片段的快速重组。且具有通用性强、耗时少、阳性克隆得率高和成本低等优点,是传统DNA重组方法的有益补充,可作为各实验室的常规分子克隆手段之一。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 感受态细胞与转化
  •   1.2 工具酶与试剂
  •   1.3 PCR条件
  •   1.4 DNA提取、鉴定及含量测定
  •   1.5 基于PIPE现象的克隆位点序列及其对应引物设计
  •   1.6 克隆位点序列的插入
  •   1.7 基于PIPE的质粒DNA重组原理
  •   1.8 引物Tm值计算
  •   1.9 克隆形成数及阳性克隆得率计算
  •   1.1 0 统计学方法
  • 2 结果
  •   2.1 重组效率在一定范围内随模板浓度增加而提高
  •   2.2 重组效率在一定范围内随PCR循环数增加而提高
  •   2.3 基于PIPE现象的克隆位点可用于不同模板的重组
  •   2.4 PCR产物短期冻存对重组效率无显著影响
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 陈凡,喻艳莉,李奕雅

    关键词: 聚合酶引物不完全延伸,聚合酶链式反应,分子克隆,克隆位点序列

    来源: 中国生物化学与分子生物学报 2019年10期

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学

    单位: 闽南师范大学生物科学与技术学院

    基金: 福建省自然科学基金项目(No.2018J01464),漳州市科技计划项目(No.ZZ2018J18),福建省中青年教师教育科研项目(No.JAT170353,JAT170354)资助~~

    分类号: Q785

    DOI: 10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.10.16

    页码: 1166-1174

    总页数: 9

    文件大小: 382K

    下载量: 63

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    本文来源: https://www.lunwen66.cn/article/d5a8f4a79033d41eb11001b9.html